Determinación de la actividad enzimática extracelular microbiana en aguas, suelos y sedimentos de los que utilizan y alto rendimiento de microplacas Ensayos

El objetivo general del siguiente procedimiento es analizar rápidamente la actividad enzimática extracelular microbiana en una variedad de entornos naturales. Esto se logra agregando muestras de agua o lodos de suelo a la microplaca para producir una replicación adecuada Como segundo paso, se agrega un sustrato colormétrico o fluorométrico artificial a los pocillos de la microplaca, lo que permite que ocurran reacciones enzimáticas. A continuación, se mide la absorbencia o la fluorescencia para determinar la cantidad de producto final liberado durante la reacción.

Los resultados muestran diferencias en la actividad enzimática extracelular entre muestras en función de la absorbencia o fluorescencia de la reacción final. Hoy vamos a demostrar cómo medir la actividad de las enzimas extracelulares en entornos naturales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en ecología microbiana, como las tasas de procesamiento de materia orgánica y la mineralización de nutrientes en suelos, sedimentos y aguas. Generalmente, las personas nuevas en el uso de este método tendrán dificultades debido a la dificultad para separar las partículas de la solución de reacción, especialmente cuando se analizan grandes cantidades de muestras.

Una demostración visual de este procedimiento es fundamental, ya que el diseño de una placa puede ser difícil de aprender y tomar medidas en múltiples pasos de tiempo puede hacer que este procedimiento sea más desafiante. El análisis métrico de Chole de la actividad enzimática extracelular para suelos y sedimentos comienza con la preparación del tampón de sustrato y las soluciones estándar como se describe en el protocolo de texto para el suelo, prepare una suspensión de cada muestra para analizarla en un tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros. Agregue una concentración de aproximadamente un gramo por mililitro usando tampón de acetato de 50 milimolares para sedimentos.

Agregue suficiente tampón de acetato para que la lechada se canalice fácilmente. El volumen exacto de lodo necesario variará según el número de enzimas analizadas, pero se recomienda un mínimo de cinco mililitros. Agite cada lechada hasta que todos los grumos de tierra o sedimento se hayan dispersado.

Y fíjate en el volumen final. Sujete el extremo de las puntas de pipeta con unas tijeras antes de pipetar. Dado que los lodos del suelo tienden a obstruir las puntas, renueve cada lodo e inmediatamente pipetee 150 microlitros en cada uno de los seis pozos.

En un bloque de 96 pozos de profundidad. Es importante hacer vórtice a fondo y con frecuencia. Para mantener las partículas del suelo en suspensión, deje vacíos al menos dos pozos por bloque para que sirvan como control del sustrato.

Preparar 1 96. Bloque de pozo para cada enzima que se va a analizar. Vierta aproximadamente cinco mililitros de tampón de acetato en un depósito de pipeta y utilice un pipeteador de ocho canales para añadir 150 microlitros del tampón a los dos últimos pocillos de cada muestra.

Para los controles de tampón de muestra y para los dos pocillos de control de sustrato. Vierta aproximadamente 10 mililitros de la solución de sustrato de p, nitro, hinojo o PNP adecuada en un depósito de pipeta y utilice una pipeta de ocho canales para añadir 150 microlitros de la solución de sustrato a los cuatro primeros pocillos de cada muestra y a los dos pocillos de control de sustrato. Anote el momento en que comienza la reacción, tan pronto como se agrega la solución de sustrato.

Incube las placas a temperatura ambiente durante 0,5 a cuatro horas. El tiempo exacto de incubación variará en función del nivel de actividad de las muestras y de la enzima que se vaya a analizar. Mientras se incuban los ensayos, prepare una microplaca transparente de 96 pocillos.

Para cada bloque de pocillos profundos, con el fin de leer la pipeta de absorbancia, 190 microlitros de agua destilada y 10 microlitros de hidróxido de sodio molar en cada pocillo de la microplaca. El hidróxido de sodio ralentiza la reacción enzimática y eleva el pH, lo que mejora el color del PNP liberado durante la reacción después de la incubación. Centrifugar los bloques de 96 pocillos a 2000 a 5.000 veces G durante cinco minutos para granular las partículas del suelo.

La eliminación del líquido sin alterar el pellet puede ser un desafío. Inicialmente, se debe evitar usar demasiada muestra de suelo. Asegúrese de centrifugar durante el tiempo suficiente y use un movimiento cuidadoso pero seguro para extraer el líquido.

