Name: Determinación de la actividad enzimática extracelular microbiana en aguas, suelos y sedimentos de los que utilizan y alto rendimiento de microplacas Ensayos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-01T09:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 23 s
Description: Aprenda a ensayar la actividad enzimática extracelular microbiana en aguas, suelos y sedimentos mediante microplacas de alto rendimiento. Este método colorimétrico y fluorométrico facilita el análisis rápido en ecología microbiana.

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La financiación de los aspectos de este trabajo fue proporcionada por diversas fuentes, incluyendo el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos del Acuerdo de Cooperación Específico 58-6408-1-595 y la Fundación Nacional de Ciencia (premio 1.049.911).

Análisis colorimétrica de la actividad enzimática extracelular en suelos y sedimentos 1. Preparación del substrato y Soluciones tampón para análisis colorimétricos de actividad enzimática <ol><li> H Preparar 50 mM de tampón de acetato (pH 5.0-5.5) mediante la mezcla de 50 ml de 0.1 M de ácido acético (2,87 ml de ácido acético glacial en 500 ml de agua), 150 ml de acetato de sodio 0,1 M, y 200 ml de agua destilada 2 O. Ajustar el pH a 5,0-5,5 con ácido acético 0,1 M si es necesario. </li><li> Preparar una solución de 1 M de hidróxido de sodio (NaOH) en H2O destilada </li><li> Preparar soluciones de sustrato NP-linked p en 50 mM de tampón acetato. Para ensayo de fosfatasa preparar 5 mM p NP-fosfato en 50 mM de tampón acetato; para ensayar la β-glucosidasa preparar 5 mM p NP-β-glucopiranósido; para someter a ensayo la NAGase preparar 2 mM de PNP-β-N-acetylglucosaminide. Preparar todas las soluciones de sustrato en estériles de 15 ml o 50 ml tubos de centrífuga. Las soluciones pueden ser almacenadas a 4 ° C durante 2-3 semanas. </li></ol> 2. Determinación de un estándar para convertir Absorbancia Concentración de p NP <ol><li> Preparar soluciones estándar de p-nitrofenol en 50 mM de tampón acetato. Las concentraciones deben variar desde 0,025 hasta 1 mM. </li><li> Transferencia tres repeticiones de 100 l de cada concentración a una clara microplaca de 96 pocillos. Añadir 10 l de NaOH 1 M y 190 l de H2O destilada a cada pocillo. </li><li> Absorbancia Récord en 410 nm utilizando un lector de microplacas. </li><li> Concentraciones se multiplican en la curva estándar de 0,3 para obtener moles p NP por cada 300 l de volumen de reacción. Trazar una curva de absorbancia frente micromoles de p NP. La pendiente de la curva sirve como el factor de conversión (C) que se relacionan la absorbancia a micromoles de p NP en cada reacción de la enzima. </li></ol> 3. Realizar el ensayo enzimático <ol><li> Para suelos, preparar una suspensión de cada muestra a ensayar en un tubo de centrífuga de 15 ml estéril a una Concentrción de aproximadamente 1 g / ml -1 utilizando 50 mM de tampón acetato. Para los sedimentos, añadir tampón de acetato suficiente para hacer la pasta fácilmente pipettable. El volumen exacto de suspensión necesaria variará de acuerdo con el número de enzimas ensayadas, pero se recomienda un mínimo de 5 ml. Vortex cada suspensión hasta que todos los grumos de suelo o los sedimentos se han dispersado y anote el volumen final. </li><li> Re-vórtice cada suspensión y pipeta de inmediato 150 l en cada uno de los seis pozos en un bloque de 96 pocillos para pozos profundos (Figura 1). Es importante mezclar bien y con frecuencia con el fin de mantener a las partículas del suelo en suspensión. Deje por lo menos dos pozos por bloque vacías para servir como control de sustrato. Nota: el clip final de puntas de pipeta con tijeras antes de pipetear como suelos fangosos tienden a obstruir las propinas. Preparar un bloque de 96 pocillos para cada enzima a ensayar. </li><li> Verter aproximadamente 5 ml de tampón de acetato en un depósito pipeta y utilizar una pipeta de 8 canales a añadir 150 l de la memoria intermedia a la LAST dos pozos de cada muestra (estos serán controles de tampón de muestra) y los dos pocillos de control sustrato (Figura 1) </li><li> Vierta aproximadamente 10 ml de la solución apropiada NP-sustrato p en un depósito pipeta y utilizar una pipeta de 8 canales a añadir 150 l de la solución de sustrato a las primeras cuatro pocillos de cada muestra y los dos pocillos de control sustrato (Figura 1). Tenga en cuenta el tiempo que la reacción se inicia tan pronto como se añade la solución de sustrato. </li><li> Incubar las placas a temperatura ambiente (22 ° C) durante 0,5-4 h. Tiempo de incubación exacta variará dependiendo del nivel de actividad en las muestras y la enzima a ensayar. Para la mayoría de los suelos y sedimentos, fosfatasa y β-glucosidasa requieren tiempos de incubación de 0,5 a 1,5 horas, mientras que la NAGase y otras enzimas requieren tiempos de incubación de&gt; 2 h. </li><li> Mientras que los ensayos están incubando preparar clara microplacas de 96 pocillos a interpretar la extinción. Preparar una microplaca para cada bloque de pozos profundos (es decir, para cada direcciónnzyme ensayada). Pipetear 10 l 1 M NaOH y 190 l de agua destilada en cada pocillo de la microplaca. Nota: NaOH ralentiza la reacción enzimática y eleva el pH que mejora el color de la p NP liberado durante la reacción. </li><li> Después de la incubación, centrifugar los bloques de 96 pocillos a 2.000-5.000 g durante 5 min para sedimentar las partículas del suelo. </li><li> Use una pipeta multicanal a retirar 100 l de cada pocillo, teniendo cuidado de evitar la pastilla, y la transferencia a las correspondientes bien en claro microplaca de 96 pocillos preparados. </li><li> Encienda el lector de microplacas y configurar el software necesario. Absorbancia