Name: Un método para ratón islotes pancreáticos Aislamiento y cAMP intracelular Determinación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: Aprenda a aislar islotes pancreáticos de ratón para evaluar la función de las células β mediante la determinación de cAMP intracelular. Este método permite medir la producción de cAMP en respuesta a tratamientos experimentales.

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Nos gustaría agradecer a Renee L. Pasker y Harpreet K. Brar para la asistencia técnica de expertos sobre los protocolos descritos en este trabajo. Además, nos gustaría agradecer la tutoría de Christopher B. Newgard en la Universidad de Duke y Alan D. Attie en la Universidad de Wisconsin-Madison, junto con el apoyo de los miembros de su laboratorio, que nos permitió el tiempo y el apoyo necesarios para optimizar la protocolos descritos. En particular, agradecemos a Hans Hohmeier, Danhong Lu, y Helena Winfield en el Laboratorio Newgard y María Rabaglia en el Laboratorio Attie para los debates y asesoramiento de producción. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención DK080845 y Diabetes Juvenil 594 Fundación de Investigación de subvención 17-2011-608 (a MEK)

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</ol>

Los autores tienen nada que revelar.

Con el predominio de la diabetes proyectados para afectar el 7,7% de la población mundial, la obligación de aplicar técnicas de investigación novedosas es imprescindible tanto para comprender y tratar la diabetes 18. El actual aislamiento de islotes es un protocolo bien establecido utilizado para la experimentación in vitro y se ha presentado con anterioridad, con ligeras modificaciones 11,14,16. Aunque la secreción de insulina es una aplicación común aguas abajo de islotes aislados, centr...

