Diseño de un Carga mecánica Biaxial biorreactor para Ingeniería de Tejidos

El objetivo general del siguiente experimento es fabricar biocompuestos de ingeniería tisular funcional para trasplantes. Esto se logra mediante la aplicación de una deformación mecánica uniaxial o bioaxial precisa para proporcionar estímulos biofísicos a las células en compuestos de biomateriales tridimensionales. Como segundo paso, el biorreactor está equipado con una célula de carga, que proporciona retroalimentación de fuerza y pruebas mecánicas de los biocompuestos durante la carga.

A continuación, se cultivan biocomposites durante un período de semanas con el fin de inducir cambios a macroescala en el contenido bioquímico de constructo y se obtienen resultados que muestran el efecto de diferentes tipos de carga en función de las diferencias significativas en el contenido de glicosaminoglicanos y colágeno, andamio, espesor y módulo de equilibrio. Aunque este método puede proporcionar información sobre los efectos de la carga biaxial en el tejido cartilaginoso diseñado, también se puede aplicar a otros tejidos de baja portación, como el hueso y el tendón, lo que demuestra que el procedimiento estará a cargo de Amy May y Rob Stefani de nuestro laboratorio. Para comenzar este procedimiento, configure un biorreactor bioaxial como se muestra aquí.

La base del biorreactor está compuesta por una placa de aluminio que mide 25 centímetros por 30 centímetros por 12,5 milímetros. Las opciones de posicionamiento variable disponibles permiten un montaje flexible de placas de cultivo de tejidos de diferentes formas y tamaños. A continuación, asegúrese de que las etapas estén montadas en la base de modo que la etapa horizontal proporcione un cizallamiento dinámico oscilando solo a lo largo del eje x.

Y la etapa vertical proporciona compresión dinámica al oscilar solo a lo largo del eje Z. El siguiente paso es fabricar una placa de carga de polisulfona personalizada. El material de polisulfona es ideal por su biocompatibilidad, facilidad de mecanizado y facilidad de esterilización.

Acople la placa, la plataforma móvil biaxial a través de un soporte de ángulo recto mecanizado con precisión. Los topes cinemáticos unidos a la placa base tienen tornillos de ajuste fino para permitir una alineación precisa de las placas de cultivo que no se pueden lograr a mano. A continuación, conecte el actuador del motor paso a paso a cada plataforma, que adquirirá retroalimentación de posición para el software.

Los actuadores de motor paso a paso que se muestran aquí tienen una repetibilidad bidireccional de 0,1 micrómetros y una resolución de 20 nanómetros, lo que se traduce en una precisión de menos de tres micrómetros. Más de 50 milímetros de recorrido controlan los movimientos de las etapas utilizando el software de tecnología de posicionamiento avanzado de Thor Lab. El software controla el motor paso a paso para ajustar los parámetros de carga de frecuencia y amplitud tanto de la velocidad como de la compresión de forma independiente y simultánea. A continuación, coloque una celda de carga en miniatura de cinco libras entre el platino de carga y la plataforma móvil para proporcionar la retroalimentación de fuerza necesaria para detectar el contacto entre el platino y las construcciones, así como para evaluar las respuestas de carga.

Asegúrese de que la célula de carga tenga altas precisiones de 0,15 % a 0,25 % de escala completa, y que la unidad de visualización de la célula de carga tenga un puerto RS 2 32 para permitir la recopilación de datos en una computadora. Para inmovilizar las muestras dentro de los pocillos de una placa de 24 pocillos, prepare un molde para un gel aros de 1,5 milímetros de espesor utilizando un sistema de fundición en gel con espaciadores de 1,5 milímetros. Una vez ensamblado, vierta una solución de 4%aros entre las dos placas de vidrio y deje que la mezcla se enfríe.

