Un método para ratón islotes pancreáticos Aislamiento y cAMP intracelular Determinación

El objetivo general de este procedimiento es aislar islotes sanos para medir las diferencias en la producción de AMP cíclico en respuesta a diversos tratamientos experimentales. Esto se logra primero inflando y luego extrayendo el páncreas en el segundo paso. Los islotes sanos se aíslan mediante una serie de centrifugaciones y lavados.

A continuación, los orificios viables se seleccionan y colocan en medio fresco para el cultivo de islotes, dejando que incuben durante la noche. En la etapa final, los orificios se exponen a los tratamientos experimentales deseados y se realiza un ensayo de AMP cíclico. Finalmente, se utiliza un inmunoensayo enzimático para medir los cambios en la producción de AMP cíclico en respuesta a los diferentes tratamientos aplicados a los orificios.

Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se necesita mucha práctica para lograr una inflación pancreática completa. Primero cargue una jeringa y cánula con cinco mililitros de solución de colagenasa. Coloque una aguja rompida de calibre 30 en la cánula y coloque la jeringa con cánula sobre hielo.

Después de mover el intestino delgado al lado derecho del ratón, localice el esfínter de Oddi, que se encuentra al final del conducto biliar común y se extiende hacia el intestino delgado, formando un triángulo blanco. Una vez localizado el esfínter, tome un par de pinzas Dumont número cinco y deslice la punta por debajo del conducto biliar común lo más cerca posible del intestino delgado, teniendo cuidado de no perforar el conducto.

Después de atravesar el intestino delgado y el tejido conectivo, use la punta de la pinza Dumont para agarrar el hilo y tirar de él por debajo del conducto biliar común. Amarre el conducto biliar común lo más cerca posible del esfínter de OD, asegurándose de que el nudo esté firme para prevenir fugas. A continuación, agarre ambos extremos del hilo y tire de ellos hacia la cola para ejercer cierta tensión sobre el conducto biliar común.

Luego, con la mano libre, realice una pequeña incisión con un par de tijeras microquirúrgicas en el conducto biliar común justo por encima de la última bifurcación hacia el hígado, manteniendo los dos extremos del hilo de modo que el conducto biliar común quede tenso. Retire la jeringa y la cánula del recipiente con hielo. Deposite la jeringa y coloque la aguja romboidal preparada de calibre 30 en el corte.

Conducto biliar común. Tenga cuidado de no perforar la pared del conducto. Obtener una inflación completa del páncreas es la parte más difícil.

Utilizamos una aguja que proporciona un buen sellado. Si la primera aguja no proporciona un buen sellado, use una más grande, como una aguja de calibre 27. Ahora presione lentamente el émbolo de la jeringa, liberando la presión de forma pulsátil hasta que se infle la primera parte del páncreas.

A continuación, aplique una presión constante y suave hasta que el páncreas ya no se infle. Una inflación exitosa presentará una distribución uniforme del tejido exocrino, y la parte del páncreas situada encima del estómago estará inflada. Para extraer el páncreas, utilice un par de pinzas en una mano para sujetar el intestino delgado en el esfínter de od.

Con la otra mano, inserte la punta cerrada de un par de tijeras curvas para separar una parte del páncreas del intestino delgado. Mueva la punta hacia abajo por el intestino delgado hasta el tejido conectivo rosado. Luego, tome el intestino delgado cerca del punto donde se une al estómago y corte el páncreas del resto del intestino delgado.

Agarre la mayor cantidad posible de páncreas y levántelo suavemente. Con las tijeras curvas, corte las conexiones restantes entre el páncreas y la cavidad torácica.

Para eliminar completamente el páncreas, coloque cada páncreas extraído en aproximadamente 2,5 mililitros de solución de colagenasa. Utilice un tubo cónico individual de 50 mililitros sobre hielo para lavar los páncreas. Primero, transfiera cada páncreas a un tubo cónico nuevo de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de colagenasa.

Luego, coloque el páncreas en tubos cónicos de 50 mililitros, en posición vertical, en un baño de agua agitado a 37 grados Celsius, capaz de oscilar entre 220 y 250 RPM con el agitador apagado. Ahora, burbujee cada tubo cónico de 50 mililitros con una mezcla de 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono durante cinco minutos.

Con una pipeta de pastoreo, tape nuevamente cada tubo firmemente y colóquelos en posición horizontal en el baño de agua con agitación, debajo de la superficie del agua. A partir del minuto seis, agite los tubos a 220-250 RPM durante 20 segundos cada dos minutos, hasta un máximo de 16 minutos. Después de la agitación, centrifugue los tubos a 400-500 Gs a temperatura ambiente, deteniendo inmediatamente la centrífuga tan pronto alcance su velocidad máxima.

