Name: El aislamiento, tratamiento y análisis de células gingivales murinos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprende a aislar y procesar tejido gingival murino para obtener suspensiones celulares únicas. Este método permite el análisis de poblaciones celulares mediante citometría de flujo en estudios de inmunología oral.

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Esta investigación fue apoyada por subvenciones de la Israel Science Foundation (No. 1418-1411) para AHH y (N º 1933/12) a AW, la Fundación Alemana de Israel para que los investigadores jóvenes (GIF joven) de AHH, y el Dr. I . Cabakoff Investigación Fondo de Dotación de la Escuela Hadassah de la Universidad de Medicina Dental de AHH y AW hebreo.

Preparar de antemano: <ul><li> PBS + 2% de FCS </li><li> PBS + 2% de FCS con 2 mg / ml de colagenasa tipo II y 1 mg / ml de DNasa tipo I (1 ml por muestra) </li><li> Instrumentos quirúrgicos esterilizados </li><li> Solución de EDTA 0,5 M </li></ul> 1. Técnica de escisión gingival superior <ol><li> La eutanasia a los ratones con orientación IACUC aprobado. </li><li> Corte ambos lados de la cavidad oral, incluyendo las mejillas y la línea de la mandíbula con rectas / romas tijeras rectas. </li><li> Tire hacia abajo la mandíbula. </li><li> Cortar los tejidos blandos y duros en una línea imaginaria 1 mm por detrás de los molares tercios con unas tijeras estándar. Dirigir las tijeras perpendiculares al plano del hueso palatino (Figura 2A, las líneas azules). </li><li> Una incisión en los tejidos blandos y duros 2 mm por detrás de los incisivos (Figura 2A, las líneas azules). </li><li> Tire hacia abajo la parte anterior de la boca. La cavidad nasal es observable después de este paso. </li><li> Coloque las tijerasparalelo al paladar, puso una hoja en la cavidad nasal, la otra cuchilla debe incidir en el vestíbulo. Corte hasta que la incisión posterior (Figura 2A, línea verde). Repita este paso en ambos lados del maxilar. Al final del maxilar superior se separa del resto del cráneo (Figura 2B). </li><li> Retire el maxilar, se corta en la sutura media (Figura 2, línea de trazos negro) y recortar el tejido palatino de cada hemi-maxilar hasta alcanzar el hueso alveolar. </li><li> Pelar los tejidos gingivales (ambos hemi-maxilares) a partir de su borde anterior con Adson fórceps (sin dientes). </li><li> Coloque la encía extirpado en una placa con PBS + 2% FCS. </li></ol> 2. Gingival Procesamiento <ol><li> Ponga la encía extirpado en una placa de cultivo de tejido (35 x 10 mm) con 1 ml de PBS + 2% de FCS, 2 mg / ml de colagenasa tipo II y 1 mg / ml de DNAsa I. Tipo </li><li> Picar bien el tejido con una cuchilla de 15 ° N quirúrgico estéril. </li><li> Transfer el tejido de la placa a un ml tubo de ensayo cónico de 15. </li><li> Lavar las células de los tejidos / restantes en la placa con 1 ml de PBS + 2% de FCS y la transferencia al mismo tubo de ensayo. </li><li> Incubar en un agitador incubador durante 20 min a 37 ° C, 200 rpm (recomendación: precalentar el incubador). </li><li> Añadir 20 l de EDTA 0,5 M y se incuba durante otros 10 min a 37 ° C, 200 rpm. </li><li> Llenar el tubo de ensayo hasta 12 ml con PBS + 2% de FCS y se centrifuga a 4 ° C, 400 xg durante 8 min (recomendación: pre-enfriamiento de la centrífuga). </li><li> Retire las células sobrenadante y resuspender con 2 ml de PBS + 2% de FCS. </li><li> Filtrar la muestra con una célula de 70 micras-colador y guardar el flujo a través. </li><li> Se centrifuga a 4 ° C, 320 xg durante 5 min. </li><li> Eliminar las células sobrenadante y resuspender con 300 l de PBS + 2% FCS. </li><li> Contar las células (células de aproximadamente 5-10 x 10 5 Se espera que a partir de un solo maxilar). </li></ol> 3. Anticuerpo extracelulares e intracelularesLa tinción para el Análisis de Citometría de Flujo Se recomienda para trabajar dentro de una campana, con las luces apagadas. Es crítico para mantener las células en ambiente frío constante, así como todos los materiales necesarios. <ol><li> Mancha de las células contra moléculas extracelulares mediante la adición de 0,2-0,5 g de cada anticuerpo seleccionado por 1 x 10 6 células en un volumen total de 100 l. </li><li> Brevemente Vortex. </li><li> Incubar los tubos durante 15 minutos en la oscuridad a 4 ° C. </li><li> Lavar las células con 2 ml de PBS + 2% FCS. </li><li> Se centrifuga a 4 ° C, 320 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender las células añadiendo, gota a gota, 500 l BD frío Cytoperm / Cytofix mientras vórtice. </li><li> Incubar los tubos durante 40 min a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> Brevemente Vortex. </li><li> Lavar las células dos veces con 1 ml frío BD Perm / Tampón de lavado y centrifugado a 800 g durante 7 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar el sobrenadante con excepción de 300 l. </li><li> Mancha de células intracelularmente porla adición de 1 g de cada anticuerpo seleccionado por 1 x 10 6 células en un volumen total de 100 l. </li><li> Brevemente Vortex. </li><li> Incubar durante 30 minutos en la oscuridad a 4 ° C. </li><li> Lavar las células dos veces con 1 ml frío BD Perm / Tampón de lavado y centrifugado a 800 g durante 7 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender las células añadiendo 300 l BD Perm / Wash Buffer frío. </li><li> Brevemente Vortex. </li><li> Transferir la suspensión mientras se filtra a tubos de FACS. </li><li> Mantener los tubos en un lugar oscuro y frío hasta su análisis. </li></ol>