A continuación, retire la placa superior y perfore un disco de 16 milímetros de diámetro de la losa agrícola. Para cada muestra de pocillo en cada disco, perfore un agujero para colocar la muestra. Coloque los discos completos en los pocillos de una placa de 24 pocillos.

A continuación, presione construcciones de tejido de 2,25 milímetros de grosor y cinco milímetros de diámetro en cada uno de los soportes de gel. La muestra debe sobresalir de la parte superior de cada soporte aerodinámico. A continuación, agregue 1,5 mililitros de medio de cultivo a cada pocillo y vuelva a colocar la tapa.

A continuación, vuelva a colocar la placa en la incubadora hasta que llegue el momento de cargar la muestra. Para comenzar la carga mecánica de las construcciones de tejido, asegure la placa de aluminio a la celda de carga y fije un conjunto de platino estéril a la etapa vertical en todo momento. La incubadora debe funcionar en condiciones de baja humedad para evitar fallas en los instrumentos.

A continuación, encienda el controlador del motor paso a paso y la PC. Abra el programa de usuario de tecnología de posicionamiento avanzada y vaya a la pestaña de control gráfico en ambas pantallas. Presione el botón de inicio a cero para enviar ambos motores paso a paso a la posición cero, que se define como la posición superior y más a la derecha.

Prepare las muestras para la carga retirando algunos medios de cada pocillo para evitar el desbordamiento durante la carga mecánica. A continuación, coloque la placa de 24 pocillos en el biorreactor y alinee cuidadosamente la placa con el platino utilizando cuatro localizadores cinemáticos ajustables, asegúrese de alinear la placa. Enrasado con la parte frontal de la base del biorreactor en la pestaña de control gráfico.

Multa manual. Ajusta la alineación haciendo clic en el cuadro de posición para moverlo horizontalmente. Cuando la placa esté alineada con los pocillos de la placa, comience a bajar la placa hasta que primero haga contacto con las muestras.

Una vez alcanzada la posición inicial, vaya a la pestaña del secuenciador de movimientos y cargue la secuencia de movimientos deseada pulsando cargar o cree su propio programa como se describe en el protocolo de texto que acompaña a este vídeo. A continuación, presione ejecutar para comenzar el programa. El software dirigirá los motores para aplicar el régimen de acondicionamiento deseado a las muestras.

Cuando el programa haya finalizado, levante manualmente la placa para que quede despejada de la parte superior de la placa de cultivo de tejidos. A continuación, retire la placa de 24 ruedas del biorreactor y sustituya el medio. Finalmente, retire con cuidado el platino de la celda de carga y luego apague los instrumentos.

El uso del biorreactor biaxial descrito en este video tuvo un efecto significativo en la cantidad de glicosaminoglicanos y colágeno secretados por las células dentro de las construcciones de ingeniería tisular. El acondicionamiento se llevó a cabo cinco días a la semana durante tres horas al día con una deformación de compresión del 10% y una deformación de cizallamiento del 5% a un hercio. Después de 30 días en cultivo, la cantidad de glicoamina, glicanos y colágeno secretados por los condrocitos expuestos a la carga, fue significativamente mayor que la de las muestras control

Además, la carga biaxial creó construcciones más gruesas, pero no mostró ningún efecto sobre la elasticidad de las construcciones. Utilizando este protocolo de dosificación, después de 30 días de acondicionamiento y cultivo, se tiñeron secciones transversales de las construcciones de tejido con marcadores típicos de cartílago, incluido el azafrán azul y el colágeno tipo o y tipo dos. Los tres grupos diferentes incluyen sin acondicionamiento, carga uniaxial y carga biaxial.

Si bien todos los grupos muestran tinción positiva para azul de alio y azafrán y O, las muestras cargadas con bixi muestran mayores cantidades de colágeno tipo dos en comparación con las muestras sin carga y con carga uniaxial. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aplicar cargas uniaxiales o biaxiales en el desarrollo de construcciones de ingeniería de tejidos.