Récord en los 410 nm. Si la absorbancia de un pozo en particular está por encima del límite de detección lineal de la lector de placas, diluir así que 1:01 con agua y volver a medir. Si la absorbancia es todavía demasiado alta, el ensayo debe repetirse con un tiempo de incubación más corto. </li></ol> 4. Determinación de la masa seca de las muestras <ol><li> Pipetear 1 ml de cada sampl<html> e mezcla en una cacerola de aluminio previamente pesado. </li><li> Secar en una estufa de secado 75 ° C durante 48 horas y pesar. Reste el peso de la cacerola de este valor para obtener la masa seca del suelo o sedimento en 1 ml de la suspensión. Multiplicar por un factor de 0,15 para determinar la masa seca de la muestra en los 150 l añadidos a cada pocillo en el ensayo enzimático. </li></ol> 5. Cálculo de la actividad enzimática por la masa seca del suelo o sedimento <ol><li> Cálculo de absorbancia final de cada muestra sustrayendo la absorbancia de la muestra de control a partir de la absorbancia de la muestra de ensayo. Si los controles de sustrato tienen alta absorbencia (aproximadamente&gt; 0.060) luego restar esos también. </li><li> Cálculo de la actividad enzimática en moles h -1 g de masa seca -1 partir de la ecuación: </li></ol> La actividad enzimática = / (masa C x tiempo de incubación x muestra seca) absorbancia final Análisis fluorescente de la enzima extracelular Actividad en Natural Aguas tle &quot;&gt; 1. Preparación de sustrato, Standard y Soluciones tampón para análisis fluorométricos de actividad enzimática <ol><li> Preparar 200 M soluciones de sustratos MUB enlaces-(por ejemplo, 4-MUB-β-glucopiranósido, 4-MUB-fosfato, 4-MUB-N-acetil-β-D-glucosaminida) disolviendo el sustrato apropiado en estéril (autoclave) destilada H2O en 15 ml estériles o tubos de 50 ml de centrífuga. Envuelva los tubos de papel de aluminio para evitar la luz y almacenar en el refrigerador antes de su uso. Los sustratos deben ser estables durante al menos 1 semana si se almacena de esta manera. </li><li> Preparar un estándar MUB haciendo una solución madre de 100 mM 4-metilumbeliferona en agua destilada estéril 2 O. Almacene refrigerado en ámbar o botella envueltas en papel aluminio. Inmediatamente antes de su uso, diluir la solución 100 mM de stock de 1/10 en H2O estéril para hacer una solución de trabajo de 10 m para los ensayos enzimáticos. </li><li> Preparar una solución madre de tampón de bicarbonato 100 mM disolviendo 8,4 g de NaHCO &lt;sub&gt; 3 en 1 LH 2 O y autoclave. Diluir esta solución madre 1/20 en H2O estéril según sea necesario para hacer una solución de trabajo de 5 mM para los ensayos enzimáticos. </li></ol> 2. La organización de muestras de agua en un 96 pocillos de microplacas Negro <ol><li> Organizar una microplaca para cada enzima siguiendo el ejemplo mostrado en la Figura 2. Tenga en cuenta que lo que permite la replicación adecuada, estándares, y los controles, este procedimiento puede ensayar la actividad de una única enzima para un máximo de nueve muestras de agua en uno de 96 pocillos de microplacas negro. </li><li> Verter aproximadamente 5 ml de la primera muestra en un depósito de pipeta y utilizar una pipeta de 8 canales a pipette200 l en todos los pocillos de la columna 1 de la microplaca (s). Deseche las puntas de pipeta usadas y repetir según sea necesario para cada muestra de agua para llenar las columnas 1-9. </li></ol> 3. Configuración de la Muestra, Standard, Quench, y controles de sustrato <ol><li> Establecer controles para dar cuenta de las muestras, estándars, sustrato y enfriamiento en la misma microplaca negro como las muestras (Figura 2). </li><li> Controles de muestra contienen agua de muestra y tampón de bicarbonato, y no se utilizan en los cálculos de actividad pero demostrarán la lectura de la consistencia a lo largo del curso del experimento. Los controles de enfriamiento consisten en agua de la muestra y una cantidad estándar de la etiqueta fluorescente y se utilizan para medir la difracción de la fluorescencia en la muestra de agua. Substrato y controles estándar se componen de tampón o bien-sustrato vinculado o la etiqueta fluorescente estándar, respectivamente, y bicarbonato. </li><li> Vierta aproximadamente 5 ml de 5 mM de tampón de bicarbonato en un depósito de pipeta limpia. Pipetear 50 l de tampón en los pocillos de la microplaca 1 a 9 en filas D y E para formar dos pocillos replicados de controles de la muestra por muestra. Puntas de pipeta Cambio luego se transfieren 200 l de tampón de bicarbonato para pozos de 10 a 12 en las filas A y H. </li><li> Reducir la iluminación ambiental por atenuar o apagar las lilos dere como el estándar fluorescente es sensible a la luz. </li><li> Verter aproximadamente 5 ml de 10 mM 4-metilumbeliferona en un depósito de pipeta limpia. Pipetear 50 l en los pocillos de la microplaca de 1 a 12 en la fila H, y en los pozos 1 al 9 en filas G y F para formar tres réplicas de los controles de enfriamiento por muestra y los controles generales estándar. O coloque la microplaca en la oscuridad o cubrir con una tapa opaca para reducir la degradación de la luz de MUB. </li><li> Encienda el fluorómetro y puesta en marcha cualquier software necesario para estar listo para leer antes de añadir el sustrato. Nota: algunas bombillas fluorómetro pueden requerir un tiempo de calentamiento de 3 minutos o más. </li><li> Verter aproximadamente 5 ml de sustrato MUB vinculado-apropiado (por ejemplo 4-MUB-fosfato) en un depósito de pipeta limpia. Utilice una pipeta de 12 canales para pipetear 50 l en los pozos de la microplaca de 1 a 12 en la fila A, y en los pozos 1 a 9 en las líneas B y C para formar tres ensayos replicados de cada muestra y tres controles de sustrato. INMEDIATAMy vaya al paso 4.1, la