El mantenimiento estricto de euglucemia es imperativo para prevenir la morbilidad como la neuropatía, nefropatía y retinopatía, que son todas las características de la patología de la diabetes 1 no controlada de tipo 1 y 2. Disminución de la función de las células β y la masa, tanto en la diabetes tipo 1 y 2 perturban las concentraciones de glucosa en la sangre 2. Considerando que el tipo inmunomediada 1 diabetes resulta de una devastadora pérdida de β-células productoras de insulina, la secreción de insulina de las células β alterada y la señalización de la insulina periférica en la diabetes tipo 2 en conjunto promueven la hiperglucemia, la dislipidemia y aumento de la producción hepática de glucosa, lo que finalmente se traduce en tanto la pérdida de la capacidad de la masa de células β y secretora de insulina a partir de β-células individuales 3. La comprensión de los mecanismos de las células β subyacentes en la progresión de la diabetes tipo 1 y 2 con suerte, dará lugar a nuevas terapias para prevenir y tratar estas enfermedades. En ti vitromodelos de cultivo ncidencia, como el INS-1 y MIN6 inmortalizados líneas de células β, pueden ser herramientas útiles para la comprensión de las funciones específicas de las células β. Sin embargo, las interacciones entre los diferentes tipos de células dentro de la isleta pueden ellos mismos regular la función de las células β. Por ejemplo, la influencia paracrina de glucagón (liberado de α-células) y la somatostatina (liberado de las células δ) en el aumento y la disminución de la secreción de insulina, respectivamente, demuestra la importancia de la proximidad de células de células en la respuesta endocrina 4. Por otra parte, los cruces brecha entre β-células potencian la liberación de insulina 5. Además, si bien se ha avanzado en la generación de líneas de insulinoma que mejor replican la respuesta fisiológica de los islotes aislados en glucosa (por ejemplo, el INS-1 derivado de 832/13 y 832/3 líneas celulares), su capacidad de respuesta de la glucosa aún difiere de rata normal islotes 6,7. Por otra parte, la respuesta de estas líneas celulares de insulinoma clonalesa péptido-1 (GLP-1) agonistas de tipo glucagón puede diferir drásticamente el uno del otro, así como de los islotes normales 6. Por lo tanto, las líneas de células inmortalizadas pueden no representar el mejor modelo para ensayar agentes que influyen en la producción de cAMP. En contraste con las líneas celulares de insulinoma-derivado, el estudio de la función de células β únicamente en modelos animales enteros ofrece su propio conjunto de complicaciones. Uno de los mayores retos en el trabajo con el tejido endocrino es la medición de la concentración exacta de la hormona liberada. En concreto, el hígado juega un papel importante el metabolismo de la insulina, y el flujo de sangre páncreas va directamente al hígado. Por lo tanto, una medición de la insulina en plasma no puede representar con precisión las cantidades de insulina secretada por el páncreas en sí o el impacto de diferentes tratamientos sobre la tasa de secreción de insulina 8. Además, el metabolismo renal de glucagón puede limitar la fiabilidad de la producción de glucagón de las células de los islotes α-9. Por lo tanto, el aislamiento de islotes primarios de ratón para la experimentación in vitro proporciona una comprensión más precisa de cómo el islote está respondiendo a los estímulos específicos para complementar las mediciones realizadas in vivo. El presente protocolo para el aislamiento de islotes de ratón es un protocolo bien establecido utilizado por varios grupos (con ligeras modificaciones que pueden ayudar a aumentar el éxito) 10,11. Además, la determinación de la producción de cAMP permite una lectura directa de la capacidad de respuesta de la incretina de las células β. En conjunción con la medición de AMPc, contenido de proteína y la secreción de insulina también se puede cuantificar a partir de la misma preparación de muestras de cAMP, lo que ayuda a determinar si un defecto en la función de las células β se encuentra proximal o distal a AMPc 10. El contenido de cAMP final y aplicación secreción de insulina en este protocolo puede ser una herramienta muy poderosa para la comprensión de la influencia de los componentes farmacéuticos y alimenticios, entre otross, el cAMP y la secreción de insulina. Además de la estimulación de glucosa sola, otros compuestos pueden ser utilizados para medir los cambios en el AMPc y la secreción de insulina 10,11. Por último, aunque la insulina es la principal hormona que del ensayo de islotes aislados, otras hormonas, tales como glucagón y somatostatina, así como citoquinas, eicosanoides, y monofosfato de adenosina cíclico, puede también ser medido, ya sea mediante un ensayo de estimulación transitoria o por cuantificación de sus niveles en el medio de cultivo 12. Por último, aunque fuera del alcance de este manuscrito, aislamiento de islotes con el método de aislamiento de colagenasa descrito permite la preservación de los islotes de manera que muchas otras aplicaciones posteriores pueden llevarse a cabo, tales como el trasplante de islotes, el aislamiento de ARN para cuantitativa en tiempo real PCR o análisis de microarrays, proteínas aislamiento para el Western Blot, la incrustación de los islotes y de formación de imágenes de inmunofluorescencia, y la incorporación de [3H]-timidina como una medida de la replicación de células de islotescatiónico, algunos de los cuales se han descrito en artículos anteriores JoVE 13-16. En general, siguiendo el procedimiento de aislamiento de los islotes se describe en el protocolo puede proporcionar un investigador con información útil e importante para el desarrollo de terapias y promover el descubrimiento de medicamentos destinada a mejorar la función de las células β.

<table><tbody><tr><td>Colagenasa de Clostridium histolyticum adecuada para aislar islotes activos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9378</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Solución salina equilibrada 10X</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 (polvo)</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina de suero bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7888</td><td></td></tr><tr><td>3/0 Hilo de sutura de seda</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de 0,8 mm&nbsp; &nbsp;</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras curvas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>14061-10</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml; bingen Tijeras de resorte - Recto/Afilado/8,5 cm/5 mm Filo de corte</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>5 ml BD Luer-Lok Jeringa</td><td>BD 309646</td><td></td> 1 ml Jeringa BD BD 309628 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 G Aguja BD 1/2" Longitud</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>27 g Aguja BD 1/2" Longitud</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Piedra de afilar</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>29008-01</td><td></td></tr><tr><td>2-2-2-tribromoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>2-metil-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240486-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato monopotásico (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio (NaCHO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&#183; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&#183; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal inactivado por calor (H.I. FBS)</td>fisher <td>Scientific</td><td>SH30088.03HI</td><td></td></tr><tr><td>3-isobutil-1-metilxantina (IBMX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5879-100MG</td><td></td></tr></tbody></table>

un método para ratón islotes pancreáticos aislamiento y camp intracelular determinación