Utilice una pipeta multicanal para extraer 100 microlitros de cada uno. Bueno, teniendo cuidado de evitar el pellet. Transfiera el líquido al pocillo correspondiente en una microplaca transparente de 96 pocillos preparada, encienda el lector de microplacas y configure cualquier software necesario Registre la absorbancia a 410 nanómetros después de la determinación de la masa seca de las muestras como se describe en el protocolo de texto, calcule la absorbancia final de cada muestra restando la absorbancia de control de la muestra de la absorbancia del ensayo de la muestra.

Si los controles de sustrato tienen una absorbancia alta de más de 0.060, reste esos. También proceda a calcular la actividad enzimática en micromoles por hora por gramo de masa seca utilizando esta ecuación. Después de organizar una microplaca negra para cada enzima siguiendo el ejemplo que se muestra en el protocolo de texto, vierta aproximadamente cinco mililitros de la primera muestra de agua en un depósito de pipeta y use una pipeta de ocho canales para pipetear 200 microlitros en todos los pocillos.

En la columna uno de la microplaca, deseche las puntas de pipeta usadas y repita según sea necesario para cada muestra de agua para llenar las columnas de la uno a la nueve. Configure controles para tener en cuenta las muestras, los estándares, el sustrato y el enfriamiento en la misma microplaca negra que las muestras. Los controles de muestra contienen agua de muestra y tampón de bicarbonato y no se utilizan en los cálculos de la actividad, pero demostrarán consistencia de lectura a lo largo del transcurso del experimento.

Los controles de enfriamiento consisten en una muestra de agua y una cantidad estándar de la etiqueta fluorescente y se utilizan para medir la difracción de la fluorescencia. En la muestra, el sustrato de agua y los controles estándar se componen de sustrato unido o la etiqueta fluorescente estándar, respectivamente, y tampón de bicarbonato. Vierta aproximadamente cinco mililitros de tampón de bicarbonato de cinco milimolares en un depósito de pipeta limpio.

Pipetear 50 microlitros de tampón en los pocillos de microplaca uno a nueve en las filas d y e para formar dos, replicar los pocillos de los controles de muestra por cambio de muestra en las puntas de la pipeta, luego transferir 200 microlitros de tampón de bicarbonato a los pocillos 10 a 12 en las filas A y H. Aunque la luz se mantiene brillante en esta demostración con fines de filmación, La iluminación ambiental debe reducirse atenuando o apagando las luces, ya que el estándar fluorescente es sensible a la luz. Vierta aproximadamente cinco mililitros de 10 micromolares, cuatro metilmón o MUB en un depósito de pipeta limpio, pipetee 50 microlitros en los pocillos de microplaca del uno al 12 en la fila H. Luego pipetee 50 microlitros en los pocillos del uno al nueve en las filas G y F para formar tres réplicas de controles de enfriamiento por muestra y controles estándar generales. Coloque la microplaca en la oscuridad o cúbrala con una tapa opaca para reducir la degradación lumínica de MUB, encienda el fluorímetro y configure cualquier software necesario para que esté listo para leer antes de agregar el sustrato.

Para aproximadamente cinco mililitros del sustrato revestido de MUB apropiado en un depósito de pipeta limpio, use una pipeta de 12 canales para pipetear 50 microlitros en los pocillos de microplaca del uno al 12 en la fila A y en los pocillos del uno al nueve en las filas B y C para formar tres, repita los ensayos para cada muestra y tres controles de sustrato procedan inmediatamente a registrar la fluorescencia. Lea la fluorescencia inicial inmediatamente después de la adición del sustrato a la microplaca después de la lectura. La fluorescencia incuba la microplaca a temperatura ambiente, ya sea en la oscuridad o cubierta con una tapa opaca.

Para reducir la degradación lumínica de MUB. El tiempo de incubación requerido para medir la actividad enzimática máxima potencial dependerá de la concentración de enzima dentro de una muestra. Dado que esto se desconoce, antes de analizar la muestra, se tendrá que leer una microplaca en varios pasos de tiempo.

Para la mayoría de las enzimas, intervalos de 10 a 15 minutos en el transcurso de una hora son apropiados, aunque algunas muestras con altas concentraciones alcanzarán su punto máximo antes de los 10 minutos. Continúe leyendo fluorescencia en la microplaca a los intervalos designados durante al menos una hora. Asegúrese de mantener la microplaca cubierta o en la oscuridad entre lecturas.

