Tipo 1 Diabetes inducción acelerada en ratones por transferencia adoptiva de células CD4 + células T diabetogénico

El objetivo general de este procedimiento es inducir rápidamente la diabetes tipo uno en ratones mediante la transferencia de células T diabetogénicas de ratones transgénicos a ratones, que carecen de células T y B endógenas. Comience por recolectar los bazos y los ganglios linfáticos de los ratones donantes y purificar las células T CD cuatro positivas. A continuación, transfiera las células T donantes purificadas a ratones receptores sin patine.

A continuación, monitorice a los ratones receptores para detectar el desarrollo de la diabetes tipo uno. En última instancia, este protocolo se puede utilizar para estudiar la patogénesis de la diabetes y para investigar intervenciones terapéuticas en comparación con otros métodos. La principal ventaja de esta técnica de transferencia de células T positivas para BDC 2.5, CD 4 a receptores sin deslizamiento es el desarrollo rápido y reproducible de la diabetes tipo uno.

En el caso de los donantes de células T diabetogénicas CD cuatro positivas, utilicen ratones BDC 2.5 hembra prediabéticos de seis semanas de edad que se haya determinado que están libres de diabetes mediante la medición de glucosa en orina. Para extirpar el bazo y los ganglios linfáticos, empape el pelaje con etanol al 70%, luego corte la piel, retraiga la piel hasta que los músculos de las extremidades delanteras queden expuestos. Cerca de la base de las extremidades delanteras, dos ganglios linfáticos a cada lado deben ser visibles Agarre cuidadosamente cada ganglio linfático con pinzas pequeñas y retírelo recortando el tejido conectivo.

A continuación, haga una incisión de una pulgada en el peritoneo con las tijeras pequeñas. Ahora agarre suavemente el bazo en el centro. Recorta con cuidado el tejido conectivo y la grasa adherida.

A continuación, retire el bazo, el encaje, el bazo y los ganglios linfáticos en 10 mililitros de DMEM en hielo. Con el extremo de un émbolo de jeringa estéril de 10 mililitros, presione suavemente los órganos linfoides a través de un colador de células de 70 micrómetros. Para obtener una suspensión de una sola célula.

Enjuague cada colador con un mililitro de DMEM varias veces para maximizar la recuperación de las células. A continuación, transfiera las células recogidas a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifuga a 400 Gs durante siete minutos. A temperatura ambiente, vuelva a suspender el pellet de celda en tres mililitros de un tampón CK.

Ahora incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. Para lejizar los glóbulos rojos, ahora agregue 12 mililitros de DMEM y pegue las células por centrifugación. Lave el pellet celular una vez en 10 mililitros de DMEM.

A continuación, suspendemos las células en cinco mililitros de tampón de tinción de hecho y utilizamos un microscopio de contraste de fase y un hemocímetro para contar el número de células viables. Ahora elimine aproximadamente una vez 10 de las seis células por control de tinción. También tiñe las células con anticuerpos monoclonales de ratón para clasificar las células T CD cuatro positivas transgénicas no activadas.

Incuba todas esas muestras a cuatro grados centígrados en la oscuridad durante 30 minutos. Ahora lave las células con tres veces el volumen de tinción del tampón de fax y vuelva a suspender las células en el tampón de fax una o dos veces, de 10 a las siete células por mililitro para clasificar la muestra y 300 microlitros para los controles de una sola mancha. A continuación, pase la muestra de células a través de un tubo de tapa de filtro de células de 35 micrómetros.

Para eliminar los cúmulos de células, procese las muestras para un clasificador de células con un operador capacitado Espere unas tres horas, incluido el tiempo de configuración para clasificar aproximadamente 1,5 veces 10 al octavo total CD vírgenes transgénicos cuatro células T positivas. Puede esperar alrededor de 2,5 veces 10 de las seis celdas por ratón y la tasa de clasificación será aproximadamente dos veces 10 de los cuartos eventos por segundo en un instrumento como el BD Fox Aria. Recoja las células clasificadas en tres mililitros de DMEM.

Registre el número absoluto de células clasificadas y centrifugalas durante siete minutos. A 400 Gs, suspendemos los gránulos de células en solución salina estéril tamponada con fosfato para la transferencia adoptiva de células T. Usando una jeringa de un mililitro en una aguja de calibre 18, vuelva a suspender suavemente el CD purificado por fax con cuatro células T positivas.

Cargue la jeringa de un mililitro y, en preparación para la inyección, coloque una aguja de calibre medio de 27 puntos en la jeringa. Sujete los ratones receptores del patín del nudo y limpie su cola con etanol al 70% para desinfectar el lugar de la inyección. A continuación, inyecte una décima parte de las seis células T positivas CD purificadas por ratón en cualquiera de las venas laterales de la cola.

Cuando realice las inyecciones en la vena de cola, asegúrese de no forzar el émbolo. Si la aguja está realmente en la vena, la inyección debe realizarse casi sin resistencia a partir de cinco días después de la transferencia de células T. Monitoree diariamente a los ratones receptores de nod skid para detectar el desarrollo de diabetes tipo uno.

Mida la glucosa en orina usando tiras reactivas de acuerdo con los fabricantes y las instrucciones. Tenga en cuenta que los ratones con dos lecturas consecutivas de glucosa en orina de más de 250 miligramos por decilitro se consideran diabéticos. En un experimento típico, cada ratón donante de BDC 2.5 produce aproximadamente dos veces y media 10 de las seis células T positivas CD transgénicas ingenuas cuatro después de la clasificación de células después de la transferencia adoptiva de células CD diabetogénicas cuatro células T positivas, los ratones fueron monitoreados para determinar las concentraciones de glucosa en la orina.

La transferencia adoptiva de un pequeño número de células de ratones donantes de BDC 2.5 indujo diabetes tipo uno en todos los receptores sin patines para el día 11. Cuando se realiza correctamente, esta técnica se puede realizar en aproximadamente ocho horas desde la extracción de órganos hasta la transferencia de células T.