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Glucemia no controlada es una característica de la diabetes mellitus y promueve morbilidades como la neuropatía, nefropatía, y retinopatía. Con la creciente prevalencia de la diabetes, tanto inmune tipo 1 y relacionada con la obesidad de tipo 2, los estudios dirigidos a la delimitación de la fisiopatología de la diabetes y los mecanismos terapéuticos son de importancia crítica. Los β-células de los islotes pancreáticos de Langerhans son responsables de la secreción de insulina apropiadamente en respuesta a concentraciones elevadas de glucosa en sangre. Además de la glucosa y otros nutrientes, las células β también son estimulados por hormonas específicas, denominado incretinas, que se secretan en el intestino en respuesta a una comida y actúan sobre los receptores de células β que aumentan la producción de monofosfato de adenosina cíclico intracelular ( AMPc). Disminución de la función de las células β, la masa y la capacidad de respuesta de la incretina son bien entendidos para contribuir a la fisiopatología de la diabetes tipo 2, y también se están cada vez más vinculados widiabetes tipo 1 ª. El presente ratón aislamiento de islotes y el protocolo de determinación de cAMP puede ser una herramienta para ayudar a delinear los mecanismos que promueven la progresión de la enfermedad y las intervenciones terapéuticas, en particular los que están mediadas por los receptores de la incretina o receptores que actúan a través de la modulación de la producción de cAMP intracelular relacionado. Si bien sólo se describirán las medidas de cAMP, el protocolo de aislamiento de islotes descrito crea una preparación limpia que permite también para muchas otras aplicaciones posteriores, incluyendo la glucosa estimula la secreción de insulina, [3 H]-timidina incorporación, la abundancia de proteínas, y la expresión del ARNm.

Para asegurar un alto rendimiento durante el aislamiento de los islotes, las técnicas quirúrgicas descritas en el protocolo deben ser seguidos de cerca. Aunque las técnicas que aquí se presentan se adaptarán a cada laboratorio, hay algunos pasos críticos que conduzcan a un aislamiento exitoso. Con el fin de hacer que el conducto biliar común de fácil acceso, se recomienda que los órganos ser desplazados hacia el lado derecho del ratón (Figura 1). Además, esto permitirá que el páncreas se infla con una c...

El ensayo in vitro función de las células β usando islotes aislados de ratones de Langerhans es un componente importante en el estudio de la fisiopatología de la diabetes y la terapéutica. Mientras que muchas aplicaciones posteriores están disponibles, este protocolo se describe específicamente la medición de intracelular de adenosina monofosfato cíclico (cAMP) como un parámetro esencial para determinar la función de las células β.

Un método para ratón islotes pancreáticos Aislamiento y cAMP intracelular Determinación

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar islotes sanos para medir las diferencias en la producción de AMP cíclico en respuesta a diversos tratamientos experimentales. Esto se logra primero inflando y luego extrayendo el páncreas en el segundo paso. Los islotes sanos se aíslan mediante una serie de centrifugaciones y lavados.A continuación, los orificios viables se seleccionan y colocan en medio fresco para el cultivo de islotes, dejando que incuben durante la noche. En la etapa final, los orificios se exponen a los tratamientos experimentales deseados y se realiza un ensayo de AMP cíclico. Finalmente, se utiliza un inmunoensayo enzimático para medir los cambios en la producción de AMP cíclico en respuesta a los diferentes tratamientos aplicados a los orificios.Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se necesita mucha práctica para lograr una inflación pancreática completa. Primero cargue una jeringa y cánula con cinco mililitros de solución de colagenasa. Coloque una aguja rompida de calibre 30 en la cánula y coloque la jeringa con cánula sobre hielo.Después de mover el intestino delgado al lado derecho del ratón, localice el esfínter

a-method-for-mouse-pancreatic-islet-isolation-intracellular-camp

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El protocolo siguiente se describe el proceso de disección del páncreas para obtener imágenes de corte virtual, y la posterior cuantificación de todas las buenas prácticas agrarias de etiquetado de las células beta en el páncreas.

