La identificación basada en péptidos de motivos funcionales y sus parejas de unión

Este vídeo presenta un conjunto de cuatro experimentos utilizados para identificar motivos funcionales de la proteína NPH del VIH-1 y para desarrollar inhibidores basados en péptidos. Péptidos cortos específicos derivados de motivos encontrados en proteínas completas conservan tanto su función biológica como inhiben competitivamente la función de la proteína completa, con el fin de identificar motivos apoptóticos. En células infectadas con VIH-1 NEF, se exponen a péptidos de escaneo de NEF y se realiza un ensayo apoptótico TUNEL para identificar péptidos que induzcan apoptosis.

Un segundo conjunto de péptidos que contiene variaciones de un motivo de secreción de NEF. La región de modificación de la secreción o SMR se transfecta en células junto con NPH, y la pérdida de función de GFP debido a la inhibición competitiva se indica mediante la disminución de la secreción de nph. La GFP se evalúa mediante fluorometría para identificar los factores celulares que interactúan con la región de modificación de la secreción o SMR de nef.

Las precipitaciones se realizan utilizando NPH de tipo salvaje SMR como cebo. Finalmente, para probar si estas interacciones afectan la secreción, se transfectan anticuerpos contra los socios de unión identificados en las células. Para evaluar si antagonizan la secreción del motivo NF, los resultados obtenidos identifican dos motivos apoptóticos funcionales en NEF y un péptido inhibidor que antagoniza un motivo funcional de secreción de NEF, así como sus socios de unión celular necesarios para la secreción.

El objetivo general de este conjunto de cuatro experimentos es acelerar la identificación de motivos funcionales en proteínas diana y luego utilizar esos datos para desarrollar inhibidores basados en péptidos de estos motivos funcionales. Este conjunto de protocolos ha sido útil para nuestro grupo al ayudarnos a responder preguntas clave relacionadas con la patogénesis del VIH, como comprender el papel de la secreción inducida por nef en la patogénesis y descifrar los mecanismos subyacentes a la capacidad de nef para manipular la vía de tráfico exosomal. Hoy, las demostraciones de los procedimientos serán realizadas por el Dr. Ming Bo Huang, quien es instructor de investigación en mi laboratorio.

Comience este procedimiento con un conjunto de péptidos que cubran la región de interés para este experimento. Se obtuvieron del programa de reactivos contra el SIDA péptidos de 20 mer con un traslape de 10 aminoácidos que abarcan toda la proteína NPH del VIH-1. Para identificar los motivos apoptóticos de NPH, realice un ensayo de apoptosis utilizando individualmente los péptidos de escaneo NEF de la siguiente manera: agregue un mililitro de medio de cultivo que contenga 10 nanogramos por mililitro de péptido por placa de cultivo de 35 milímetros con células jerk hat, e incube los cultivos durante 24 horas a 37 grados Celsius.

Tras la incubación, realice un ensayo TUNEL (transferasa de desoxinucleótidos terminal mediada por DUTP, biotina y etiquetado de extremos) para evaluar la apoptosis. Para ello, primero lave las células con PBS, aspire el PBS y añada paraformaldehído al 4 % en PBS; incube durante 30 minutos a temperatura ambiente para fijar las células. Después de fijar las células, lávelas con PBS y añada Triton X-100; incube durante 10 minutos a temperatura ambiente para permeabilizarlas. Tras la fijación y permeabilización de las células, añada el reactivo TUNEL e incube las células durante una hora a 37 grados Celsius tras la permeabilización.

Lave las células dos veces con PBS. Luego determine el porcentaje de células teñidas mediante fluorescencia epiluminiscente en un sistema de microscopía controlado por computadora. Después de transfectar células jca con el plásmido NPH, GFP y diferentes variaciones del péptido SMR utilizando el kit de reagente de entrega proteica Chariot según se describe en el documento adjunto, recoja el medio para determinar la eficiencia de transfección mediante microscopía de fluorescencia.