<ol><li>Arizon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+cells+down-regulate+inflammation-driven+alveolar+bone+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).</li>
<li>Listgarten, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of periodontitis.</a> J. Clin. Periodontol. 13, 418-430 (1986).</li>
<li>Kinane, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causation+and+pathogenesis+of+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontol%22%5BJournal%5D)">Causation and pathogenesis of periodontal disease.</a> Periodontol. 25, 8-20 (2000).</li>
<li>Jotwani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+dendritic+cells+infiltrate+the+T+cell-rich+region+of+oral+mucosa+in+chronic+periodontitis%3A+in+situ%2C+in+vivo%2C+and+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies.</a> J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).</li>
<li>Graves, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor+antagonists+inhibit+the+progression+of+inflammatory+cell+infiltration+toward+alveolar+bone+in+experimental+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis.</a> J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).</li>
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<li>Cochran, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+bone+loss+in+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Inflammation and bone loss in periodontal disease.</a> J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).</li>
<li>Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response%3A+the+key+to+bone+resorption+in+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease.</a> J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).</li>
<li>Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+to+study+host-bacteria+interactions+involved+in+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis.</a> Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).</li>
</ol>

Los autores tienen nada que revelar.

Tejidos gingivales Maxilla obtenidos a partir de un solo ratón son suficientes para el análisis de subpoblaciones de linfocitos T y B, así como su capacidad para expresar moléculas extracelulares e intracelulares como hemos descrito anteriormente en 1. Sin embargo, si las poblaciones de células raras son de interés (por ejemplo, DC), se recomienda a los tejidos piscina 2-3 ratones. De nota, si así se prefiere, es posible despegar ambos los tejidos gingivales y palatales y luego a impuestos especiales, la encí...

Encía es el tejido blando que rodea la porción cervical de los dientes y cubre el proceso alveolar (Figura 1). La encía es un tipo de la mucosa masticatoria que se puede separar más a fondo en epitelio de la mucosa y tejido conectivo (también conocido como submucosa o lámina propia). La estructura anatómica de la encía y los dientes adyacentes permite que las bacterias residen y desarrollan la placa (biopelícula) que desafía continuamente el sistema inmune local. Como resultado, la respuesta inflamatoria se desarrolla en la encía, lo que en ciertas circunstancias se convierte en destructivo - una condición denominada enfermedades periodontales 2. Básicamente, patologías periodontales inducidas por placa se pueden dividir en la gingivitis y la periodontitis. Gingivitis representa una condición reversible de la respuesta inflamatoria local que se limita a la encía. La periodontitis, en el otro lado, es un proceso destructivo irreversible en la cual el aparato de inserción (hueso alveolar, periodontalligamento, cemento y encía) se destruye 3. La encía se propuso servir a los sitios, tanto como efectores e inductivo en enfermedades periodontales 4. Los estudios en humanos han sugerido que, en respuesta a la placa dental, células efectoras inmunes y las moléculas se infiltraron en la encía o de salida 5-7 dinámicamente. Esta actividad ha demostrado desempeñar un papel importante en la destrucción periodontal 8,9. Considerando que los datos generados por los estudios proporcionaron información valiosa con respecto a este proceso patológico, que trabaja con tejidos humanos poseen importantes limitaciones éticas, técnicas y experimentales. El desarrollo de modelos experimentales animales experimentos de causa-efecto mediante el empleo de ratones transgénicos y en las intervenciones in vivo 10. Como resultado, nuestro conocimiento de los mecanismos implicados en la enfermedad periodontal aumentó considerablemente durante las últimas dos décadas. Aún así, debido a la complejidad de las enfermedades periodontales, hayun debate sobre la naturaleza de la respuesta inmune local para facilitar la destrucción del tejido. Hay también una falta en nuestra comprensión de la función de las células inmunes centrales en la encía durante enfermedades periodontales. Es por lo tanto esencial para estudiar eventos inflamatorios patológicos que se producen en el tejido diana de la enfermedad, la encía.