fluorescencia de grabación. </li></ol> 4. Fluorescencia de grabación <ol><li> Leer la fluorescencia inicial inmediatamente después de la adición de sustrato a la microplaca. Después de leer la fluorescencia, se incuba la microplaca a temperatura ambiente (22 ° C) o bien en la oscuridad o cubierta con una tapa opaca para reducir la degradación de la luz MUB. </li><li> El tiempo de incubación requerido para medir la actividad máxima de la enzima potencial en una muestra de agua dependerá de la concentración de la enzima dentro de la muestra. Dado que este es desconocida antes de que se completó el ensayo, la microplaca se tendrá que leer en múltiples pasos de tiempo. Típicamente, la lectura a intervalos de 10-15 minutos en el transcurso de 1 h es aceptable para muchas enzimas, aunque las muestras con actividad muy alta para ciertas enzimas pueden alcanzar su punto máximo antes de 10 min. </li><li> Seguir leyendo la fluorescencia en microplacas a sus intervalos designados durante al menos 1 hora. Asegúrese de mantener la microplaca cubierta o en la oscuridad entre la lecturas. </li></ol> 5. Cálculo de la actividad enzimática por volumen de agua <ol><li> Para cada muestra en cada intervalo de tiempo de cálculo de las: fluorescencia media de la muestra inicial (pozos D y E), la fluorescencia de la muestra final media (pozos AC), la media de fluorescencia estándar (pozos H10-11), y la media apagan la fluorescencia de control (pozos FG). </li><li> Para cada intervalo de tiempo, calcular la actividad enzimática en nmoles hr -1 ml-1 a partir de la ecuación: </li></ol> La actividad enzimática = (media fluorescencia de la muestra - significará la fluorescencia de la muestra inicial) / ((media de fluorescencia / 0,5 mol) x estándar (media saciar la fluorescencia de control / media de fluorescencia) x estándar (0,2 ml) x (tiempo en horas)) <ol start="3"><li> Examine los valores de actividad calculados para cada paso de tiempo. Determinar la actividad potencial final a partir de la etapa de tiempo con la actividad más alta. Si los valores de actividad siguen aumentando entonces pueden ser necesarias medidas de tiempo posteriores, si los valores de actividad caen througHout el transcurso de la carrera, a continuación, ejecute de nuevo con pasos de tiempo más cortos. Actividad final es en nmoles de sustrato consumido hr -1 ml -1, pero se puede escalar hasta expresar como micromoles hr -1 L -1. </li></ol>

<ol><li>Ljungdahl, L. G., Eriksson, K. -E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecology+of+microbial+cellulose+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+microbial+ecology%22%5BJournal%5D)">Ecology of microbial cellulose degradation.</a> Advances in microbial ecology. 8, 237-299 (1985).</li>
<li>Sinsabaugh, R. L., Antibus, R. K., Linkins, A. E., Mclaugherty, C. A., Rayburn, L., Repert, D., Weiland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wood+decomposition+over+a+first-order+watershed%3A+mass+loss+as+a+function+of+lignocellulase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Wood decomposition over a first-order watershed: mass loss as a function of lignocellulase activity.</a> Soil biology and biochemistry. 24, 743-749 (1992).</li>
<li>Dalal, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+organic+phosphorus%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+agronomy%22%5BJournal%5D)">Soil organic phosphorus.</a> Advances in agronomy. 29, 83-113 (1977).</li>
<li>Sinsabaugh, R. L., Moorhead, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resource+allocation+to+extracellular+enzyme+production%3A+a+model+for+nitrogen+and+phosphorus+control+of+litter+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Resource allocation to extracellular enzyme production: a model for nitrogen and phosphorus control of litter decomposition.</a> Soil biology and biochemistry. 26, 1305-1311 (1995).</li>
<li>Tabatabai, M. A., Bremner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+p-nitrophenyl+phosphate+for+assay+of+soil+phosphatase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Use of p-nitrophenyl phosphate for assay of soil phosphatase activity.</a> Soil biology and biochemistry. 1, 301-307 (1969).</li>
<li>Parham, J. A., Deng, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+quantification+and+characterization+of+%CE%B2-glucosaminidase+activity+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Detection, quantification and characterization of β-glucosaminidase activity in soil.</a> Soil biology and biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).</li>
<li>Kuperman, R. G., Carreiro, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+heavy+metal+concentrations%2C+microbial+biomass+and+enzyme+activities+in+a+contaminated+grassland+ecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Soil heavy metal concentrations, microbial biomass and enzyme activities in a contaminated grassland ecosystem.</a> Soil biology and biochemistry. 29, 179-190 (1997).</li>
<li>Olander, L. P., Vitousek, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+soil+phosphatase+and+chitinase+activity+by+N+and+P+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeochemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of soil phosphatase and chitinase activity by N and P availability.</a> Biogeochemistry. 49, 175-190 (2000).</li>
<li>Jackson, C. R., Vallaire, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+salinity+and+nutrient+enrichment+on+microbial+assemblages+in+Louisiana+wetland+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Wetlands%22%5BJournal%5D)">Effects of salinity and nutrient enrichment on microbial assemblages in Louisiana wetland sediments.</a> Wetlands. 29, 277-287 (2009).</li>
