El aislamiento de los microorganismos del suelo nativo con potencial para romper biodegradables Mantillo películas de plástico utilizados en la agricultura

El objetivo general del siguiente experimento es aislar los hongos y bacterias del suelo que colonizan y degradan las películas de mantillo biodegradables. Esto se logra incubando primero películas de mantillo biodegradables en bolsas de malla en el suelo el tiempo suficiente para permitir una colonización sustancial por parte de los microbios nativos del suelo. Después de la incubación, los mantillos se extraen y se diluyen, lo que produce colonias aisladas individuales de cada tipo cultivable de microbio íntimamente asociado.

Luego, los microbios aislados se parchean en superficies frescas, mantillos biodegradables infestados, así como en placas de agar con o sin una fuente de carbono. Con el fin de comparar el crecimiento, los resultados se confirman en medio líquido. Los resultados muestran colonización y/o degradación por ciertos aislados basados en microscopía electrónica de barrido y pueden ser verificados por cromatografía de permeación en gel.

No olvide que trabajar con aislados de hongos y bacterias no identificados puede ser peligroso, y siempre se deben tomar precauciones al realizar este procedimiento, como usar guantes, sellar tubos y platos de cultivo y trabajar en un gabinete de bioseguridad. Después de incubar los trozos de mantillo en el suelo y preparar los medios y reactivos de acuerdo con el protocolo de texto, corte los nuevos trozos de mantillo en cuadrados de 4,25 centímetros para descontaminar los trozos de mantillo. Esterilizarlos en autoclave si no los altera o degrada para piezas de mantillo no esterilizables en autoclave, como las hechas de plástico.

Después de preparar un gabinete de bioseguridad de acuerdo con el protocolo de texto, coloque las piezas de mantillo en la campana descontaminada en filas e incube las piezas de mantillo bajo luz ultravioleta durante dos horas, utilizando una pinza esterilizada limpia y comenzando con la fila delantera y trabajando hacia atrás para evitar colocar las manos y los brazos sobre las superficies recién descontaminadas. Voltee las piezas de mantillo, colocando el lado infestado hacia abajo en un área limpia, expuesta a la luz ultravioleta, pero no antes en contacto con el mantillo. Después de dos horas de tratamiento UV en cada lado, de nuevo, trabajando de adelante hacia atrás.

Use pinzas estériles para retirar los trozos de mantillo del gabinete de bioseguridad y colóquelos en recipientes estériles con tapa seca, como vasos de precipitados cubiertos con papel de aluminio. Guárdelos a temperatura ambiente en la oscuridad bajo una campana de transferencia estéril. Usando una técnica aséptica, coloque los trozos de mantillo infestados con rayos UV sobre la superficie de las placas de agar colocando una esquina primero y suavemente, dejando que el resto del cuadrado entre en contacto con el agar.

Para películas no permeables al agua, coloque cuatro gotas de 10 microlitros de medio semisólido fundido y mínimo sobre las esquinas de las piezas de mantillo para proporcionar una fuente de agua y nutrientes para la colonización inicial de plásticos hidrofóbicos. No toque la superficie de los trozos de mantillo. Con la punta de la pipeta, las gotas se endurecerán en perlas.

Incube las placas cubiertas en posición vertical durante la noche a temperatura ambiente para que se solidifiquen. A continuación, guarde las placas con el agar hacia arriba en la oscuridad a cuatro grados centígrados. Todos los materiales necesarios para los bioensayos ya están preparados y está listo para comenzar el aislamiento de los posibles hongos que degradan el mantillo a partir de trozos de mantillo que se han enterrado en el suelo.

Desentierra las bolsas de malla de la tierra y retira los trozos de mantillo de las bolsas de malla. Use una espátula estéril y pinzas para eliminar suavemente el exceso de tierra de los mantillos sin alterar la tierra que se adhiere a la superficie. Corte la película BDM en trozos cuadrados de un centímetro hasta que se recuperen 0,5 gramos de material.