Para cada muestra en cada intervalo de tiempo, calcule la fluorescencia media de la muestra inicial, la fluorescencia media de la muestra final, la fluorescencia estándar media y la fluorescencia media de control de enfriamiento para cada intervalo de tiempo. Calcule la actividad enzimática en m por hora por mililitro. Usando la ecuación que se encuentra en el protocolo de texto.

Examine los valores de actividad calculados para cada período de tiempo, determine la actividad potencial final del período de tiempo con la actividad más alta. Si los valores de la actividad continúan aumentando, es posible que se requieran períodos de tiempo posteriores. Si los valores de la actividad caen a lo largo de la ejecución, vuelva a ejecutarla con periodos de tiempo más cortos.

Los suelos y los sedimentos acuáticos suelen tener niveles apreciables de actividad de la enzima en extracelular como resultado de las comunidades microbianas adheridas que crecen en la superficie de las partículas. Esta figura muestra cómo cambia esta actividad dependiendo del tamaño de las partículas obtenidas del sedimento superficial de un arroyo de tercer orden en el norte de Mississippi. Un estudio previo ha demostrado que las comunidades bacterianas en las partículas de sedimento de esta corriente se pueden separar en tres grupos distintos basados en el análisis molecular de su estructura comunitaria.

Los de partículas de 0,063 milímetros, los de partículas de 0,1, 2, 5, 0, 0,25 y 0,5 milímetros y los de partículas de un milímetro. El análisis de los patrones en la actividad enzimática extracelular apoya esta conclusión, ya que la fosfatasa es similar en las partículas de 0,1, 2, 5, 0,25 y 0,5 milímetros, pero mucho mayor en las fracciones de uno y 0,063 milímetros cuando se mide mediante la técnica de sustrato unido a PNP. Otras enzimas, como el beta glucco y los AGA n, muestran picos similares en las partículas más finas, pero no se elevan en las partículas de un milímetro.

Destacando el hecho de que diferentes enzimas pueden mostrar diferentes distribuciones ambientales y estas pueden ser dilucidadas usando este ensayo. Las barras de error relativamente bajas muestran que los ensayos métricos de la actividad enzimática en sedimentos son reproducibles y, por lo tanto, susceptibles de análisis estadístico. Al comparar muestras diferentes y ambientales, las aguas naturales tienden a tener una menor actividad enzimática extracelular por mililitro que los suelos o sedimentos por gramo.

Como tales, se debe ensayar la flora métricamente utilizando sustratos unidos a MUB. Esta figura muestra cómo la actividad de las enzimas, fosfatasa, beta, glucco y NGAs varía con la profundidad. En un lago poco profundo en el norte de Mississippi, EE. UU., Se sabe que el lago es pobre en nutrientes, lo que también se sugiere por la actividad relativamente alta de la fosfatasa y la enzima que producen los microorganismos para adquirir fosfato de compuestos orgánicos.

Para las tres enzimas, las muestras de ensayo recogidas en la superficie del agua y a 50 centímetros de profundidad mostraron una actividad similar. Mientras que la actividad fue elevada en la muestra de 100 centímetros, la muestra se tomó esencialmente de la interfaz agua-sedimento y la presencia de partículas de sedimento en la muestra probablemente explica la mayor actividad observada en la muestra, especialmente para beta glucco y n AGA. Al igual que con los sustratos PNP, las barras de error bajas muestran que incluso con solo tres lecturas repetidas, la reproducibilidad de los ensayos fluorométricos que utilizan sustratos MUB es alta.

Obsérvese que las unidades de actividad enzimática de la muestra de agua son inales del sustrato consumido, mientras que las de la actividad enzimática en las partículas de sedimento están en los micromoles de sustrato consumidos, aunque el tamaño por unidad sea comparable. Esto pone de manifiesto el hecho de que los suelos y los sedimentos tienden a tener una actividad extracelular mucho mayor que las aguas naturales. También demuestra el aumento de la sensibilidad de la técnica de sustrato ligado a MUB y la necesidad de utilizar esta técnica para analizar la actividad enzimática extracelular en muestras de agua una vez dominadas.

Esta técnica se puede utilizar para analizar nueve muestras de agua en busca de enzimas en poco más de una hora mientras se intenta este procedimiento para suelos y sedimentos. Es importante utilizar un material masivo conocido para que la actividad pueda expresarse en base al peso seco. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo medir la actividad de las enzimas extracelulares y una variedad de entornos naturales utilizando técnicas de métrica de color o métrica inferior.