<li>Hoppe, H. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+exoenzymatic+activities+in+the+ecology+of+brackish+water%3A+measurements+by+means+of+methylumbelliferyl-substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+ecology+progress+series%22%5BJournal%5D)">Significance of exoenzymatic activities in the ecology of brackish water: measurements by means of methylumbelliferyl-substrates.</a> Marine ecology progress series. 11, 299-308 (1983).</li>
<li>Somville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+and+study+of+substrate+specificity+of+exoglucosidase+activity+in+eutrophic+water%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Measurement and study of substrate specificity of exoglucosidase activity in eutrophic water.</a> Applied and environmental microbiology. 48, 1181-1185 (1984).</li>
<li>Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorogenic+substrates+for+measuring+enzyme+activity+in+peatlands%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+soil%22%5BJournal%5D)">The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands.</a> Plant and soil. 175, 147-152 (1995).</li>
<li>Sinsabaugh, R. L., Findlay, S., Franchini, P., Fischer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+analysis+of+riverine+bacterioplankton+production%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+oceanography%22%5BJournal%5D)">Enzymatic analysis of riverine bacterioplankton production.</a> Limnology and oceanography. 42, 29-38 (1997).</li>
<li>Marx, M. -C., Wood, M., Jarvis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microplate+fluorometric+assay+for+the+study+of+enzyme+diversity+in+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">A microplate fluorometric assay for the study of enzyme diversity in soils.</a> Soil biology and biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).</li>
<li>Jackson, C. R., Weeks, A. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+particle+size+on+bacterial+community+structure+in+aquatic+sediments+as+revealed+by+16S+rRNA+gene+sequence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Influence of particle size on bacterial community structure in aquatic sediments as revealed by 16S rRNA gene sequence analysis.</a> Applied and environmental microbiology. 74, 5237-5240 (2008).</li>
<li>Canion, A. K., Ochs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+population+dynamics+of+freshwater+armored+dinoflagellates+in+a+small+lake+in+Mississippi%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+freshwater+ecology%22%5BJournal%5D)">The population dynamics of freshwater armored dinoflagellates in a small lake in Mississippi.</a> Journal of freshwater ecology. 20, 617-626 (2005).</li>
<li>Sinsabaugh, R. L., Lauber, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+soil+enzyme+activity+at+global+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+letters%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale.</a> Ecology letters. 11, 1252-1264 (2008).</li>
<li>Jackson, C. R., Foreman, C. M., Sinsabaugh, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+enzyme+activities+as+indicators+of+organic+matter+processing+rates+in+a+Lake+Erie+coastal+wetland%5BTitle%5D)+AND+%22Freshwater+biology%22%5BJournal%5D)">Microbial enzyme activities as indicators of organic matter processing rates in a Lake Erie coastal wetland.</a> Freshwater biology. 34, 329-342 (1995).</li>
<li>Jackson, C. R., Vallaire, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+activity+and+decomposition+of+fine+particulate+organic+matter+in+a+Louisiana+cypress+swamp%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+north+american+benthological+society%22%5BJournal%5D)">Microbial activity and decomposition of fine particulate organic matter in a Louisiana cypress swamp.</a> Journal of the north american benthological society. 26, 743-753 (2007).</li>
<li>Jackson, C. R., Liew, K. C., Yule, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+changes+with+depth+in+microbial+communities+in+a+tropical+Malaysian+peat+swamp+forest%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+ecology%22%5BJournal%5D)">Structural and functional changes with depth in microbial communities in a tropical Malaysian peat swamp forest.</a> Microbial ecology. 57, 402-412 (2009).</li>
<li>Rietl, A. J., Jackson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+ecological+restoration+practices+of+prescribed+burning+and+mechanical+thinning+on+soil+microbial+enzyme+activities+and+leaf+litter+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of the ecological restoration practices of prescribed burning and mechanical thinning on soil microbial enzyme activities and leaf litter decomposition.</a> Soil biology and biochemistry. 50, 47-57 (2012).</li>
<li>Smart, K. A., Jackson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+scale+patterns+in+microbial+extracellular+enzyme+activity+during+leaf+litter+decomposition+in+a+stream+and+its+floodplain%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+ecology%22%5BJournal%5D)">Fine scale patterns in microbial extracellular enzyme activity during leaf litter decomposition in a stream and its floodplain.</a> Microbial ecology. 58, 591-598 (2009).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

La determinación de la actividad de una variedad de enzimas extracelulares microbianas en suelos y sedimentos puede proporcionar información útil sobre las tasas de mineralización de nutrientes y de procesamiento de materia orgánica 17. Sin embargo, los suelos pueden varían en sus niveles de humedad, por lo que es importante normalizar la actividad de peso en seco del suelo. Esto requiere una etapa de secado adicional (normalmente dos días) más allá de la simple medición de la actividad enzimática. Por lo tan...