Capture imágenes fluorescentes y de campo brillante y determine el porcentaje de células. Transférjalas para evaluar la inhibición de la secreción de GFP-NPH, transfiera 100 microlitros del medio condicionado libre de células a pozos individuales de una placa microtituladora negra de 96 pozos. Utilice un fluorímetro con una longitud de onda de excitación de 485 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 515 nanómetros para medir la fluorescencia de GFP en el medio en unidades de fluorescencia relativa.

Una vez finalizada la lectura, transfiera los datos a una computadora. Establezca el nivel de fluorescencia de GFP en el medio de control al 100 %. Luego compare este valor con el nivel de fluorescencia de GFP en el medio de células coprofundidas con diversos péptidos SMR para determinar los cambios en la secreción de NPH GFP. La co-inmunoprecipitación para aislar los socios de unión del motivo es un paso difícil.

Asegúrese de que las perlas se agiten adecuadamente durante las incubaciones y de que se elimine la mayor cantidad posible de líquido de las perlas durante cada paso de lavado. Cultive las células jerk hat en medio RPMI 1640 que contenga 10% de FBS a 37 grados Celsius en un frasco de cultivo de tejidos T 75. Peline las células mediante centrifugación a 1000 ×g durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Re_suspenda el sedimento celular en un mililitro de PBS y transfiéralo a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros.

Centrifugar a 1000 × g durante un minuto. A continuación, resuspender el precipitado en un mililitro de tampón de lisis Anti-Flag mediante pipeteo suave en un microcentrífuga.

Las suspensiones a 2000 veces G durante cinco minutos y a 13,000 veces G durante 10 minutos. Para sedimentar los restos celulares y el ADN respectivamente, recoja el sobrenadante, denominado a partir de ahora lisado. Después de determinar la concentración de proteína, añada un miligramo de proteína de lisado y un microgramo del péptido SMR de tipo silvestre o del péptido SMR mutante a 20 microlitros de gel de afinidad Anti-Flag M dos.

Este gel de afinidad se denominará a partir de ahora resina; lleve la mezcla a un volumen final de un mililitro en tampón de co-inmunoprecipitación. Prepare también un control negativo en el que el lisado se combine con la resina en ausencia de cualquiera de los péptidos. Incube las mezclas a cuatro grados Celsius durante la noche con rotación de extremo a extremo.

Al día siguiente, pelletice la resina mediante microcentrifugación a 5.000-8.000 × g durante 30 segundos. Tras la centrifugación, espere de uno a dos minutos antes de manipular las muestras para permitir que la resina se asiente en el tubo. Retire el sobrenadante con una punta de pipeta de extremo estrecho o una jeringa Hamilton, teniendo cuidado de no transferir ninguna resina.

Lave la resina cuatro veces mediante resuspensión, suspendiéndola en 500 microlitros de tampón de lavado, seguido de microcentrifugación. Para eluir las proteínas celulares unidas, agregue 15 microgramos de péptido Flag tres veces excedente al tubo en 50 microlitros de tampón de lavado e incube en un agitador rotatorio durante 30 minutos a temperatura ambiente; tras la incubación, centrifugue a 5.000-8.000 × g durante 30 segundos.

Después de dejar reposar los tubos durante dos minutos, recolecte y guarde el sobrenadante que contiene las proteínas eluidas. Después de concentrar los EIT mediante precipitación con acetona, hierva las muestras en tampón de carga laly. Luego, separe las proteínas mediante electroforesis SDS-PAGE en un gel precolado triss, HCL criterion del 40 al 20 % y tiña el gel con azul brillante de Coomassie R 250.