Por cada réplica de la muestra, transfiere 0,5 gramos de trozos de mantillo y tierra adherida en 25 mililitros. Los tubos de cultivo que contienen 9,5 mililitros de PBS añaden 0,5 gramos de tierra a los tubos de control solo para el suelo o a las muestras en las que el mantillo está completamente degradado para romper las biopelículas y separar las células de los trozos de mantillo. Agite los tubos durante 30 segundos a alta velocidad, luego sonique los en un baño de agua durante 10 minutos y vuelva a vórdelos.

Esto debería producir una suspensión homogénea de las células microbianas que se asociaron con las piezas de mantillo. Para una dilución en serie de muestras. Prepare un tubo de cultivo con 4,5 mililitros de PBS estéril y llene tres pocillos de una placa de pocillo profundo con 450 microlitros de PBS por muestra de los tubos originales de suspensión.

Transfiera 0,5 mililitros a los 4,5 mililitros de PBS estéril para obtener una dilución de 5,0 por 10 a la tercera dilución negativa después de vortexear a alta velocidad durante 30 segundos, agregue 50 microlitros a 450 microlitros de PBS en la mezcla de placa de 96 pocillos pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 10 veces, repita hasta que se completen diluciones de hasta 5,0 veces 10 por menos seis. Use varillas de vidrio dobladas esterilizadas con llama para distribuir uniformemente 100 microlitros de cada una de las diluciones a través de la superficie del agar de las placas de PDA que contienen cloranfenicol para inhibir el crecimiento bacteriano. Guarde los platos en posición vertical durante 30 minutos para que el líquido se absorba.

A continuación, selle las placas con paraform para evitar que las esporas se escapen de los aislados no identificados. Incubar placas invertidas a 20 grados centígrados en la oscuridad durante cinco días para permitir que los hongos de crecimiento rápido y lento formen colonias en un gabinete de bioseguridad. Examine las placas de dilución para colonias aisladas individuales usando un solo palillo estéril.

Toque suavemente una colonia y luego toque el agar de medio mínimo fúngico, medio mínimo fúngico más plástico y placas de medio mínimo de glucosa para inocular perlas de agar sobre películas de plástico. Frota el palillo suavemente sobre la superficie del punto de agar y luego pásalo por la película de plástico. Repita la inoculación de la misma colonia de origen hasta que haya cuatro.

Replique las rayas en cada placa después de incubar las placas a 20 grados centígrados en la oscuridad durante cinco días. Compare las placas para identificar los aislados que crecen en trozos de mantillo mejor de lo que crecen en un medio mínimo que no contiene carbono agregado aparte del agar. Estos son potenciales degradadores de mantillo.

La placa GMM debe contener la mayor cantidad de crecimiento, ya que es una placa de control positivo en la que el medio contiene glucosa. Es posible que los aislados del suelo no sean completamente puros en este punto, así que use un palillo de dientes estéril para raspar el inóculo del hongo, colonizar el mantillo y rayarlo para el aislamiento en agar papa dextrosa, luego selle la placa e incube durante cinco días. Después de los cinco días de incubación, habrán surgido colonias aisladas individuales.

Confirmar que estas nuevas colonias purificadas muestran una colonización de mantillo en el bioensayo en placa similar a la observada con los aislados originales potencialmente impuros. Una vez que se han identificado los posibles degradadores de mantillo mediante el bioensayo en placa, verifique el uso de un bioensayo líquido en este ensayo confirmatorio final, incluso falta agar debajo del mantillo. Las piezas son realmente la única fuente de carbono para el crecimiento microbiano en este medio rigurosamente preparado para comenzar el ensayo en una pieza de mantillo infestado en la superficie a un medio fúngico que carece de cualquier otro carbono agregado por cada réplica de un aislado microbiano.

Prepare tres tubos para la inoculación. Uno, un tubo experimental con cinco mililitros de medio mínimo aquí etiquetado como FMM que contiene una pieza de mantillo del tamaño predeterminado. Dos, un testigo negativo con cinco mililitros de medio mínimo sin fuente de carbono.

Y tres, un control positivo con cinco mililitros de glucosa líquida. Aquí etiquetado como GMM. Además, prepare un tubo replicado de medio mínimo que contenga cada mantillo que se va a probar, pero no lo inocule.

