El aislamiento, tratamiento y análisis de células gingivales murinos

El objetivo general de este procedimiento es aislar y procesar con precisión la encía murina para un posterior análisis mediante citometría de flujo. Esto se logra primero mediante el aislamiento quirúrgico de la encía de manera meticulosa. A continuación, el tejido extirpado se procesa para generar una suspensión de células individuales.

Luego se realiza la tinción extracelular e intracelular con anticuerpos. Finalmente, la muestra se analiza mediante citometría de flujo. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran diferentes poblaciones celulares en la encía y los cambios celulares que ocurren en el tejido tras la exposición a un agente agresor inmunológico mediante análisis de citometría de flujo.

La principal ventaja de esta técnica, en comparación con métodos como la química en OC o la fluorescencia monocromática, es que constituye un método rápido y sencillo para analizar un gran número de células, permitiendo el análisis simultáneo de varias variables, así como la separación de diversos tipos celulares para experimentos posteriores. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como cómo los microorganismos influyen en la homeostasis gingival y cómo esto se relaciona con la pérdida ósea inducida por inflamación en un modelo experimental de periodontitis. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando comenzamos a abordar el papel de las células RI durante la periodontitis. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la técnica de aceleración GVA es difícil de aprender debido al pequeño tamaño y al acceso relativamente incómodo al MU uno J gva.

Para comenzar, prepare las soluciones de medio e instrumentos quirúrgicos esterilizados según el protocolo descrito en el texto. Después de sacrificar un ratón según los métodos aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales, use tijeras rectas finas y romas para cortar por ambos lados de la cavidad oral, incluyendo las mejillas y el ramo mandibular, y baje la mandíbula dirigiendo las tijeras estándar perpendicularmente al plano del hueso palatino. Corte los tejidos blandos y duros siguiendo una línea imaginaria, un milímetro por detrás de los terceros molares.

A continuación, realice una incisión en los tejidos blando y duro, dos milímetros por detrás de los incisivos. Luego, tire hacia abajo de la parte anterior de la boca para exponer la cavidad nasal con las tijeras paralelas al paladar. Introduzca una punta de las tijeras en la cavidad nasal y use la otra para hacer una incisión en el vestíbulo, cortando hasta la incisión posterior.

Repita la incisión en el otro lado del maxilar para separarlo del cráneo. Luego, córtelo por la mitad y recorte el tejido palatino de cada hemimaxilar para acceder al hueso alveolar utilizando pinzas y fórceps. Separe los tejidos gingivales del borde anterior y colóquelos en una placa con PBS y 2 % de suero bovino fetal o FCS para procesar la encía; transfiérala a una placa de cultivo con un mililitro de PBS, dos miligramos por mililitro de colagenasa tipo dos y un miligramo por mililitro de ADNasa.

Seccione con una hoja quirúrgica estéril número 15. Pique bien el tejido antes de transferirlo a un tubo cónico de prueba de 15 mililitros. Lave cualquier célula tisular restante de la placa con un mililitro de P-B-S-F-C-S y transfiera el lavado al tubo.

Incube el tejido en un incubador agitador precalentado a 37 grados Celsius y 200 RPM durante 20 minutos. Luego, agregue 20 microlitros de EDTA 0,5 molar y incube durante otros 10 minutos. A continuación, agregue P-B-S-F-C-S hasta 12 mililitros y centrifugue la muestra a cuatro grados Celsius, 400 veces G durante ocho minutos.

Después de eliminar el sobrenadante, suspenda las células en dos mililitros de P-B-S-F-C-S. Filtre la muestra a través de un filtro celular de 70 micrones después de centrifugar el flujo pasante a cuatro grados Celsius y 320 veces G durante cinco minutos. Resuspenda las células en 300 microlitros de P-B-S-F-C-S.

Finalmente, cuente las células trabajando bajo una campana con una temperatura fría y las luces apagadas; en un volumen total de 100 microlitros, agregue de 0,2 a 0,5 microgramos de cada anticuerpo seleccionado por uno por diez a la sexta células y mezcle brevemente mediante vórtex. Tras incubar las muestras a cuatro grados Celsius durante 15 minutos en la oscuridad, agregue dos mililitros de P-B-S-F-C-S y centrifugue a 320 veces G y cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Para fijar las células, aspire el sobrenadante y luego, mientras agita por vórtex, resuspenda las células agregando gota a gota 500 microlitros de BD cyto perms frío.

Los efectos citoplasmáticos requieren incubar los tubos a cuatro grados Celsius en la oscuridad durante 40 minutos tras la incubación con vortex. A continuación, añada brevemente un mililitro de tampón de permeabilización BD, mezcle y centrifugue a 800 ×g a cuatro grados Celsius durante siete minutos. Tras repetir el lavado, aspire todo excepto 300 microlitros del tampón de lavado.

Luego, para teñir las células intracelularmente en un volumen total de 100 microlitros, añada un microgramo de cada anticuerpo seleccionado por un millón de células (1 × 10⁶ células). Agite brevemente mediante vortex e incube en la oscuridad durante 30 minutos. Después de lavar las células dos veces como antes y eliminar todo el sobrenadante, resuspenda las células en 300 microlitros de tampón de permeabilización BD frío y fresco.

Tras un breve vortex, filtre la suspensión en tubos para fax. Mantenga los tubos en hielo o en el refrigerador en la oscuridad hasta que esté listo para realizar el análisis de fax. Células gingivales agrupadas de dos ratones naïve.

Se realizaron en un citómetro de flujo LSR II y se analizaron mediante el software FlowJo. Los gráficos de dispersión lateral y dispersión frontal mostrados aquí demuestran la distribución de las células. La estrategia de selección para identificar linfocitos, monocitos, células dendríticas y granulocitos se indica con fines comparativos.

Esta figura representa un gráfico de citometría que ilustra células gingivales purificadas de ratones infectados con P gingivalis 21 días después de la administración oral por sonda, en el contexto de periodontitis experimental. Un aumento en las diversas poblaciones de células inmunitarias puede detectarse fácilmente en los ratones infectados en comparación con los ratones no infectados mostrados aquí. Las células inmunitarias en la encía procesada se identifican mediante el aislamiento de células que expresan el marcador hematopoyético CD 45.

Estas células se segregaron además en linfocitos T CD3 positivos mostrados en esta figura. Los neutrófilos también se identificaron según la expresión de las moléculas LY6G y CD11B. Finalmente, las células de Langerhans y el subconjunto epitelial de células dendríticas se identificaron mediante el aislamiento de células MHC clase II positivas y CD11C positivas, así como por la expresión de EPAM y RINCD207. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse entre tres horas y media y cinco horas si se realiza adecuadamente siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos como la PCR en tiempo real para responder preguntas adicionales, como la expresión génica en una sola célula, tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología exploraran la respuesta local en la GVA gingival frente a cualquier agresión en el campo de la investigación periodontal. Esta técnica nos permitió elucidar el papel de las células inmunitarias y no inmunitarias de la GVA gingival en la patogénesis de la periodontitis experimental.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y procesar el GVA urinario para obtener una suspensión de células individuales, la cual se someterá posteriormente a una tinción viral extracelular e intracelular para análisis por citometría de flujo.