Para evaluar la inhibición por anticuerpos, transfecte simultáneamente células JCA con NGFP y ya sea con anticuerpo antitubulina o anticuerpo anti mortalidad utilizando el kit de reactivo de entrega proteica Chariot según se describe en el documento adjunto, y recoja el medio condicionado libre de células a partir de las células recolectadas. Transfiera 100 microlitros a pozos individuales de una placa microtituladora negra de 96 pozos. Luego, mida la fluorescencia de GFP en el medio utilizando un fluorímetro con una longitud de onda de excitación de 485 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 515 nanómetros en unidades fluorescentes relativas.

Después de leer la placa, transfiera los datos a una PC y establezca el nivel de fluorescencia de GFP en el control de tubulina anti-grasa en un 100 %. Compare esto con el nivel de fluorescencia de GFP en el medio de células cotransfectadas con anticuerpo anti-mortalidad para determinar los cambios en la secreción de GFP NEF, con el fin de mapear los motivos apoptóticos de las proteínas NPH de VIH-1. Se realizó un análisis por escaneo de péptidos tal como se describe en este video. El eje Y muestra el porcentaje de células marcadas con TUNEL y el eje X indica la condición de tratamiento. Como se muestra aquí, se identificaron dos regiones separadas de NEF del VIH-1 que inducen apoptosis. Estas se indican mediante el aumento del marcado TUNEL en células expuestas a péptidos de NEF.

Los picos de apoptosis están indicados por el motivo uno y el motivo dos para evaluar la inhibición competitiva de la secreción de NPH por péptidos de tipo salvaje SMR. El medio de cultivo de células T CAT estimuladas, cotransfectadas con un clon GFP-NPH y diversos péptidos SMR, fue analizado para determinar la secreción exosomal de NPH, tal como se muestra por la fluorescencia GFP en el medio. Los péptidos que contenían uno o más motivos de secuencia SMR-NPH de tipo salvaje inhibieron la secreción de NPH exosomal, mientras que la sustitución por alanina de cualquier aminoácido dentro de esta región redujo en gran medida la eficacia del péptido. Esto sugiere que el péptido SMR de tipo salvaje inhibe la NPH exosomal, una versión desordenada de 11 aminoácidos del motivo apoptótico de NEF. SM uno, descrito previamente y obtenido de Sigma Genesis, se utilizó como control negativo y no tuvo ningún efecto sobre la secreción de NEP exosomal.

Esta imagen del gel SDS-PAGE teñido con kumasi muestra la coinmunoprecipitación de cuatro proteínas mediante el péptido SMR de tipo silvestre con tamaños de 60, 65, 75 y 250 kilodaltones. El péptido mutante SMR, utilizado como control negativo, no capturó estas proteínas, y estas proteínas no interactuaron de forma no específica con la resina de afinidad. En ausencia del péptido SMR de tipo silvestre, estos resultados sugieren que las proteínas co-precipitadas estaban interactuando específicamente con los motivos SMR del péptido SMR de tipo silvestre.

El ensayo con lector de placas muestra que la cotransfección del anticuerpo anti mortal con el plásmido de expresión de neph abolió completamente la secreción exógena de NPH. El anticuerpo no relacionado no tuvo ningún efecto sobre la secreción exógena de ne. Estos resultados sugieren que una interacción intacta entre NM y talent es necesaria para la secreción exógena de neph.

En conclusión, después de ver este video, usted debería haber adquirido una buena comprensión de cómo utilizar las técnicas descritas para identificar motivos funcionales en proteínas diana y de cómo usar esos datos para desarrollar inhibidores basados en péptidos de estos motivos funcionales. Al intentar el procedimiento de co-inmunoprecipitación (co-IP), será fundamental recordar prestar atención cuidadosa durante las incubaciones y los lavados, asegurándose de que las perlas se agiten adecuadamente durante las incubaciones y de que se elimine la mayor cantidad posible de líquido de las perlas en cada paso de lavado. Asimismo, durante los lavados de células y de la resina del lisado, permita siempre que la resina se sedimente tras la centrifugación.

Utilice puntas de pipeta de extremo estrecho y realice cuatro lavados para reducir adecuadamente el fondo a niveles aceptables.