Diseño de un Carga mecánica Biaxial biorreactor para Ingeniería de Tejidos

El objetivo general del siguiente experimento es fabricar biocompuestos funcionales de tejidos diseñados para trasplante. Esto se logra aplicando una tensión mecánica uniaxial o biaxial precisa para proporcionar estímulos biofísicos a las células en compuestos tridimensionales de biomateriales. Como segundo paso, el biorreactor se equipa con una celda de carga, que proporciona retroalimentación de fuerza y pruebas mecánicas de los biocompuestos durante la carga.

A continuación, los biocompuestos se cultivan durante un período de semanas para inducir cambios a escala macroscópica en el contenido bioquímico y la resistencia del constructo; los resultados obtenidos muestran el efecto de diferentes tipos de carga basado en las diferencias significativas en el contenido de glucosaminoglicanos y colágeno, andamiaje, espesor y módulo de equilibrio. Aunque este método puede proporcionar información sobre los efectos de la carga biaxial en el tejido cartilaginoso ingenierizado, también puede aplicarse a otros tejidos de bajo soporte, como hueso y tendón, demostrando que el procedimiento lo realizarán Amy May y Rob Stefani de nuestro laboratorio. Para comenzar este procedimiento, configure un biorreactor biaxial como se muestra aquí.

La base del biorreactor está compuesta por una placa de aluminio que mide 25 centímetros por 30 centímetros por 12,5 milímetros. Las opciones variables de posicionamiento permiten la montura flexible de placas de cultivo celular de diferentes formas y tamaños. A continuación, asegúrese de que las etapas estén montadas sobre la base de manera que la etapa horizontal proporcione cizallamiento dinámico al oscilar únicamente a lo largo del eje x.

Y la etapa vertical proporciona compresión dinámica oscilando únicamente a lo largo del eje Z. El siguiente paso es fabricar una placa de carga personalizada de polisulfona. El material de polisulfona es ideal debido a su biocompatibilidad, facilidad de mecanizado y facilidad de esterilización.

Cuple la placa a la plataforma móvil biaxial mediante un soporte en ángulo recto mecanizado con precisión. Los topes cinemáticos fijados a la placa base poseen tornillos de ajuste fino que permiten una alineación precisa de las placas de cultivo, imposible de lograr manualmente. A continuación, fije el actuador del motor paso a paso a cada plataforma, el cual proporcionará retroalimentación de posición al software.

Los actuadores de motor paso a paso mostrados aquí tienen una repetibilidad bidireccional de 0,1 micrómetros y una resolución de 20 nanómetros, lo que se traduce en una precisión inferior a tres micrómetros durante un recorrido de 50 milímetros. Controle los movimientos de las etapas mediante el software de tecnología avanzada de posicionamiento de Thor Lab. El software controla el motor paso a paso para ajustar de forma independiente y simultánea los parámetros de carga de frecuencia y amplitud, tanto de cizallamiento como de compresión. A continuación, coloque una célula de carga miniatura de cinco libras entre el platino de carga y la plataforma móvil para proporcionar la retroalimentación de fuerza necesaria para detectar el contacto entre el platino y los constructos, así como para evaluar las respuestas a la carga.

Asegúrese de que la celda de carga tenga una alta precisión de 0,15 % a 0,25 % de la escala completa y de que la unidad de visualización para la celda de carga tenga un puerto RS 232 para permitir la recopilación de datos en una computadora. Con el fin de inmovilizar las muestras dentro de los pocillos de una placa de 24 pocillos, prepare un molde para un gel de aros de 1,5 milímetros de espesor utilizando un sistema de moldeo de geles con espaciadores de 1,5 milímetros. Una vez ensamblado, vierta una solución de aros al 4 % entre las dos placas de vidrio y deje que la mezcla se enfríe.