Los microorganismos tales como bacterias y hongos obtienen los nutrientes y de carbono a partir de compuestos orgánicos complejos a través de la producción de enzimas extracelulares. Estas enzimas hidrolizan típicamente polímeros en subunidades más pequeñas que se pueden tomar en la célula. Por lo tanto, a nivel ecológico, estas enzimas extracelulares microbianos son responsables de gran parte de la mineralización de nutrientes y la descomposición de la materia orgánica que se produce en entornos naturales. Las enzimas tales como celobiohidrolasa (CBH) y β-glucosidasa son importantes para la degradación de la celulosa y el trabajo al unísono para catalizar la hidrólisis de la celulosa a glucosa 1,2, que proporciona un sustrato de carbono utilizable para la absorción y asimilación microbiana. La enzima fosfatasa libera grupos fosfatos inorgánicos solubles de organofosfatos, esencialmente mineralizantes fosfato y su puesta a disposición para su uso por la mayoría de los organismos 3. Otras enzimas, tales como N-acetilglucosaminidasa (la NAGase), son IMPORTANTESt en la degradación de la quitina y puede hacer tanto el carbono y el nitrógeno disponible para la adquisición microbiana 4. Uno de los procedimientos para el ensayo de actividad de la enzima microbiana extracelular en ambientes naturales es el uso de p-nitrofenil artificial de sustratos enlazados (p NP), un enfoque que se desarrolló originalmente para detectar la actividad fosfatasa de suelo 5. Este enfoque se basa en la detección de un producto final coloreado, p-nitrofenol, que se libera cuando el sustrato artificial es hidrolizado por la enzima apropiada. El p-nitrofenol puede posteriormente cuantificar colorimétricamente midiendo su absorbancia a alrededor de 400-410 nm. Este método ya se ha aplicado para detectar otras enzimas tales como la NAGase 6, y se ha utilizado en varios estudios en busca de actividad de la enzima microbiana extracelular en los suelos y sedimentos 7-9. Un enfoque alternativo que era originally desarrollado para evaluar la actividad glucosidasa extracelular en ambientes acuáticos 10,11 hace uso de (MUB) sustratos ligados 4 metilumbeliferona. El producto final liberado (4-metilumbeliferona) es altamente fluorescente y puede detectarse utilizando un fluorómetro con un ajuste de excitación / emisión de alrededor de 360/460 nm. Una variedad de sustratos artificiales MUB enlaces-están disponibles, permitiendo la medición fluorométrica de la actividad de al menos el mayor número de enzimas (por ejemplo, β-glucosidasa, celobiohidrolasa, Nagase, fosfatasa) como puede ensayarse usando el procedimiento colorimétrico-NP sustrato p. Otras enzimas extracelulares microbianos, tales como la aminopeptidasa de leucina en proteínas degradantes, se pueden ensayar fluorométricamente utilizando 7-amino-4-metil-cumarina (COU) sustratos enlazados. Tanto MUB-y sustratos COU vinculados se han utilizado para determinar la actividad de la enzima en varias muestras terrestres y acuáticos 12,13. Mientras que los estudios anteriores han described microplaca fluorométrico o colorimétrico se acerca para determinar la actividad enzimática extracelular 14, hay una necesidad de una presentación clara de cómo llevar a cabo dichos ensayos. Aquí se demuestra los procedimientos para la realización de técnicas de alto rendimiento de la microplaca para el análisis de la actividad enzimática extracelular en suelos y sedimentos, utilizando el enfoque sustratos NP-linked p colorimétrico y en aguas naturales mediante la técnica fluorescente sustratos MUB enlazada. Nos centramos en la medición de las actividades de β-glucosidasa, la NAGase, y fosfatasa como estas enzimas pueden estar vinculados a carbono, de nitrógeno, de fósforo y el ciclismo, respectivamente. Sin embargo, los procedimientos descritos aquí se pueden aplicar a la medición de otros enzimas extracelulares utilizando diferentes sustratos artificiales.