La identificación basada en péptidos de motivos funcionales y sus parejas de unión

Este vídeo presenta un conjunto de cuatro experimentos utilizados para identificar motivos funcionales de la proteína NPH del VIH y para desarrollar inhibidores basados en péptidos. Los péptidos cortos específicos derivados de los motivos que se encuentran en las proteínas de longitud completa, conservan su función biológica e inhiben competitivamente la función de la proteína de longitud completa para identificar motivos apoptóticos. En el VIH, se exponen células de gato NEF a péptidos de barrido NEF y se realiza un ensayo apoptótico en túnel para identificar los péptidos que inducen la apoptosis.

Un segundo conjunto de péptidos que contiene variaciones sobre un motivo de secreción de NEF. La región de modificación de la secreción o SMR se transfecta en las células junto con la pérdida de la función de NPH GFP debido a la inhibición competitiva indicada por la disminución de la secreción de nph. La GFP se evalúa mediante fluorometría para identificar los factores celulares que interactúan con la región de modificación de la secreción o SMR de nef.

Las precipitaciones de los cones se realizan utilizando SMR tipo salvaje NPH como cebo. Por último, para comprobar si estas interacciones afectan a la secreción, se transfectan en las células anticuerpos contra los socios de unión identificados. Para evaluar si antagonizan la secreción del motivo NF, los resultados obtenidos identifican dos motivos apoptóticos funcionales en NEF y un péptido inhibidor que antagoniza un motivo de secreción funcional de NEF, así como sus socios de unión celular necesarios para la secreción.

El objetivo general de este conjunto de cuatro experimentos es acelerar la identificación de motivos funcionales en las proteínas diana y, a continuación, utilizar esos datos para desarrollar inhibidores de bases peptídicas de estos motivos funcionales. Este conjunto de protocolos ha sido útil para nuestro grupo para ayudarnos a responder preguntas clave relacionadas con la patogénesis del VIH, como comprender el papel de la secreción impulsada por neph en la patogénesis y descifrar los mecanismos subyacentes a la capacidad de neff para manipular la vía de tráfico exosomal. Hoy demostrando los procedimientos estará el Dr. Ming Bo Huang, quien es instructor de investigación en mi laboratorio.

Comience este procedimiento con un conjunto de péptidos que escaneen la región de interés para este experimento. Se obtuvieron 20 péptidos mer con una superposición de 10 aminoácidos que abarcaba toda la proteína NPH del VIH y se obtuvieron del programa de reactivos para el SIDA. Para identificar los motivos apoptóticos de NPH, realice un ensayo de apoptosis utilizando los péptidos de barrido NEF individualmente de la siguiente manera, agregue un mililitro de medio de cultivo que contenga 10 nanogramos por mililitro de péptido por placa de 35 milímetros de jerk hat, cultivos celulares e incube cultivos durante 24 horas a 37 grados Celsius.

Después de la incubación, realice un DUTP mediado por desoxinucleótido transferasa terminal, nick de biotina y marcaje o ensayo de túnel para evaluar la apoptosis. Para hacer esto, primero lave las células con PBS, luego aspire el PBS y agregue 4%Aldehído Paraform en PBS, incube durante 30 minutos a temperatura ambiente para fijar las celdas después de fijar las celdas, lávelas con PBS y agregue Triton X 100, incube durante 10 minutos a temperatura ambiente para permanenterlas. Después de la fijación y permeabilidad de las células, agregue el reactivo de túnel e incube las células durante una hora a 37 grados centígrados después de permeables.

Enjuague las celdas dos veces con PBS. A continuación, determine el porcentaje de células teñidas por epifluorescencia en un sistema de microscopía controlado desde computador (PC). Después de seccionar células jca con NPH, plásmido GFP y diferentes variaciones del péptido SMR utilizando el kit de reactivos de administración de proteínas de carro como se describe en el documento adjunto, coseche el medio para determinar la eficiencia de la transfección mediante microscopía fluorescente.

Capture imágenes fluorescentes y de campo claro y determine el porcentaje de células. A continuación, se transfectó para evaluar la inhibición de la secreción de NPH GFP, se transfirieron 100 microlitros del medio acondicionado libre de células a pocillos individuales de una placa de microtitulación negra de 96 pocillos. Utilice un fluorímetro con una longitud de onda de excitación de 485 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 515 nanómetros para medir la fluorescencia GFP en el medio en unidades de fluorescencia relativas.

Una vez completada la lectura, transfiera los datos a una PC. Establezca el nivel de fluorescencia de GFP en el medio de control en 100%Luego compare esto con el nivel de fluorescencia de GFP en el medio de células cotransfectadas con varios péptidos SMR para determinar los cambios en la secreción de NPH GFP. La co IP para aislar a los socios de unión de motivos es un paso difícil.

Asegúrese de que las perlas se agiten correctamente durante las incubaciones y de que se elimine la mayor cantidad de líquido posible de las perlas durante cada paso de lavado. Cultive células de sombrero jerk en medio RPMI 1640 que contenga 10% de FBS a 37 grados Celsius en un matraz de cultivo de tejidos T 75 células de pellets por centrifugación a 1000 veces G durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Vuelva a suspender el pellet de la célula en un mililitro de PBS y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Girar a 1000 veces G durante un minuto. A continuación, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de lisis Anti-Flag. Tampón mediante pipeteo suave de microcentrífuga diferencial.

Las suspensiones a 2000 veces G durante cinco minutos y a 13.000 veces G durante 10 minutos. Para pelletizar, los restos celulares y el ADN recogen respectivamente el sobrenadante, en lo sucesivo denominado lisado. Después de determinar la concentración de proteína, agregue un miligramo de proteína lisada y un microgramo del tipo salvaje SMR o péptido mutante SMR a 20 microlitros de gel de afinidad Anti-Flag M dos.

