Determinación de la actividad enzimática extracelular microbiana en aguas, suelos y sedimentos de los que utilizan y alto rendimiento de microplacas Ensayos

El objetivo general del siguiente procedimiento es ensayar rápidamente la actividad enzimática extracelular microbiana en una variedad de ambientes naturales. Esto se logra añadiendo muestras de agua o suspensiones de suelo a una microplaca para obtener una replicación adecuada. En un segundo paso, se añade un sustrato artificial cromogénico o fluorogénico a los pocillos de la microplaca, lo que permite que ocurran las reacciones enzimáticas. A continuación, se mide la absorbancia o la fluorescencia con el fin de determinar la cantidad de producto final liberado durante la reacción.

Los resultados muestran diferencias en la actividad de enzimas extracelulares entre muestras, basadas en la absorbancia o fluorescencia de la reacción final. Hoy vamos a demostrar cómo medir la actividad enzimática extracelular en ambientes naturales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en ecología microbiana, como las tasas de procesamiento de materia orgánica y la mineralización de nutrientes en suelos, sedimentos y aguas. En general, las personas nuevas en el uso de este método enfrentarán dificultades debido a la complejidad de separar partículas de la solución de reacción, especialmente al analizar un gran número de muestras.

Una demostración visual de este procedimiento es fundamental, ya que la disposición de las placas puede ser difícil de aprender y la toma de mediciones en múltiples intervalos de tiempo puede hacer que este procedimiento sea más complejo. El análisis colorimétrico de la actividad enzimática extracelular en suelos y sedimentos comienza con la preparación del tampón sustrato y de las soluciones patrón según se describe en el protocolo escrito para suelos; prepare una suspensión de cada muestra que se va a analizar en un tubo estéril de centrífuga de 15 mililitros. Añada una concentración de aproximadamente un gramo por mililitro utilizando tampón acetato 50 milimolar para los sedimentos.

Añada suficiente tampón acetato para que la suspensión sea fácilmente manejable. El volumen exacto de suspensión necesario variará según el número de enzimas analizadas, pero se recomienda un mínimo de cinco mililitros. Vortexe cada suspensión hasta que todos los grumos de suelo o sedimento se hayan dispersado.

Y anote el volumen final. Corte el extremo de las puntas de pipeta con tijeras antes de pipetear. Dado que las suspensiones de suelo tienden a obstruir las puntas, vuelva a mezclar por vórtex cada suspensión e inmediatamente pipete 150 µL en cada uno de los seis pozos.

En un bloque de 96 pocillos profundos. Es importante agitar vigorosamente y con frecuencia. Para mantener las partículas del suelo en suspensión, deje al menos dos pocillos por bloque vacíos para servir como control de sustrato.

Prepare un bloque de 96 pocillos para cada enzima que se vaya a ensayar. Vierta aproximadamente cinco mililitros de tampón acetato en un depósito para pipeta y utilice una pipeta de ocho canales para añadir 150 microlitros del tampón a los dos últimos pocillos de cada muestra.

Para los controles del tampón de muestra y para los dos pozos de control de sustrato. Vierta aproximadamente 10 mililitros de la solución de sustrato de p-nitrofenol o PNP adecuada en un depósito para pipeta y utilice una pipeta de ocho canales para agregar 150 microlitros de la solución de sustrato a los primeros cuatro pozos de cada muestra y a los dos pozos de control de sustrato. Anote el tiempo en que comienza la reacción, tan pronto como se agregue la solución de sustrato.

Incube las placas a temperatura ambiente durante 0,5 a cuatro horas. El tiempo exacto de incubación variará según el nivel de actividad en las muestras y la enzima que se vaya a ensayar. Mientras las pruebas están en incubación, prepare una microplaca transparente de 96 pozos.

Para cada bloque de pozos profundos, con el fin de leer la absorbancia, pipetee 190 microlitros de agua destilada y 10 microlitros de hidróxido de sodio uno molar en cada pocillo de la placa de microtitulación. El hidróxido de sodio ralentiza la reacción enzimática y aumenta el pH, lo cual potencia el color del PNP liberado durante la reacción tras la incubación. Centrifugue los bloques de 96 pozos a 2000-5000 ×g durante cinco minutos para sedimentar las partículas del suelo.

La eliminación del líquido sin perturbar el pellet puede ser un desafío. Se debe evitar usar demasiada muestra de suelo inicialmente. Asegúrese de centrifugar durante el tiempo suficiente y utilice un movimiento cuidadoso pero seguro para retirar el líquido.