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fuerte>REACTIVOS Y MATERIALES</fuerte></td></tr><tr><td>Ácido</td><td></td><td></td> acético glacial <td>Varios proveedores</td></tr><tr><td>Acetato</td><td></td><td></td> de sodio <td>Varios proveedores</td></tr><tr><td>Hidróxido de</td><td></td><td></td> sodio <td>Varios proveedores</td></tr><tr><td>p-Nitrofenol</td><td>Fisher</td><td>BP612-1</td><td>Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>p-Nitrofenilo (pNP)-fosfato</td><td>Sigma</td><td>N3234</td><td>pNP-substrate</td></tr><tr><td>pNP-&#946;-glucopiranósido</td><td>Sigma</td><td>N7006</td><td>pNP-sustrato</td></tr><tr><td>pNP-&#946;-N-acetilglucosaminida</td><td>Sigma</td><td>N9376</td><td>p Sustrato NP</td></tr><tr><td>Microplacas transparentes de 96 pocillos</td><td>Fisher</td><td>12-563-301</td><td>Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>Bloques de pocillos profundos de 96 pocillos</td><td>Costar</td><td>3958</td><td>Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>Bandejas de pesaje de</td><td></td><td></td> aluminio <td>Varios proveedores</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga estériles de</td><td></td><td></td> 15 ml <td>Varios proveedores</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga estériles de</td><td></td><td></td> <td>50 mlVarios proveedores</td></tr><tr><td>4-Metilumbeliferona</td><td>Sigma</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>4-Metilumbeliferol (MUB)-fosfato</td><td>Sigma</td><td>M8883</td><td>MUB-sustrato</td></tr><tr><td>4-MUB-glucopiranósido</td><td>Sigma</td><td>M3633</td><td>MUB-sustrato</td></tr><tr><td>4-MUB-N-acetilglucosaminida</td><td>Sigma</td><td>M2133</td><td>MUB-sustrato</td></tr><tr><td>Bicarbonato</td><td></td> de sodio<td></td><td>Varios proveedores</td></tr><tr><td>Microplaca negra de 96 pocillos</td><td>Costar</td><td>3792</td><td></td></tr><tr><td>Depósito</td><td></td><td></td> de pipeta <td>Varios proveedores</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Rotor centrífugo</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-81</td><td>Para microplacas/bloques de pocillos profundos</td></tr><tr><td>Lector de microplacas</td><td>BioTek</td><td>Synergy HT</td><td>Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>Fluorómetro de microplacas</td><td>BioTek</td><td>FLx 800</td><td>Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>Pipeta</td><td></td><td></td> de 8 canales <td>Varios proveedores</td></tr></tbody></table>

determinación de la actividad enzimática extracelular microbiana en aguas, suelos y sedimentos de los que utilizan y alto rendimiento de microplacas ensayos

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Gran parte de la ciclo de los nutrientes y el procesamiento de carbono en ambientes naturales se produce a través de la actividad de las enzimas extracelulares liberados por microorganismos. Por lo tanto, la medición de la actividad de estas enzimas extracelulares puede dar una visión de los tipos de procesos a nivel de ecosistema, como la descomposición de la materia orgánica o mineralización del nitrógeno y el fósforo. Los ensayos de actividad de la enzima extracelular en muestras ambientales normalmente implican la exposición de las muestras a sustratos colorimétricos o fluorométricos artificiales y el seguimiento de la tasa de hidrólisis del sustrato. Aquí se describen los métodos de microplacas basado para estos procedimientos que permiten el análisis de un gran número de muestras dentro de un corto período de tiempo. Las muestras se dejan reaccionar con sustratos artificiales dentro de microplacas de 96 pocillos o de pozo profundo bloques de la microplaca, y la actividad enzimática se determina posteriormente por absorción o fluorescencia del producto final resultante usando un Reade típica de microplacasr o fluorómetro. Tales procedimientos de alto rendimiento no sólo facilitan las comparaciones entre sitios espacialmente separados o ecosistemas, sino que también reducen sustancialmente el coste de dichos ensayos, reduciendo los volúmenes totales de reactivos necesarios por muestra.

Los suelos y sedimentos acuáticos suelen tener niveles apreciables de actividad enzimática extracelular como resultado de las comunidades microbianas adjuntos (biofilms) que crecen en la superficie de las partículas. Figura 3 muestra cómo esta actividad cambia en función del tamaño de las partículas obtenidas del sedimento superficial de un tercer corriente de orden en el norte de Mississippi, EE.UU.. Un estudio previo ha demostrado que las comunidades bacterianas en las partículas de sedimento de esta ...

Procedimientos basado en una microplaca se describen para el análisis colorimétrico o fluorométrico de la actividad enzimática extracelular. Estos procedimientos permiten el rápido ensayo de tal actividad en un gran número de muestras del medio ambiente dentro de un marco de tiempo manejable.

