JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

Preparación de muestras histológicas en la microscopía de luz

JoVE Science Education
General Laboratory Techniques

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Science Education General Laboratory Techniques

Histological Sample Preparation for Light Microscopy

1.10: Introduction to the Spectrophotometer

1.12: Introduction to Fluorescence Microscopy

239,655 Views

•

09:27 min

•

April 30, 2023

Overview

La histología es el estudio de células y tejidos, que normalmente es ayudado por el uso de un microscopio de luz. La preparación de muestras histológicas puede variar considerablemente basado en las propiedades inherentes de las muestras como el tamaño y dureza así como esperado de post-tratamiento que incluye previsto técnicas de coloración u otras aplicaciones de flujo de abajo. Como se describe en este video, preparacion comienza típicamente con un procedimiento de fijación para evitar la degradación de la muestra por natural las enzimas que son liberadas por las células a la muerte. Una vez fijadas, las muestras se colocan en un medio de inclusión que es capaz de soportar suficientemente la muestra. Comúnmente se trata de cera de parafina, pero otros materiales como una glicerina basan medio de congelación y agares también se utilizan para rodear la muestra durante el seccionamiento. Secciones entonces lleva a cabo en un micrótomo u otro dispositivo de corte que le permite afeitarse la muestra en rodajas desde unas micras hasta unos milímetros de espesor. Una vez cortadas, secciones son montadas en un portaobjetos de vidrio y teñidas para llevar a cabo funciones específicas de la muestra antes de ser reflejada en un microscopio.

Procedure

La histología es un término que se refiere al estudio de la anatomía microscópica de células y tejidos. Adecuada preparación histológica para microscopía de luz es esencial para obtener resultados de calidad de las muestras de tejido.

Hay 3 pasos principales comunes a casi todos los procedimientos histológicos. En primer lugar, la muestra es fija, con el fin de preservar el tejido y retrasar la degradación de tejido. A continuación, la muestra se encuentra inmerso en un material o medio de inclusión, que tiene propiedades mecánicas similares a sí mismo. Una vez encajado, la muestra es seccionada o cortada en rodajas con una herramienta de corte preciso conocida como un micrótomo. Este video describe los pasos generales y algunos de los conceptos que se relacionan con ellos.

La fijación del tejido es un paso crítico que conserva componentes de células y tejidos y mantiene su estructura. Tras la muerte de la célula, naturalmente enzimas que se liberan de organelos celulares y comienzan a degradar las proteínas en la célula y la matriz extracelular, destruyendo así la estructura de la célula. Fijación impide que esa degradación inhibiendo directamente la capacidad de estas enzimas digerir proteína y haciendo que la enzima sitios escote irreconocible.

Los dos principales mecanismos de fijación son Cross-linking y coagulación. Cross-linking consiste en formación de enlace covalente dentro de proteínas y entre ellos, que causa rigidez y por lo tanto resistir la degradación del tejido. La coagulación es causada por la deshidratación de las proteínas mediante el uso de alcohol o acetona, que deforman la estructura terciaria de la proteína, así que hidrofóbico, o agua temiendo, regiones mover la superficie de la proteína. Fijación de coagulante puede ayudar a incrustar los medios de comunicación, como la cera de parafina, penetrar en tejido.

Uno de los fijadores más comúnmente utilizadas es con formol, que es formaldehído disuelto en agua. Durante la fijación, el formaldehído se adhiere a aminas primarias, como las que se encuentran en las cadenas laterales de los aminoácidos lisina y glutamina para formar una reticulación estable llamada un puente methelene. Este proceso es intrínsecamente lento y puede tomar hasta 1-2 días.

Antes de la fijación deben hacerse algunas consideraciones. En primer lugar, considerar la difusividad de la muestra. Fijadores difundirán a distancia a través de los tejidos a una tasa que relaciona el coeficiente de difusión para el fijador multiplicado por la raíz cuadrada del tiempo. Un fijador que lleva 1 hora para penetrar 1 mm en la muestra tendrá 25 horas para penetrar 5 mm. Una vez que la formalina ha alcanzado el centro del tejido, el umbral de la reacción de reticulación necesita ocurrir. Por lo tanto, tamaño de muestra debe limitarse a 4 mm de espesor para la fijación exhaustiva en una cantidad razonable de tiempo.

En segundo lugar, tener en cuenta el volumen y el pH del fijador. El fijador al cociente del volumen de muestra debe ser por lo menos 40: 1 para que el reactivo no se agota fácilmente con el tiempo. Mientras algunos fijadores están diseñados para trabajar a un pH ácido, formol trabaja mejor cuando tamponados con fosfato para mantener un pH neutro, para que el exceso de ácido no se produce, que causa artefactos en el tejido.

