Un método para ratón islotes pancreáticos Aislamiento y cAMP intracelular Determinación

El ensayo in vitro función de las células β usando islotes aislados de ratones de Langerhans es un componente importante en el estudio de la fisiopatología de la diabetes y la terapéutica. Mientras que muchas aplicaciones posteriores están disponibles, este protocolo se describe específicamente la medición de intracelular de adenosina monofosfato cíclico (cAMP) como un parámetro esencial para determinar la función de las células β.

El objetivo general de este procedimiento es aislar ojales sanos para medir las diferencias en la producción cíclica de A MP en respuesta a varios tratamientos experimentales. Esto se logra inflando primero y luego retirando el páncreas en el segundo paso. Los ojales sanos se aíslan a través de una serie de giros y lavados.

A continuación, los ojales viables se recogen en medios de cultivo de islotes frescos y se dejan incubar durante la noche. En el paso final, los ojales se exponen a los tratamientos experimentales deseados y se realiza un ensayo A MP cíclico. En última instancia, se utiliza un inmunoensayo enzimático para medir los cambios en la producción cíclica de A MP en respuesta a diferentes tratamientos aplicados a los ojales.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se necesita mucha práctica para lograr una inflación pancreática completa. Primero precargue una jeringa y una cánula con cinco mililitros de solución de colagenasa. Cargue una aguja desafilada de calibre 30 en la cánula y coloque la jeringa en la cánula sobre hielo.

Después de mover el intestino delgado hacia el lado derecho del ratón, encuentra el esfínter de od, que se encuentra al final del conducto biliar común y se extiende sobre el intestino delgado, formando un triángulo blanco. Una vez que se haya localizado el esfínter, tome un par de pinzas dumont número cinco y deslice la punta por debajo del conducto biliar común lo más cerca posible del intestino delgado. Teniendo cuidado de no perforar el conducto.

Después de perforar el intestino delgado y el tejido conectivo, use la punta de las pinzas de Dumont para agarrar la sutura y tirar de ella por debajo del conducto biliar común. Ate el conducto biliar común lo más cerca posible del esfínter de OD, asegurándose de que el nudo esté enseñado para evitar fugas. A continuación, agarre ambos extremos de la sutura y tire de ella hacia la cola para poner algo de tensión en el conducto biliar común.

Luego, con una mano libre, haga una pequeña incisión con un par de microtijeras en el conducto biliar común justo encima de la última bifurcación en el hígado sosteniendo los dos extremos del hilo con el conducto biliar común tenso. Retire la jeringa y la cánula de la cubeta de hielo. Coloque la jeringa e inserte la aguja desafilada de calibre 30 preparada en el corte.

Conducto biliar común. Teniendo cuidado de no perforar la pared del conducto. Obtener un inflado completo del páncreas es la parte más complicada.

Utilizamos una aguja que da un buen sellado. Si la primera aguja no da un buen sello, use una más grande, como una aguja de calibre 27. Ahora presione el émbolo de la jeringa, dejando que la presión se despegue lentamente de manera pulsátil hasta que la primera parte del páncreas se infle.

Siga esto con una presión suave y constante hasta que el páncreas ya no se infle. Un inflado exitoso tendrá una distribución uniforme del tejido exocrino, y la parte del páncreas en la parte superior del estómago estará inflada. Para extirpar el páncreas, use un par de pinzas en una mano para agarrar el intestino delgado en el esfínter de la pancrea.

Con la otra mano, inserte la punta cerrada de unas tijeras curvas para separar parte del páncreas del intestino delgado. Mueva la punta por el intestino delgado hasta el tejido conectivo rosado. Luego, levante el intestino delgado cerca de donde se une al estómago y corte el páncreas del resto del intestino delgado.

Agarre la mayor cantidad posible de páncreas y levántelo suavemente. Con las tijeras curvas. Corta las conexiones restantes entre el páncreas y la cavidad torácica.

Para extirpar completamente el páncreas, almacene cada páncreas extraído en aproximadamente 2,5 mililitros de solución de colagenasa. Tubos cónicos individuales de 50 mililitros sobre hielo para lavar el páncreas. Primero, transfiera cada páncreas a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de colagenasa.

A continuación, coloque el páncreas que contiene tubos cónicos de 50 mililitros. En posición vertical en un baño de agua agitado a 37 grados centígrados, capaz de oscilar de 220 a 250 RPM con el agitador apagado. Ahora gasea cada tubo cónico de 50 mililitros con un 95% de oxígeno y un 5% de dióxido de carbono durante cinco minutos.

Con una pipeta para pastos, vuelva a tapar bien cada tubo y colóquelos de lado en el baño de agua agitable debajo de la superficie del agua. A partir del minuto seis, agite los tubos a 220 a 250 RPM durante 20 segundos cada dos minutos durante un máximo de 16 minutos. Después de agitar, haga girar los tubos a 400 a 500 Gs a temperatura ambiente, apagando inmediatamente la centrífuga una vez que haya alcanzado la velocidad máxima.