Determinación de la actividad enzimática extracelular microbiana en aguas, suelos y sedimentos de los que utilizan y alto rendimiento de microplacas Ensayos

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

El objetivo general del siguiente procedimiento es ensayar rápidamente la actividad enzimática extracelular microbiana en una variedad de ambientes naturales. Esto se logra añadiendo muestras de agua o suspensiones de suelo a una microplaca para obtener una replicación adecuada. En un segundo paso, se añade un sustrato artificial cromogénico o fluorogénico a los pocillos de la microplaca, lo que permite que ocurran las reacciones enzimáticas. A continuación, se mide la absorbancia o la fluorescencia con el fin de determinar la cantidad de producto final liberado durante la reacción.Los resultados muestran diferencias en la actividad de enzimas extracelulares entre muestras, basadas en la absorbancia o fluorescencia de la reacción final. Hoy vamos a demostrar cómo medir la actividad enzimática extracelular en ambientes naturales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en ecología microbiana, como las tasas de procesamiento de materia orgánica y la mineralización de nutrientes en suelos, sedimentos y aguas. En general, las personas nuevas en el uso de este método enfrentarán dificultades debido a la complejidad de separar partículas de la solución de reacción, especialmente al analizar un gran número de muestras.Una demostración visual de este procedimiento es fundamental, ya que la disposición de las placas puede ser difícil de aprender y la toma de mediciones en múltiples intervalos de tiempo puede hacer que este procedimiento sea más complejo. El análisis colorimétrico de la actividad enzimática extracelular en suelos y sedimentos comienza con la preparación del tampón sustrato y de las soluciones patrón según se describe en el protocolo escrito para suelos; prepare una suspensión de cada muestra que se va a analizar en un tubo estéril de centrífuga de 15 mililitros. Añada una concentración de aproximadamente un gramo por mililitro utilizando tampón acetato 50 milimolar para los sedimentos.Añada suficiente tampón acetato para que la suspensión sea fácilmente manejable. El volumen exacto de suspensión necesario variará según el número de enzimas analizadas, pero se recomienda un mínimo de cinco mililitros. Vortexe cada suspensión hasta que todos los grumos de suelo o sedimento se hayan dispersado.Y anote el volumen final. Corte el extremo de las puntas de pipeta con tijeras antes de pipetear. Dado que las suspensiones de suelo tienden a obstruir las puntas, vuelva a mezclar por vórtex cada suspensión e inmediatamente pipete 150 µL en cada uno de los seis pozos.En un bloque de 96 pocillos profundos. Es importante agitar vigorosamente y con frecuencia. Para mantener las partículas del suelo en suspensión, deje al menos dos pocillos por bloque vacíos para servir como control de sustrato.Prepare un bloque de 96 pocillos para cada enzima que se vaya a ensayar. Vierta aproximadamente cinco mililitros de tampón acetato en un depósito para pipeta y utilice una pipeta de ocho canales para añadir 150 microlitros del tampón a los dos últimos pocillos de cada muestra.Para los controles del tampón de muestra y para los dos pozos de control de sustrato. Vierta aproximadamente 10 mililitros de la solución de sustrato de p-nitrofenol o PNP adecuada en un depósito para pipeta y utilice una pipeta de ocho canales para agregar 150 microlitros de la solución de sustrato a los primeros cuatro pozos de cada muestra y a los dos pozos de control de sustrato. Anote el tiempo en que comienza la reacción, tan pronto como se agregue la solución de sustrato.Incube las placas a temperatura ambiente durante 0,5 a cuatro horas. El tiempo exacto de incubación variará según el nivel de actividad en las muestras y la enzima que se vaya a ensayar. Mientras las pruebas están en incubación, prepare una microplaca transparente de 96 pozos.Para cada bloque de pozos profundos, con el fin de leer la absorbancia, pipetee 190 microlitros de agua destilada y 10 microlitros de hidróxido de sodio uno molar en cada pocillo de la placa de microtitulación. El hidróxido de sodio ralentiza la reacción enzimática y aumenta el pH, lo cual potencia el color del PNP liberado durante la reacción tras la incubación. Centrifugue los bloques de 96 pozos a 2000-5000 ×g durante cinco minutos para sedimentar las partículas del suelo.La eliminación del líquido sin perturbar el pellet puede ser un desafío. Se debe evitar usar demasiada muestra de suelo inicialmente. Asegúrese de centrifugar durante el tiempo suficiente y utilice un movimiento cuidadoso pero seguro para retirar el líquido.Utilice una pipeta multicanal para retirar 100 microlitros de cada uno, teniendo cuidado de evitar el precipitado. Transfiera el líquido al pocillo correspondiente en una microplaca clara de 96 pocillos preparada, encienda el lector de microplacas y configure cualquier software necesario, registre la absorbancia a 410 nanómetros. Tras la determinación de la masa seca de las muestras según se describe en el protocolo escrito, calcule la absorbancia final de cada muestra restando la absorbancia del control de la muestra de la absorbancia del ensayo de la muestra.Si los controles de sustrato tienen una absorbancia alta superior a 0,060, réstelos. A continuación, proceda a calcular la actividad enzimática en micromoles por hora por gramo de masa seca utilizando esta ecuación. Después de organizar una microplaca negra para cada enzima siguiendo el ejemplo mostrado en el protocolo del