A continuación, sin perturbar el precipitado, use un trampa de vacío para aspirar aproximadamente 22,5 mililitros de la solución de colagenasa de cada tubo. Luego, re suspenda los precipitados en 12,5 mililitros de HBSS y vortexee suavemente los tubos para desagregar los precipitados. Después de lavar y vortexear las células con más HBSS, vierta cada suspensión celular a través de una malla de 1000 micrones en nuevos tubos cónicos individuales de 50 mililitros.

Luego, después de centrifugar nuevamente las suspensiones celulares, utilice un sistema de vacío con trampa para aspirar cuidadosamente todo el HBSS sin perturbar el precipitado. Una vez que se haya eliminado todo el HBSS, agregue 4,8 mililitros de solución de 25 %F a cada tubo. Después de mezclar mediante vortex para desagregar el precipitado, distribuya cuidadosamente 2,4 mililitros de solución de 23 %20,5 % y 11 %fial a lo largo de la pared del tubo, rotando el tubo cónico de 50 mililitros.

Para garantizar una capa uniforme tras la centrifugación de la solución de células FI, vierta toda la solución de células FI en un tubo cónico nuevo de 50 mililitros, teniendo cuidado de dejar atrás el sedimento de tejido exocrino. Añada HBSS frío con hielo al tubo nuevo hasta la marca de 50 mililitros. Luego tape y invierta el tubo de cuatro a seis veces.

Para mezclar la llamada FI con HBSS. Utilice la trampa de vacío para aspirar cuidadosamente la mayor parte de la mezcla de HBSS sin perturbar el pellet suelto. Luego, transfiera el pellet a un tubo nuevo.

Utilice una pipeta de Pasteur para transferir los anillos a una placa de Petri que contenga el medio de cultivo para anillos, teniendo cuidado de evitar la transferencia de restos de tejido ASIN art. Coloque la placa de Petri sobre un microscopio estereoscópico con retroiluminación.

Los ojales sanos tendrán forma esférica y presentarán un centro de color marrón dorado a marrón oscuro. Cualquier ojal conectado a ASIN o tejido, que aparecerá opaco y grisáceo, no debe utilizarse y debe descartarse. Además, los ojales más grandes que desarrollen un centro necrótico oscuro tras una incubación nocturna deben descartarse, ya que no funcionan adecuadamente.

Si la preparación de los orificios contiene una gran cantidad de residuos, seleccione manualmente los orificios dos veces en medio fresco y agregue ADN al tampón de digestión para ayudar a limitar la agregación de los orificios. Comience este paso agitando suavemente los orificios hacia el centro de la placa de Petri. Utilizando una pipeta P20, transfiera los orificios a una nueva placa de Petri de poliestireno de 15 milímetros por 60 milímetros que contenga cinco mililitros de la solución de preincubación para lavar el medio de cultivo que contiene glucosa de los orificios.

Luego, utilice la pipeta P 20 para transferir al menos 13 anillos a tubos microfuga individuales que contengan un mililitro de tampón de Krebs-Ringer con bicarbonato recién gaseado, manteniendo la consistencia del tamaño de los anillos entre los tubos. Después de incubar las muestras a 37 grados Celsius y 5 %CO₂ durante 45 minutos, agite rápidamente mediante vortex y centrifugue los tubos en una centrífuga de mesa a temperatura ambiente a una velocidad de entre 7.000 y 7.500 G. Si se desea utilizar insulina u otro metabolito en una aplicación posterior, use una pipeta P 1000 para recoger una alícuota del medio en un tubo microfuga. Si no se va a recolectar el medio de estimulación, este puede descartarse.

Utilice una pipeta P 1000 para eliminar la mayor parte del Krebs en cada tubo microfuga, dejando aproximadamente de 10 a 15 microlitros de Krebs sobre el sedimento del botón. Luego, use una pipeta P 20 para eliminar la porción más cercana al sedimento. Finalmente, cuando quede menos de 10 a 15 microlitros de Krebs sobre el botón, congele rápidamente los sedimentos en nitrógeno líquido.

Luego, almacene los pelets congelados rápidamente a menos 80 grados Celsius hasta que se mida el AMP cíclico. Típicamente, el impacto de un agente sobre la producción de AMP cíclico se correlaciona directamente con su impacto sobre la secreción de insulina. En este experimento, islotes aislados de ratones silvestres o con eliminación génica fueron estimulados con glucosa 11,1 milimolar y AMP cíclico intracelular.

Se midió la producción de AMP cíclico y se normalizó respecto a la proteína celular total. La insulina secretada se midió mediante un ensayo estándar de insulina ELISA y también se normalizó respecto a la proteína celular total. Como era de esperar, el cambio en la producción de AMP cíclico se correlacionó directamente con el aumento en la secreción de insulina estimulada por glucosa Petrol.

Después de ver este video, usted debería ser capaz de aislar, cultivar y medir los niveles de AMP cíclico y GMP cíclico en ojos sanos de ratón.