Utilice una pipeta multicanal para retirar 100 microlitros de cada uno, teniendo cuidado de evitar el precipitado. Transfiera el líquido al pocillo correspondiente en una microplaca clara de 96 pocillos preparada, encienda el lector de microplacas y configure cualquier software necesario, registre la absorbancia a 410 nanómetros. Tras la determinación de la masa seca de las muestras según se describe en el protocolo escrito, calcule la absorbancia final de cada muestra restando la absorbancia del control de la muestra de la absorbancia del ensayo de la muestra.

Si los controles de sustrato tienen una absorbancia alta superior a 0,060, réstelos. A continuación, proceda a calcular la actividad enzimática en micromoles por hora por gramo de masa seca utilizando esta ecuación. Después de organizar una microplaca negra para cada enzima siguiendo el ejemplo mostrado en el protocolo del texto, vierta aproximadamente cinco mililitros de la primera muestra de agua en un depósito para pipeta y utilice una pipeta de ocho canales para transferir 200 microlitros a todos los pocillos.

En la columna uno de la placa de microtitulación, deseche las puntas de pipeta utilizadas y repita según sea necesario para cada muestra de agua, hasta completar las columnas uno a nueve. Configure los controles para tener en cuenta las muestras, estándares, sustrato e inhibición en la misma placa de microtitulación negra que las muestras. Los controles de muestra contienen agua de muestra y tampón de bicarbonato, y no se utilizan en los cálculos de actividad, pero demostrarán la consistencia de las lecturas a lo largo del experimento.

Los controles de apagado consisten en agua de muestra y una cantidad estándar de la etiqueta fluorescente, y se utilizan para medir la difracción de la fluorescencia. En agua de muestra, el sustrato y los controles estándar se componen respectivamente de sustrato unido o de la etiqueta fluorescente estándar, junto con tampón de bicarbonato. Vierta aproximadamente cinco mililitros de tampón de bicarbonato cinco milimolar en un recipiente limpio para pipeta.

Pipetee 50 microlitros de tampón en los pocillos del uno al nueve de las filas d y e para formar dos pocillos replicados de controles de muestra por muestra; cambie las puntas de pipeta y luego transfiera 200 microlitros de tampón bicarbonato a los pocillos del 10 al 12 de las filas A y H. Aunque en esta demostración la iluminación se mantiene intensa por motivos de filmación, se debe reducir la luz ambiental atenuando o apagando las luces, ya que el estándar fluorescente es sensible a la luz. Vierta aproximadamente cinco mililitros de 10 micromolar de cuatro metilumbeliferona o MUB en un reservorio limpio para pipeta, y pipetee 50 microlitros en los pocillos del uno al 12 de la fila H. Luego, pipetee 50 microlitros en los pocillos del uno al nueve de las filas G y F para formar tres réplicas de controles de enmascaramiento por muestra y controles estándar generales. Coloque la microplaca en la oscuridad o cúbrala con una tapa opaca para reducir la degradación lumínica de la MUB, encienda el fluorímetro y configure cualquier software necesario para estar listo para la lectura antes de añadir el sustrato.

Para aproximadamente cinco mililitros del sustrato MUB adecuado en un reservorio de pipeta limpio, utilice un pipeteador de 12 canales para transferir 50 microlitros a los pocillos del uno al 12 de la fila A y a los pocillos del uno al nueve de las filas B y C, con el fin de formar tres ensayos por muestra y tres controles de sustrato. Proceda inmediatamente a registrar la fluorescencia. Lea la fluorescencia inicial inmediatamente después de añadir el sustrato a la microplaca. Después de la lectura, incube la microplaca a temperatura ambiente, bien en la oscuridad o cubierta con una tapa opaca.

Para reducir la degradación por luz de MUB. El tiempo de incubación necesario para medir la actividad enzimática potencial máxima dependerá de la concentración de enzima dentro de una muestra. Dado que esta es desconocida, antes de realizar el ensayo de la muestra, será necesario leer una microplaca en múltiples intervalos de tiempo.

Para la mayoría de las enzimas, intervalos de 10 a 15 minutos durante el transcurso de una hora son adecuados, aunque algunas muestras con altas concentraciones alcanzarán su pico antes de los 10 minutos. Continúe midiendo la fluorescencia en la microplaca a los intervalos designados durante al menos una hora. Asegúrese de mantener la microplaca cubierta o en la oscuridad entre las lecturas.