<table><tbody><tr><td>Colagenasa Tipo II</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>CLS-2</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>SIGMA</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SIGMA</td><td>E6758-100G</td><td></td></tr><tr><td>PBS de Dulbecco</td><td>SIGMA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino </td><td>Industrias Biológicas</td><td>04-121-1</td> Filtro al vacío <td>inactivado por calor</td></tr><tr><td></td><td>Jet Biofil</td><td>FPE-204-500</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Poliestireno de fondo redondo Tubo</td><td>BD Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de celdas 70 &mu; m</td><td>SPL Lifesciences</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>Plato de cultivo de tejidos 35&#215; 10 mm</td><td>NUNC</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo CD11c de</td><td>ratón Biolegend</td><td></td><td>117305 Clon N418</td></tr><tr><td>Anti-ratón Anticuerpo CD45.2</td><td>Biolegend</td><td>109819</td><td>Clon 104</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD4 antiratón</td><td>Biolegend</td><td>100413</td><td>Clon GK1.5</td></tr><tr><td>Anti-ratón Anticuerpo CD8a</td><td>Biolegend</td><td>100733</td><td>Clon 53-6.7</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD3 antiratón</td><td>Biolegend</td><td>100214</td><td>Clon 17A2</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD326 (Ep-CAM)</td><td>Anticuerpo Biolegend</td><td>118219</td><td>Clon G8.8</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD207 (Langerin) Anticuerpo</td><td>Imgenex</td><td>DDX0362D</td><td>Clon 929F3.01</td></tr><tr><td>Anti-ratón I-Ad (MHC-II) Antobody</td><td>Biolegend</td><td>115010</td><td>Clon 39-10-8</td></tr><tr><td>LSR II Citómetro de flujo</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software v 7.6.5</td><td>Tree Star</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

el aislamiento, tratamiento y análisis de células gingivales murinos

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

Hemos desarrollado una técnica para aislar y procesar precisamente tejido gingival murino para citometría de flujo y los estudios moleculares. La encía es un tejido único e importante para estudiar los mecanismos inmunes, ya que está implicado en la respuesta inmune del huésped contra la biopelícula oral que podría causar enfermedades periodontales. Por otra parte, la estrecha proximidad de la encía al tejido óseo alveolar también permite el estudio de la remodelación ósea en condiciones inflamatorias. Nuestro método produce gran cantidad de células inmunes que permite el análisis de incluso poblaciones de células raras, tales como las células de Langerhans y células T reguladoras como hemos demostrado previamente 1. El empleo de los ratones para estudiar las respuestas inmunes locales implicadas en la pérdida de hueso alveolar durante enfermedades periodontales es ventajoso debido a la disponibilidad de diversas herramientas inmunológicas y experimental. Sin embargo, debido a su pequeño tamaño y el acceso relativamente inconveniente para la encía murino, muchos estudios evitarse examen de thitejido crítico s. El método descrito en este trabajo podría facilitar el análisis gingival, los que podrán aumentar nuestro subestimando sobre el sistema inmune oral y su papel durante las enfermedades periodontales.

Se presentan ejemplos de análisis de citometría de flujo en células de la encía. Células gingivales agrupados a partir de 2 ratones se llevaron a cabo en un citómetro de flujo LSR II y analizados utilizando el software FlowJo. Figura 3A demostraron la distribución de células de la encía de los ratones no tratados previamente en una dispersión lateral (SSC) frente a dispersión trama hacia adelante (FSC). Estrategia de apertura de puerta para identificar (i) linfocitos (ii) los monocitos / células dendrít...

Este estudio describe una técnica eficiente para aislar y procesar los tejidos gingivales de la cavidad oral del ratón con el fin de producir un cultivo de una sola célula. Las células resultantes pueden ser utilizados además para el análisis de citometría de flujo y los estudios moleculares.