En la cuantificación in situ de las células beta pancreáticas misa en ratones

Una descripción detallada de ratón aislamiento de islotes se describe utilizando la técnica de canulación en pancreático ductal in situ y la perfusión de una combinación de colagenasa purificada y proteasa neutra.

Aislamiento de ratón Islet Langerhans utilizando una combinación de colagenasa purificada y proteasa neutra

Los islotes pancreáticos, también llamados islotes de Langerhans, son un grupo de células endocrinas que producen hormonas para la regulación de la glucosa y otras funciones biológicas importantes. Este protocolo explica un método para aislar los islotes pancreáticos mediante la perfusión de colagenasa a través de la ampolla de Vater para digerir el tejido pancreático exocrino y una centrifugación en gradiente de densidad simplificada para purificar los islotes de ratones.

Aislamiento de islotes pancreáticos mediante perfusión de colagenasa: un método enzimático para aislar células de islotes pancreáticos

Presentamos aquí un protocolo para el aislamiento de islotes del modelo de ratón de diabetes tipo 2, Leprdb y detalles de un ensayo de células vivas para la medición de la secreción de insulina de islotes intactos que utiliza microscopía de 2 fotones.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modelo de ratón de la Diabetes Tipo 2: El aislamiento de los islotes pancreáticos y células en Vivo 2-Photon imágenes de islotes intactos

Este protocolo de aislamiento de islotes describió una novedosa vía de inyección de colagenasa para digerir el tejido exocrina y un procedimiento de gradiente simplificado para purificar los islotes de ratones. Implica digestión enzimática, separación/purificación de gradientes y selección manual de islos. El aislamiento exitoso puede producir entre 250 y 350 islotes de alta calidad y completamente funcionales por ratón.

Un protocolo simple de alta eficiencia para el aislamiento de islotes pancreáticos de ratones

Aquí presentamos un protocolo para aislar células de islote pancreático de ratón para la detección de las inducciones de ROS por los xenobióticos con el fin de identificar los potenciales químicos xenobióticos diabetogenic.

Una proyección basadas en células de islotes pancreáticos murinos Diabetogenic ambiental productos químicos

Se describe un método para el aislamiento de las células endocrinas del páncreas embrionarios, neonatales y postnatales seguidos por la secuencia de RNA unicelular. Este método permite el análisis del desarrollo del linaje endocrino pancreático, de células dinámicas heterogeneidad y transcriptómicos.

Análisis transcriptómico de unicelular de células endocrinas pancreáticas de ratón

Aquí, presentamos un protocolo para la toma de imágenes y la cuantificación de la dinámica de calcio en poblaciones de células heterogéneas, como las células de los islotes pancreáticos. Los reporteros fluorescentes se entregan en la capa periférica de las células dentro del islotes, que luego se inmoviliza e imagen, y se realiza un análisis por célula de la dinámica de la intensidad de la fluorescencia.

Imagen de la dinámica del calcio en subpoblaciones de células de islotes pancreáticos de ratón

Este protocolo describe el aislamiento de células endoteliales de ratón de páncreas completo.

Aislamiento de células endoteliales pancreáticas de ratón

Este estudio utiliza marcadores de muerte celular y apoptosis basados en fluorescencia de tinción múltiple combinados con microscopía confocal para evaluar la apoptosis inducida por citocinas y la muerte β celular específica en islotes pancreáticos. Revela cambios espaciales y temporales en la muerte celular y la apoptosis en respuesta a estímulos extracelulares.

Tratamiento de islotes pancreáticos aislados y medición de la apoptosis

Este estudio desarrolló un método simplificado para extraer eficientemente islotes primarios funcionales y células acinas del páncreas del ratón, ofreciendo una herramienta valiosa para estudiar la comunicación intercelular en la patogénesis de la Diabetes Inducida por Pancreatitis Aguda.

Un método sencillo y rápido para el aislamiento simultáneo de islotes primarios y células acinares pancreáticas primarias de ratones

Aprenda a aislar islotes pancreáticos de ratón para evaluar la función de las células β mediante la determinación de cAMP intracelular. Este método permite medir la producción de cAMP en respuesta a tratamientos experimentales.

Un método para ratón islotes pancreáticos Aislamiento y cAMP intracelular Determinación

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