Este tubo de control revelará cualquier crecimiento microbiano resultante de la contaminación después de cultivar y recolectar esporas frescas. De acuerdo con el protocolo de texto, en una campana de transferencia estéril inocular los tubos de cultivo previamente preparados con un millón de esporas o células de levadura, sellar las tapas e incubar en la oscuridad sin agitar a 20 grados centígrados. Observe las muestras semanalmente para ver si están creciendo.

El crecimiento micelial de hongos en las piezas de mantillo puede ser visible dentro de la primera semana después de la inoculación, especialmente en los bordes de las piezas de mantillo para la levadura planctónica Monitoree el crecimiento mediante lecturas de densidad óptica a 600 nanómetros porque es probable que los hongos filamentosos se adhieran directamente a las piezas de mantillo. Evalúe el crecimiento a ojo y confirme mediante microscopía óptica y/o microscopía electrónica de barrido en controles de medio mínimo. Busque una flexión blanca minúscula que sea demasiado pequeña para registrar un cambio en la densidad óptica.

Utilizando métodos espectrofotométricos. Utilice una pipeta de pegado para aspirar la flexión y obsérvelas mediante interferencia diferencial. Microscopía de contraste después de aislar tres aislados potencialmente degradantes de mantillo en el bioensayo de placa de un mantillo celulósico llamado weed guard plus que fue nuestro control positivo y un mantillo plástico a base de almidón llamado Biore.

Se incubaron en el bioensayo líquido durante 68 días y se cosecharon antes de someterlos a microscopía electrónica de barrido. Como era de esperar. Se observaron hilos fúngicos en todas las muestras, excepto en XX e YY, donde se observaron células en forma de bastoncillo para los aislados en nuestro mantillo de control de celulosa.

No se observó crecimiento en el FMM, solo controles, como se muestra aquí en los controles inoculados por la ONU para el protector de malezas más mantillo, los elementos residuales de la tráquea de las fibras derivadas de plantas solo fueron detectables como una ligera marca de viruela observada en las filas de algunas de las fibras, aunque se observaron hiquias fúngicas en las tres muestras inoculadas de nuestro mantillo de control de celulosa. Los elementos de la tráquea fueron claramente visibles solo en las muestras de SS, lo que sugiere que la digestión del material celulósico reveló que los elementos de tráquea lignificados debajo del aislado SS se identificaron tentativamente utilizando 18 s ribosómico, ADN como una soda dentro del orden de las sodas para el mantillo plástico a base de almidón. Los aislados no se observó un crecimiento significativo en el medio mínimo, solo controles de manchas blancas individuales visibles al arremolinarse en los tubos de cultivo de los aislados, VV y ZZ se observaron utilizando microscopía de contraste de interferencia diferencial para el aislado VV.

La especificación era una masa de esporas, presumiblemente residual de la inoculación inicial. Para aislar zz. La masa estaba compuesta por una malla suelta de hifia, de aproximadamente 0,2 milímetros de diámetro, lo que sugiere que el inóculo de esporas original había germinado pero no había crecido más allá de la masa representada aquí.

Como se ve aquí en los controles inoculados por la ONU para el mantillo plástico a base de almidón, se observa una textura irregular. La identidad de los rasgos blancos es desconocida, pero están ausentes en una película colonizada por VV aislados que se muestra aquí. Tanto las partículas blancas como las protuberancias han desaparecido en una película colonizada por zz aislado.

Además, esta última muestra mostró la aparición uniforme de fisuras a través de los aislados superficiales de BDM. VV y ZZ se identificaron tentativamente utilizando ADN ribosómico at s como Penicillium y ACE dentro del orden de hipo respectivamente. Aunque este método puede proporcionar información sobre la biodegradación de los mantillos de plástico para la industria agrícola, también se puede aplicar a cualquier otro plástico cuya biodegradación en el medio ambiente esté en duda.

Por ejemplo, plásticos que podrían acabar en el medio marino. ¿Se utilizan para la industria alimentaria? Yo.