Este gel de afinidad se denomina en lo sucesivo resina que lleva la mezcla a un volumen final de un mililitro en tampón co IP. Prepare también un testigo negativo en el que el lisado se combine con resina en ausencia de cualquiera de los péptidos. Incubar las mezclas a cuatro grados centígrados durante la noche con rotación de extremo a extremo.

Al día siguiente, pegue la resina por microcentrifugación a 5.000 a 8.000 veces G durante 30 segundos. Después del centrifugado, espere uno o dos minutos antes de manipular las muestras para permitir que la resina se asiente en el tubo. Retire el sobrenadante con una punta de pipeta de extremo estrecho o una jeringa Hamilton, teniendo cuidado de no transferir resina.

Lavar la resina cuatro veces por resus, suspendiéndola en 500 microlitros de tampón de lavado, seguido de una microcentrifugación. Para eluir las proteínas celulares unidas. Añadir 15 microgramos de exceso de péptido tres x bandera al tubo en 50 microlitros de tampón de lavado e incubar en un agitador basculante durante 30 minutos a temperatura ambiente después de la centrífuga de incubación a 5.000 a 8.000 veces G durante 30 segundos.

Después de dejar que los tubos se asienten durante dos minutos, recoja y guarde el sobrenadante que contiene las proteínas eludidas. Después de concentrar los EIT por precipitación de acetona, hervir las muestras en tampón de muestra laly. A continuación, separe las proteínas por página SDS en un 40 a 20%triss, gel prefabricado con criterio HCL tiñe el gel con kumasi azul brillante R two 50.

Para evaluar la inhibición de anticuerpos de células JCA transfectadas con NGFP y tubulina Antifa o anticuerpo antimortalidad utilizando el kit de reactivos de administración de proteína de carro como se describe en el documento adjunto, recoja el medio condicionado libre de células de las células recolectadas. Transfiera 100 microlitros a pocillos individuales de una placa de microtitulación negra de 96 pocillos. A continuación, mida la fluorescencia de GFP en el medio utilizando un fluorímetro con una longitud de onda de excitación de 485 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 515 nanómetros en unidades fluorescentes relativas.

Después de leer la placa, transfiera los datos a una PC y establezca el nivel de fluorescencia de GFP en el control de tubulina antigrasa al 100%Compare esto con el nivel de fluorescencia de GFP en el medio de las células transfectadas con anticuerpo antimortalidad para determinar los cambios en la secreción de NEF GFP para mapear los motivos apoptóticos del VIH un análisis de péptidos de proteínas NPH se realizó como se describe en este video. El eje Y muestra el porcentaje de células que están marcadas en túnel y el eje X denota la condición de tratamiento, como se muestra aquí, se identificaron dos regiones separadas de VIH y NEF que inducen la apoptosis. Estos están indicados por el aumento del marcaje en túnel de las células expuestas a los péptidos neph.

Los picos de apoptosis se denotan por el motivo uno y el motivo dos para evaluar la inhibición competitiva de la secreción de neph por el medio de cultivo de péptidos de tipo salvaje SMR a partir de células CAT T jerk transsectadas con un clon de NPH GFP y varios péptidos SMR se analizaron para la secreción exo omal de NPH como se muestra por la fluorescencia de GFP en el medio, los péptidos que contienen uno o más motivos de secuencia de NPH SMR de tipo salvaje inhibieron la secreción de NEF exo omal mientras que el reemplazo de alanina de cualquier aminoácido dentro de esta región redujo en gran medida la efectividad de los péptidos. Esto sugiere que el péptido de tipo salvaje SM R inhibe exo omal nph, una versión revuelta de 11 aminoácidos del motivo apoptótico de neff. Un SM, uno previamente descrito y obtenido de Sigma Genesis, se utilizó como control negativo y no tuvo ningún efecto sobre la secreción exo omal de NEP.

Esta imagen del gel de página SDS teñido con kumasi muestra la inmunoprecipitación conjunta de cuatro proteínas por el péptido de tipo salvaje SMR con tamaños de 60, 65, 75 y 250 kilodalton. El péptido mutante SMR de control negativo no capturó estas proteínas, y estas proteínas no interactuaron de forma inespecífica con la resina de afinidad. En ausencia del péptido de tipo salvaje SMR, estos resultados sugieren que las proteínas precipitadas por el cónulo estaban interactuando específicamente con los motivos SMR del péptido de tipo salvaje SMR.

El ensayo del lector de placas muestra que la transfección del anticuerpo antimortal con el plásmido de expresión neph abolió completamente la secreción exo omal de NPH. El anticuerpo no relacionado no tuvo ningún efecto sobre la secreción exo omal ne. Estos resultados sugieren que se requiere una interacción intacta del talento NM para la secreción de neph exomal.

En conclusión, después de ver este video, debería haber desarrollado una buena comprensión de cómo usar las técnicas de descripción para identificar motivos funcionales en proteínas objetivo y usar esos datos para desarrollar inhibidores de bases peptídicas de estos motivos funcionales. Al intentar el procedimiento de co IP, será fundamental recordar prestar mucha atención en la ejecución de los lavados de incubación, asegurándose de que las perlas se agiten adecuadamente durante las incubaciones y que se elimine la mayor cantidad de líquido posible de las perlas durante cada paso de lavado. Además, durante los lavados de la célula y de la resina lisada, siempre se permite que la resina se asiente después de la centrifugación.

Utilice las puntas de pipeta de extremo estrecho y realice cuatro lavados para reducir adecuadamente el fondo a niveles aceptables.