Para cada muestra en cada intervalo de tiempo, calcule la fluorescencia inicial media de la muestra, la fluorescencia final media de la muestra, la fluorescencia media del patrón y la fluorescencia media del control de apagado para cada intervalo de tiempo. Calcule la actividad enzimática en m por hora por mililitro. Utilice la ecuación que se encuentra en el protocolo del texto.

Examine los valores de actividad calculados para cada paso de tiempo y determine la actividad potencial final a partir del paso de tiempo con la actividad más alta. Si los valores de actividad continúan aumentando, puede ser necesario incluir pasos de tiempo posteriores. Si los valores de actividad disminuyen a lo largo de la simulación, repita la corrida con pasos de tiempo más cortos.

Los suelos y los sedimentos acuáticos suelen tener niveles apreciables de actividad enzimática extracelular como resultado de comunidades microbianas adheridas que crecen sobre la superficie de partículas. Esta figura muestra cómo cambia esta actividad en función del tamaño de las partículas obtenidas del sedimento superficial de un curso fluvial de tercer orden en el norte de Mississippi, EE. UU. Un estudio previo ha demostrado que las comunidades bacterianas en partículas de sedimento de este arroyo pueden separarse en tres grupos distintos basándose en el análisis molecular de su estructura comunitaria.

Aquellos en partículas de 0,063 milímetros, aquellos en partículas de 0,125, 0,25 y 0,5 milímetros y aquellos en partículas de un milímetro. El análisis de los patrones en la actividad de enzimas extracelulares respalda esta conclusión, mostrando que la fosfatasa presenta niveles similares en partículas de 0,125, 0,25 y 0,5 milímetros, pero es mucho más alta en las fracciones de uno y 0,063 milímetros cuando se mide mediante la técnica con sustrato ligado al PNP. Otras enzimas como la beta-glucosidasa y la N-acetilglucosaminidasa muestran picos similares en las partículas más finas, pero no presentan aumentos en las partículas de un milímetro.

Destacando el hecho de que diferentes enzimas pueden mostrar distintas distribuciones ambientales, las cuales pueden elucidarse utilizando este ensayo. Las barras de error relativamente bajas indican que los ensayos colorimétricos de actividad enzimática en sedimentos son reproducibles y, por lo tanto, susceptibles de análisis estadístico. Al comparar diferentes muestras ambientales, las aguas naturales tienden a tener menor actividad enzimática extracelular por mililitro que los suelos o sedimentos por gramo.

Como tal, se deben analizar métricamente mediante sustratos ligados a MUB. Esta figura muestra cómo la actividad de las enzimas, fosfatasa, beta, glucosidasa y NGAs, varía con la profundidad. En un lago poco profundo del norte de Mississippi, EE. UU., se sabe que el lago es pobre en nutrientes, lo cual también se sugiere por la actividad relativamente alta de la fosfatasa y de la enzima que los microorganismos producen para obtener fosfato a partir de compuestos orgánicos.

Para las tres enzimas, las muestras de ensayo recolectadas en la superficie del agua y a una profundidad de 50 centímetros mostraron una actividad similar. Si bien la actividad fue mayor en la muestra de 100 centímetros, esta se tomó esencialmente en la interfaz agua-sedimento, y la presencia de partículas de sedimento en la muestra probablemente explica la mayor actividad observada, especialmente para beta-glucosidasa y n-AGAs. Como ocurre con los sustratos PNP, las pequeñas barras de error indican que, incluso con solo tres lecturas repetidas, la reproducibilidad de los ensayos fluorométricos que utilizan sustratos MUB es alta.

Téngase en cuenta que las unidades para la actividad enzimática en muestras de agua están en nanomoles de sustrato consumido, mientras que las de la actividad enzimática en partículas de sedimento están en micromoles de sustrato consumido, aunque el tamaño por unidad sea comparable. Esto resalta el hecho de que los suelos y sedimentos tienden a tener una actividad extracelular mucho mayor que las aguas naturales. También demuestra la mayor sensibilidad de la técnica del sustrato ligado a MUB y la necesidad de utilizar este método para ensayar la actividad enzimática extracelular en muestras de agua una vez dominado el procedimiento.

Esta técnica puede utilizarse para analizar nueve muestras de agua para hasta enzimas en poco más de una hora. Al intentar este procedimiento con suelos y sedimentos, es importante utilizar un material de masa conocida para que la actividad pueda expresarse en base al peso seco. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la actividad enzimática extracelular en una variedad de ambientes naturales utilizando técnicas colorimétricas o fluorimétricas.