El aislamiento, tratamiento y análisis de células gingivales murinos

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar y procesar con precisión la encía murina para un posterior análisis mediante citometría de flujo. Esto se logra primero mediante el aislamiento quirúrgico de la encía de manera meticulosa. A continuación, el tejido extirpado se procesa para generar una suspensión de células individuales.Luego se realiza la tinción extracelular e intracelular con anticuerpos. Finalmente, la muestra se analiza mediante citometría de flujo. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran diferentes poblaciones celulares en la encía y los cambios celulares que ocurren en el tejido tras la exposición a un agente agresor inmunológico mediante análisis de citometría de flujo.La principal ventaja de esta técnica, en comparación con métodos como la química en OC o la fluorescencia monocromática, es que constituye un método rápido y sencillo para analizar un gran número de células, permitiendo el análisis simultáneo de varias variables, así como la separación de diversos tipos celulares para experimentos posteriores. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como cómo los microorganismos influyen en l

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un protocolo optimizado para el aislamiento de células madre de la glándula salival del ratón se describe. El método emplea la digestión enzimática y mecánica, y permite el aislamiento de salispheres que contiene células con características de células madre.

Aislamiento de células de la glándula salival del ratón madre

Fuente: Choi, Y. S., et al. Detección in situ de bacterias en tejidos incrustados en parafina mediante una sonda de ADN marcada con digoxina que apunta al ARNr 16S. J. Vis. Exp. (2015).Este vídeo demuestra la detección in situ de bacterias en secciones de tejido gingival de ratón utilizando sondas de ADN marcadas con digoxinas que atacan el ADN bacteriano. La sección se incuba con la sonda. Se añaden anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina específicos a la digoxina. Se inactivan...

Detección in situ de bacterias en secciones de tejido gingival de ratón

Este video muestra el procedimiento de aislamiento de la red de células inmunes gingivales a partir de un modelo de ratón. La digestión enzimática libera el tejido gingival de los dientes y el hueso adheridos, que se digiere mecánicamente, liberando células inmunitarias de la encía. Las células aisladas están listas para experimentos inmunológicos.

Aislamiento de la red de células inmunitarias gingivales de bloques dentales murinos

Una clave para el éxito de la investigación de la biología microglial es la preservación de immunofunction microglial ex vivo durante el aislamiento del tejido del SNC. Aislar microglia mediante agitación rotatoria resultados en cultivos de células de alta pureza y inmunofuncional según la evaluación de imágenes fluorescentes, inmunocitoquímica y ELISA después de la activación microglia con el lipopolisacárido estímulos proinflamatorias (LPS) y Pam 3 CSK 4 (Pam).

Aislamiento de cortical Microglia con Inmunofenotipo Conservas y funcionalidad de murinos Neonatos

Hemos establecido una técnica para el aislamiento, la caracterización fenotípica y análisis funcional de células inmunes de encía murino.

El aislamiento, caracterización y examen funcional de la red celular gingival Inmune

Esfuerzos para comprender la función microglial en detalle han impedido por la falta de modelos de cultura microglial que recapitular las propiedades de microglia maduros en vivo . Este protocolo describe un acercamiento aislamiento y cultura diseñado para mantener la supervivencia robusta de microglia altamente ramificados de rata maduro medio definido en condiciones.

Aislamiento y cultivo de Microglia roedor para promover una dinámica ramifican morfología en medio libre de suero

La glándula lagrimal (LG) tiene dos tipos de células que expresan α-actina muscular lisa (αSMA): células mioepiteliales (MECs) y pericytes. Los MECs son de origen ectodérmico, se encuentran en muchos tejidos glandulares, mientras que los pericitos son células musculares lisas vasculares de origen endodérmico. Este protocolo aísla los MECs y los pericitos de los LGS murinos.

El aislamiento de las células mioepiteliales de la murina lagrimal adulta y las glándulas submandibulares

Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento in vitro de múltiples poblaciones de células gliales de un SNC de ratón. Este método permite la segregación de microglía regional, células precursoras de oligodendrocitos y astrocitos para estudiar los fenotipos de cada uno en una variedad de sistemas de cultivo.

Disección y aislamiento de la glía murina de múltiples regiones del sistema nervioso central

Aquí presentamos un método modificado para el aislamiento y cultivo de células epiteliales gingivales humanas mediante la adición del inhibidor de Rock, Y-27632, al método tradicional. Este método es más fácil, consume menos tiempo, mejora las propiedades de las células madre y produce un mayor número de células epiteliales de alto potencial tanto para el laboratorio como para aplicaciones clínicas.

Aislamiento y cultivo de células epiteliales gingivales humanas primarias utilizando Y-27632

El protocolo actual presenta un método rápido, eficiente y suave para aislar células individuales adecuadas para el análisis de ARN-seq de una sola célula a partir de un incisivo de ratón en crecimiento continuo, molar de ratón y dientes humanos.

Aislamiento rápido de células individuales de dientes de ratón y humanos

Aprende a aislar y procesar tejido gingival murino para obtener suspensiones celulares únicas. Este método permite el análisis de poblaciones celulares mediante citometría de flujo en estudios de inmunología oral.

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