El siguiente paso en la preparación histológica es inclusión, que consiste en apoyar las muestras en medios de comunicación que tiene rigidez mecánica similar a la muestra misma. Elegir el derecho de inclusión media es crítica, porque si es demasiado duro o demasiado débiles, defectos pueden ocurrir mientras el seccionamiento. Por el momento, los medios más comunes utilizados para empotrar son cera de parafina.

Antes de la inclusión en parafina, las muestras deben estar deshidratadas reemplazando el agua en el tejido con etanol, en primer lugar seguido de xilenos y entonces finalmente calentar cera de parafina. Una vez que la cera ha infiltrado en la muestra, cuidadosamente colocado y rodeada de cera adicional utilizando un molde para formar un bloque. A continuación, las muestras se unen a una cinta de tejido para seccionamiento.

Seccionamiento es el proceso de corte de lonchas finas de una muestra de un bloque de inclusión. Las secciones son generalmente del orden de 4-10 μm de espesor para uso con microscopía de luz.

Para cortar secciones, un metal, el vidrio o la hoja de diamante se fija primero en un micrótomo. La muestra se coloca en un porta muestra. A continuación, asciende a la superficie de corte y a través de la hoja para crear una rodaja del grosor deseado. Las secciones se amontona como cintas delgadas que pueden colocarse sobre el portaobjetos.

Siguientes secciones, las muestras se colocan en portaobjetos. Para las muestras de parafina incrustado, rodajas se colocan primero en un baño de agua caliente son levantadas fuera del agua sobre el portaobjetos y deja secar.

Tejido biológico tiene muy poco contraste inherente, así que después de la histología, diapositivas generalmente se tiñen con colorantes o anticuerpos que destacan morfología o proteínas específicas. La mancha más común realizada es hematoxilina y eosina, o H & E. Porque es tan común, muchas máquinas automáticas se han hecho para tinción reproducible numerosas secciones con H & E. hematoxilina tiñe los núcleos de las células azules y eosina tiñe el citoplasma rosado revelar la morfología celular de los tejidos.

Un inconveniente de fijación es que el cross-linking de proteínas puede hacer más para el etiquetado de anticuerpos para encontrar sus sitios de Unión. En lugar de utilizar fijación para preservar las muestras, rápidas congelación de los tejidos, o complemento de congelación puede ser utilizado, que es seguido por una técnica de seccionamiento llamada cryosectioning

Muestras de tejido son incrustadas y orientadas en un medios de congelación especiales llamados OCT o temperatura media óptima de corte y luego congeladas rápidamente. Como otro medio de inclusión, OCT coincide con la rigidez de la muestra.

Un cryomicrotome o criostato, se utiliza para cortar secciones congeladas y este instrumento mantiene una temperatura interna de-20 ° C para mantener la cuchilla y las muestras frescas. En contraste con secciones parafina-encajadas, secciones congeladas pueden izar directamente sobre un portaobjetos de vidrio cargada positivamente inmediatamente después del seccionamiento.

Otra forma de evitar la fijación es a través de agar incrustación, en el que las muestras se cubren con preparados agarosa líquida. Como la agarosa se enfría, que encaje el tejido y agarosa sobrante se puede recortar distancia.

Vibrotomes, otra alternativa para el micrótomo, tienen una cuchilla que vibra y se mueve a través de la muestra de agarosa incrustada. Vibrotomes se utilizan para crear secciones de espesor del orden de 50-1000 μm de agarosa incrustada muestras.

Muestras son típicamente de la agarosa antes de la tinción y luego coloca sobre un portaobjetos rodeado de una sustancia como la grasa para vacío que mantiene el cubreobjetos de aplastar la muestra. Ven mejor usando microscopia confocal para obtener imágenes de alta resolución de cada sección gruesa.

Sólo ha visto video de Zeus en la preparación de muestras histológicas para microscopía óptica.

Ahora debe comprender los pasos necesarios para la preparación de la muestra llegar de una pieza de tejido a una sección puede manchar. ¡Como siempre, gracias por ver!

Transcript

Histology is a term that refers to the study of the microscopic anatomy of tissues and cells. Proper histological sample preparation for light microscopy is essential for obtaining quality results from tissue samples.

There are 3 main steps common to nearly all histological procedures. First, the sample is fixed, in order to preserve the tissue and slow down tissue degradation. Next, the sample is immersed in a material, or embedding media, that has similar mechanical properties to itself. Once embedded, the sample is sectioned, or cut, into thin slices using a precise cutting tool known as a microtome. This video describes these general steps and some of the concepts that relate to them.

Tissue fixation is a critical step that preserves cell and tissue components and maintains their structure. Following cell death, naturally occurring enzymes are released from cellular organelles and begin to degrade the proteins throughout the cell and extracellular matrix, thereby destroying the structure of the cell. Fixation prevents such degradation by directly inhibiting the ability of these enzymes digest protein and by making the enzyme cleavage sites unrecognizable.