A continuación, sin alterar el pellet, utilice una trampa de vacío para aspirar unos 22,5 mililitros de la solución de colagenasa de cada tubo. A continuación, vuelva a suspender los gránulos en 12,5 mililitros de HBSS y agite suavemente los tubos para romper los gránulos. Después de lavar y vórtice las celdas y más HBSS, vierta cada suspensión celular a través de una malla de 1000 micras en nuevos tubos cónicos individuales de 50 mililitros.

Luego, después de volver a girar las suspensiones de celdas, use una trampa de vacío para aspirar cuidadosamente todo el HBSS sin alterar la pellet. Una vez que se haya eliminado todo el HBSS, agregue 4.8 mililitros de solución de llamada al 25% F a cada tubo. Después de agitar el vórtice para romper el pellet, dispense cuidadosamente 2,4 mililitros de solución al 23%, 20,5% y 11% fial a lo largo del costado del tubo girando el tubo cónico de 50 mililitros.

Para asegurar una estratificación uniforme después de centrifugar la solución de llamada FI, vierta toda la llamada FI en un tubo cónico nuevo de 50 mililitros, teniendo cuidado de dejar la pelliza de tejido exocrino. Agregue HBSS helado al nuevo tubo hasta la marca de 50 mililitros. A continuación, tape e invierta el tubo de cuatro a seis veces.

Para mezclar la llamada FI y HBSS. Utilice la trampa de vacío para aspirar cuidadosamente la mayor parte de la mezcla de fibra HBSS sin alterar la paleta suelta. Luego transfiera el paladar a un nuevo tubo.

Utilice una pipeta de pasto para transferir los ojales a una placa de Petri que contenga el cultivo de ollaos. Medios teniendo cuidado de evitar la transferencia de restos de tejido artístico ASIN. Coloque la placa de Petri en un microscopio de disección con luz de fondo.

Los ojales sanos tendrán forma esférica y un centro de color marrón dorado a marrón oscuro. Los ojales conectados al ASIN o al pañuelo de papel, que aparecerán opacos y grises, no deben utilizarse y deben desecharse. Además, los ojales más grandes que desarrollan un centro necrótico oscuro después de una incubación nocturna deben descartarse, ya que no funcionan correctamente.

Si la preparación de los ojales contiene una gran cantidad de residuos, recoja los ojales a mano dos veces en medio fresco, agregue ADN al tampón de digestión para ayudar a limitar la aglomeración de los ojales. Comience este paso girando los ojales hacia el centro de la placa de Petri. Con una pipeta P 20, transfiera los ojales a una nueva placa de Petri de poliestireno de 15 milímetros por 60 milímetros que contenga cinco mililitros de la solución de preincubación para lavar el medio de cultivo que contiene glucosa de los ojales.

A continuación, utilice la pipeta P 20 para transferir al menos 13 ojales a tubos de microfuga individuales que contengan un mililitro de tampón de bicarbonato Krebs ringer recién gaseado, manteniendo la consistencia del tamaño de los ojales entre los tubos. Después de incubar las muestras a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante 45 minutos de tapón, haga girar rápidamente los tubos de fuga en una centrífuga de mesa a temperatura ambiente de hasta 7.000 a 7.500 Gs. Si se desea una aplicación posterior de insulina u otro metabolito, utilice una pipeta P 1000 para recoger una alícuota de medio en un tubo de microfuga. Si no se recolectan medios de estimulación, se pueden desechar.

Utilice una pipeta P 1000 para eliminar la mayor parte de los Krebs de cada tubo de microfuga, dejando aproximadamente de 10 a 15 microlitros de Krebs en el pellet del ojal. A continuación, utilice una pipeta P 20 para eliminar la parte más cercana al pellet. Finalmente, una vez que queden menos de 10 a 15 microlitros de crebs en el broche de ojales, congele las paletas de ojales en nitrógeno líquido.

A continuación, almacene los gránulos congelados a menos 80 grados centígrados hasta que se mida el MP A cíclico. Típicamente, el impacto de un agente en la producción cíclica de MP se correlaciona directamente con su impacto en la secreción de insulina. En este experimento, los ojales aislados de ratones Wildtype o gene knockout fueron estimulados con glucosa 11,1 milimolar y cíclica intracelular.

Se midió la producción de MP y se normalizó a la proteína celular total. La insulina secretada se midió utilizando una insulina estándar, Eliza, y también se normalizó a proteína celular total. Como era de esperar, el cambio en la producción cíclica de A MP se correlacionó directamente con el aumento de la secreción de insulina estimulada por la glucosa.

Después de ver este vídeo, debería ser capaz de aislar el cultivo y medir los niveles cíclicos de a y p en ojales de ratón sanos.