Luego retire la placa superior y corte un disco de 16 milímetros de diámetro a partir de la placa de agar. Para cada pozo de cada disco, haga un orificio donde se colocará la muestra. Coloque los discos terminados en los pozos de una placa de 24 pozos.

Luego, presione constructos de tejido de 2,25 milímetros de grosor y 5 milímetros de diámetro en cada uno de los soportes de gel. La muestra debe sobresalir por la parte superior de cada soporte de aeros. A continuación, agregue 1,5 mililitros de medio de cultivo a cada pocillo y reemplace la tapa.

Luego, coloque la placa nuevamente en el incubador hasta el momento de la carga de la muestra. Para iniciar la carga mecánica de los constructos de tejido, asegure la placa de aluminio al transductor de fuerza y sujete un ensamblaje de platino estéril a la etapa vertical en todo momento. El incubador debe funcionar en condiciones de baja humedad para prevenir fallas del instrumento.

A continuación, encienda el controlador del motor paso a paso y la computadora. Abra el programa de usuario de tecnología de posicionamiento avanzado y vaya a la pestaña de control gráfico en ambas pantallas. Presione el botón de cero de origen para enviar ambos motores paso a paso a la posición cero, definida como la posición superior y más a la derecha.

Prepare las muestras para la carga retirando algo de medio de cada pocillo para evitar desbordamientos durante la carga mecánica. A continuación, coloque la placa de 24 pocillos en el biorreactor y alinee cuidadosamente la placa con el platino utilizando cuatro localizadores cinemáticos ajustables; asegúrese de alinear correctamente la placa. Alinee hasta quedar al ras con el frente de la base del biorreactor en la pestaña de control gráfico.

Ajuste manualmente con precisión. Afinar la alineación haciendo clic en el cuadro de posición para moverlo horizontalmente. Cuando la placa esté alineada con los pozos de la placa, comience a bajarla hasta que haga contacto por primera vez con las muestras.

Una vez alcanzada la posición inicial, vaya a la pestaña del secuenciador de movimientos y cargue la secuencia deseada presionando cargar o cree su propio programa según se describe en el protocolo escrito que acompaña a este video. A continuación, presione ejecutar para iniciar el programa. El software dirigirá los motores para aplicar el régimen de acondicionamiento deseado a las muestras.

Cuando el programa haya finalizado, eleve manualmente la placa para que sobrepase la parte superior de la placa de cultivo celular. Luego, retire la placa de 24 ruedas del biorreactor y reemplace el medio. Finalmente, retire cuidadosamente el platino de la celda de carga y apague los instrumentos.

El uso del biorreactor biaxial descrito en este video tuvo un efecto significativo en la cantidad de glucosaminoglicanos y colágeno secretados por las células dentro de los constructos de ingeniería tisular. El acondicionamiento se llevó a cabo cinco días por semana durante tres horas diarias, con una deformación por compresión del 10 % y una deformación por cizallamiento del 5 % a un hertzio. Después de 30 días en cultivo, la cantidad de glucosaminoglicanos y colágeno secretados por los condrocitos expuestos a la carga mecánica fue significativamente mayor que en las muestras de control. La carga uniaxial solo aumentó significativamente la cantidad de glucosaminoglicanos.

Además, la carga biaxial generó construccos más gruesos, pero no mostró efecto sobre la elasticidad de los construccos. Utilizando este protocolo de dosificación, tras 30 días de acondicionamiento y cultivo, se tiñeron secciones transversales de los construccos de tejido con marcadores típicos del cartílago, incluyendo azul de safranina O y colágeno tipo II. Los tres grupos diferentes incluyen sin acondicionamiento, carga uniaxial y carga biaxial.

Aunque todos los grupos muestran tinción positiva para Azul de aluminio y Safranina O, las muestras cargadas con bixi muestran mayores cantidades de colágeno tipo II en comparación con las muestras sin carga y las cargadas uniaxialmente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aplicar cargas uniaxiales o biaxiales sobre construcciones de tejidos ingenierizados en desarrollo.