The two main mechanisms of fixation are cross-linking and coagulation. Cross-linking involves covalent bond formation both within proteins and between them, which causes tissue to stiffen and therefore resist degradation. Coagulation is caused by the dehydration of proteins through the use of alcohols or acetone, which deform protein tertiary structure, so that hydrophobic, or water fearing, regions move the protein surface. Coagulative fixation can help embedding media, like paraffin wax, penetrate tissue.

One of the most commonly-used fixatives is Formalin, which is formaldehyde dissolved in a water. During fixation, formaldehyde attaches to primary amines, such as those found on the side chains of the amino acids lysine and glutamine to form a stable crosslink called a methelene bridge. This process is inherently slow and can take up to 1-2 days.

Prior to fixation a few considerations should be made. First, consider the diffusivity of the sample. Fixatives will diffuse a distance through tissues at a rate related to the coefficient of diffusion for the fixative multiplied by the square root of time. A fixative that takes 1 hour to penetrate 1 mm into the sample will take 25 hours to penetrate 5 mm. Once formalin has reached the center of the tissue, the crosslinking reaction sill needs to occur. Thus, sample size should be limited to 4 mm in thickness for thorough fixation in a reasonable amount of time.

Second, consider the volume and pH of the fixative. The fixative to sample volume ratio should be at least 40:1 so that the reagent is not depleted easily over time. While some fixatives are designed to work at an acidic pH, formalin works best when buffered with phosphate to maintain a neutral pH, so that excess acid is not produced, which causes artifacts in tissue.

The next step in histological preparation is embedding, which involves supporting specimens in media that has similar mechanical rigidity to the specimen itself. Choosing the right embedding medium is critical, because if it is too stiff or too weak, defects may occur while sectioning. By far, the most common media used for embedding is paraffin wax.

Prior to paraffin-embedding, samples must be dehydrated by replacing the water in the tissue with ethanol, first, followed by xylenes, and then finally warmed paraffin wax. Once wax has infiltrated the sample, it is carefully positioned and surrounded with additional wax using a mould to form a block. Next, samples are attached to a tissue cassette for sectioning.

Sectioning is the process of cutting thin slices of a sample from an embedding block. The sections are usually on the order of 4-10 µm thick for use with light microscopy.

To cut sections, a metal, glass, or diamond blade is first secured on a microtome. The sample is then placed in a sample holder. Next, the sample is advanced to the cutting surface and drawn across the blade to create a slice of desired thickness. Sections will amass as thin ribbons which can be placed on glass slides.

Following sectioning, samples are placed on slides. For paraffin embedded samples, slices are first placed into a warmed water bath and are then lifted out of the water onto the slide and allowed to dry.

Biological tissue has very little inherent contrast, so after histology, slides are usually stained with dyes or antibodies that highlight morphology or specific proteins. The most common stain performed is hematoxylin and eosin, or H&E. Because it is so common, many automated machines have been made to reproducibly stain numerous sections with H&E. Hematoxylin stains the nuclei of cells blue and eosin stains the cytoplasm pink revealing cellular morphology of tissues.

One drawback to fixation is that the cross-linking of proteins can make it more for labeling antibodies to find their binding sites. Rather than using fixation to preserve samples, rapid freezing of tissue, or snap freezing can be used, which is followed by a sectioning technique called cryosectioning

Tissue samples are embedded and oriented in a special freezing media called OCT, or optimal cutting temperature medium and then rapidly frozen. Like other embedding media, OCT matches the rigidity of the sample.

A cryomicrotome or cryostat, is used to cut frozen sections and this instrument maintains an internal temperature of -20°C to keep the cutting blade and samples cool. In contrast to paraffin-embedded sections, frozen sections can be directly lifted onto a positively charged glass slide immediately after sectioning.

Another way to avoid fixation is via agar embedding, in which samples are covered with freshly prepared liquid agarose. As the agarose cools, it locks the tissue into place and excess agarose can be trimmed away.

Vibrotomes, another alternative to the microtome, have a blade that vibrates and moves across the agarose-embedded sample.Vibrotomes are used to create thick sections on the order of 50-1000 µm from agarose embedded samples.

Samples are typically removed from the agarose before staining , and then placed onto a slide surrounded by a substance such as vacuum grease that keeps the coverslip from squishing the sample. They are best viewed using confocal microscopy in order to obtain high resolution images of each thick section.

You’ve just watched JoVE’s video on histological sample preparation for light microscopy.

You should now understand the steps involved for sample preparation to get you from a piece of tissue to a stainable section. As always, thanks for watching!

Tags

Histological Sample Preparation Light Microscopy Histology Fixing Embedding Media Microtome Sectioning Cell Degradation Enzymes Protein Degradation Cross-linking Coagulation Protein Dehydration