1.11: Preparación de muestras histológicas en la microscopía de luz

La histología es un término que se refiere al estudio de la anatomía microscópica de los tejidos y las células. La preparación histológica adecuada de las muestras para la microscopía óptica es esencial para obtener resultados de calidad a partir de muestras de tejido.

Hay 3 pasos principales comunes a casi todos los procedimientos histológicos. En primer lugar, se fija la muestra, con el fin de preservar el tejido y ralentizar la degradación del tejido. A continuación, la muestra se sumerge en un material, o medio de inclusión, que tiene propiedades mecánicas similares a las suyas. Una vez incrustada, la muestra se secciona, o se corta, en rodajas finas utilizando una herramienta de corte precisa conocida como micrótomo. Este video describe estos pasos generales y algunos de los conceptos que se relacionan con ellos.

La fijación de tejidos es un paso crítico que preserva los componentes de las células y los tejidos y mantiene su estructura. Después de la muerte celular, las enzimas naturales se liberan de los orgánulos celulares y comienzan a degradar las proteínas en toda la célula y la matriz extracelular, destruyendo así la estructura de la célula. La fijación evita dicha degradación al inhibir directamente la capacidad de estas enzimas para digerir proteínas y hacer que los sitios de escisión de la enzima sean irreconocibles.

Los dos mecanismos principales de fijación son la reticulación y la coagulación. La reticulación implica la formación de enlaces covalentes tanto dentro de las proteínas como entre ellas, lo que hace que el tejido se endurezca y, por lo tanto, resista la degradación. La coagulación es causada por la deshidratación de las proteínas mediante el uso de alcoholes o acetona, que deforman la estructura terciaria de la proteína, de modo que las regiones hidrofóbicas o temerosas del agua mueven la superficie de la proteína. La fijación coagulativa puede ayudar a que los medios de inclusión, como la cera de parafina, penetren en el tejido.

Uno de los fijadores más utilizados es la formalina, que es formaldehído disuelto en un agua. Durante la fijación, el formaldehído se une a las aminas primarias, como las que se encuentran en las cadenas laterales de los aminoácidos lisina y glutamina para formar un enlace cruzado estable llamado puente de meteleno. Este proceso es inherentemente lento y puede tardar entre 1 y 2 días.

Antes de la fijación, se deben hacer algunas consideraciones. En primer lugar, hay que tener en cuenta la difusividad de la muestra. Los fijadores difundirán una distancia a través de los tejidos a una velocidad relacionada con el coeficiente de difusión del fijador multiplicado por la raíz cuadrada del tiempo. Un fijador que tarda 1 hora en penetrar 1 mm en la muestra tardará 25 horas en penetrar 5 mm. Una vez que la formalina ha alcanzado el centro del tejido, es necesario que se produzca la reacción de reticulación. Por lo tanto, el tamaño de la muestra debe limitarse a 4 mm de espesor para una fijación completa en un período de tiempo razonable.

En segundo lugar, considere el volumen y el pH del fijador. La relación entre el fijador y el volumen de la muestra debe ser de al menos 40:1 para que el reactivo no se agote fácilmente con el tiempo. Si bien algunos fijadores están diseñados para funcionar a un pH ácido, la formalina funciona mejor cuando se amortigua con fosfato para mantener un pH neutro, de modo que no se produzca un exceso de ácido, lo que causa artefactos en el tejido.

El siguiente paso en la preparación histológica es la incrustación, que implica el soporte de las muestras en un medio que tiene una rigidez mecánica similar a la de la propia muestra. La elección del medio de inclusión adecuado es fundamental, ya que si es demasiado rígido o demasiado débil, pueden producirse defectos durante el corte. Con mucho, el medio más común utilizado para la incrustación es la cera de parafina.

Antes de la inclusión en parafina, las muestras deben deshidratarse reemplazando el agua del tejido con etanol, primero, seguido de xilenos y, finalmente, cera de parafina calentada. Una vez que la cera se ha infiltrado en la muestra, se coloca cuidadosamente y se rodea con cera adicional utilizando un molde para formar un bloque. A continuación, las muestras se conectan a un casete de tejido para su sección.

El seccionamiento es el proceso de cortar rodajas finas de una muestra de un bloque de inclusión. Las secciones suelen tener un grosor del orden de 4-10 μm para su uso con microscopía óptica.

Para cortar secciones, primero se asegura una hoja de metal, vidrio o diamante en un micrótomo. A continuación, la muestra se coloca en un portamuestras. A continuación, la muestra avanza hasta la superficie de corte y se arrastra a través de la hoja para crear una rebanada del grosor deseado. Las secciones se acumularán como cintas delgadas que se pueden colocar en portaobjetos de vidrio.

Después del corte, las muestras se colocan en portaobjetos. En el caso de las muestras incluidas en parafina, las rodajas se colocan primero en un baño de agua tibia y luego se levantan del agua hasta el portaobjetos y se dejan secar.

El tejido biológico tiene muy poco contraste inherente, por lo que después de la histología, los portaobjetos generalmente se tiñen con tintes o anticuerpos que resaltan la morfología o proteínas específicas. La tinción más común que se realiza es la hematoxilina y la eosina, o H&E. Debido a que es tan común, se han fabricado muchas máquinas automatizadas para teñir de manera reproducible numerosas secciones con H&E. La hematoxilina tiñe los núcleos de las células de azul y la eosina tiñe el citoplasma de rosa revelando la morfología celular de los tejidos.

Un inconveniente de la fijación es que la reticulación de las proteínas puede dificultar más el marcaje de los anticuerpos para encontrar sus sitios de unión. En lugar de utilizar la fijación para preservar las muestras, se puede utilizar la congelación rápida de tejido o la congelación instantánea, a la que sigue una técnica de seccionamiento llamada criosección.

muestras de tejido se incrustan y orientan en un medio de congelación especial llamado OCT, o medio de temperatura de corte óptima, y luego se congelan rápidamente. Al igual que otros medios de incrustación, la OCT coincide con la rigidez de la muestra.

Un criomicrótomo o criostato, se utiliza para cortar secciones congeladas y este instrumento mantiene una temperatura interna de -20? C para mantener frías la cuchilla de corte y las muestras. A diferencia de las secciones incrustadas en parafina, las secciones congeladas se pueden levantar directamente sobre un portaobjetos de vidrio cargado positivamente inmediatamente después del corte.

Otra forma de evitar la fijación es a través de la inclusión en agar, en la que las muestras se cubren con agarosa líquida recién preparada. A medida que la agarosa se enfría, bloquea el tejido en su lugar y el exceso de agarosa se puede recortar.

Los vibrótomos, otra alternativa al micrótomo, tienen una cuchilla que vibra y se mueve a través de la muestra incrustada en agarosa. Los vibrótomos se utilizan para crear secciones gruesas del orden de 50-1000 μm a partir de muestras incrustadas en agarosa.

Por lo general, las muestras se extraen de la agarosa antes de teñirlas y luego se colocan en un portaobjetos rodeado de una sustancia como grasa de vacío que evita que el cubreobjetos aplaste la muestra. La mejor manera de visualizarlos es mediante microscopía confocal para obtener imágenes de alta resolución de cada sección gruesa.

Acaba de ver el vídeo de JoVE sobre la preparación de muestras histológicas para microscopía óptica.

Ahora debe comprender los pasos necesarios para la preparación de la muestra para pasar de un trozo de tejido a una sección teñible. Como siempre, ¡gracias por mirar!