texto, vierta aproximadamente cinco mililitros de la primera muestra de agua en un depósito para pipeta y utilice una pipeta de ocho canales para transferir 200 microlitros a todos los pocillos.En la columna uno de la placa de microtitulación, deseche las puntas de pipeta utilizadas y repita según sea necesario para cada muestra de agua, hasta completar las columnas uno a nueve. Configure los controles para tener en cuenta las muestras, estándares, sustrato e inhibición en la misma placa de microtitulación negra que las muestras. Los controles de muestra contienen agua de muestra y tampón de bicarbonato, y no se utilizan en los cálculos de actividad, pero demostrarán la consistencia de las lecturas a lo largo del experimento.Los controles de apagado consisten en agua de muestra y una cantidad estándar de la etiqueta fluorescente, y se utilizan para medir la difracción de la fluorescencia. En agua de muestra, el sustrato y los controles estándar se componen respectivamente de sustrato unido o de la etiqueta fluorescente estándar, junto con tampón de bicarbonato. Vierta aproximadamente cinco mililitros de tampón de bicarbonato cinco milimolar en un recipiente limpio para pipeta. Pipetee 50 microlitros de tampón en los pocillos del uno al nueve de las filas d y e para formar dos pocillos replicados de controles de muestra por muestra; cambie las puntas de pipeta y luego transfiera 200 microlitros de tampón bicarbonato a los pocillos del 10 al 12 de las filas A y H. Aunque en esta demostración la iluminación se mantiene intensa por motivos de filmación, se debe reducir la luz ambiental atenuando o apagando las luces, ya que el estándar fluorescente es sensible a la luz. Vierta aproximadamente cinco mililitros de 10 micromolar de cuatro metilumbeliferona o MUB en un reservorio limpio para pipeta, y pipetee 50 microlitros en los pocillos del uno al 12 de la fila H. Luego, pipetee 50 microlitros en los pocillos del uno al nueve de las filas G y F para formar tres réplicas de controles de enmascaramiento por muestra y controles estándar generales. Coloque la microplaca en la oscuridad o cúbrala con una tapa opaca para reducir la degradación lumínica de la MUB, encienda el fluorímetro y configure cualquier software necesario para estar listo para la lectura antes de añadir el sustrato.Para aproximadamente cinco mililitros del sustrato MUB adecuado en un reservorio de pipeta limpio, utilice un pipeteador de 12 canales para transferir 50 microlitros a los pocillos del uno al 12 de la fila A y a los pocillos del uno al nueve de las filas B y C, con el fin de formar tres ensayos por muestra y tres controles de sustrato. Proceda inmediatamente a registrar la fluorescencia. Lea la fluorescencia inicial inmediatamente después de añadir el sustrato a la microplaca. Después de la lectura, incube la microplaca a temperatura ambiente, bien en la oscuridad o cubierta con una tapa opaca.Para reducir la degradación por luz de MUB. El tiempo de incubación necesario para medir la actividad enzimática potencial máxima dependerá de la concentración de enzima dentro de una muestra. Dado que esta es desconocida, antes de realizar el ensayo de la muestra, será necesario leer una microplaca en múltiples intervalos de tiempo.Para la mayoría de las enzimas, intervalos de 10 a 15 minutos durante el transcurso de una hora son adecuados, aunque algunas muestras con altas concentraciones alcanzarán su pico antes de los 10 minutos. Continúe midiendo la fluorescencia en la microplaca a los intervalos designados durante al menos una hora. Asegúrese de mantener la microplaca cubierta o en la oscuridad entre las lecturas.Para cada muestra en cada intervalo de tiempo, calcule la fluorescencia inicial media de la muestra, la fluorescencia final media de la muestra, la fluorescencia media del patrón y la fluorescencia media del control de apagado para cada intervalo de tiempo. Calcule la actividad enzimática en m por hora por mililitro. Utilice la ecuación que se encuentra en el protocolo del texto.Examine los valores de actividad calculados para cada paso de tiempo y determine la actividad potencial final a partir del paso de tiempo con la actividad más alta. Si los valores de actividad continúan aumentando, puede ser necesario incluir pasos de tiempo posteriores. Si los valores de actividad disminuyen a lo largo de la simulación, repita la corrida con pasos de tiempo más cortos.Los suelos y los sedimentos acuáticos suelen tener niveles apreciables de actividad enzimática extracelular como resultado de comunidades microbianas adheridas que crecen sobre la superficie de partículas. Esta figura muestra cómo cambia esta actividad en función del tamaño de las partículas obtenidas del sedimento superficial de un curso fluvial de tercer orden en el norte de Mississippi, EE. UU. Un estudio previo ha demostrado que las comunidades bacterianas en partículas de sedimento de este arroyo pueden separarse en tres grupos distintos basándose en el análisis molecular de su estructura comunitaria.Aquellos en partículas de 0,063 milímetros, aquellos en partículas de 0,125, 0,25 y 0,5 milímetros y aquellos en partículas de un milímetro. El análisis de los patrones en la actividad de enzimas extracelulares respalda esta conclusión, mostrando que la fosfatasa presenta niveles similares en partículas de 0,125, 0,25 y 0,5 milímetros, pero es mucho más alta en las fracciones de uno y 0,063 milímetros cuando se mide mediante la técnica con sustrato ligado al PNP. Otras enzimas como la beta-glucosidasa y la N-acetilglucosaminidasa muestran picos similares en las partículas más finas, pero no presentan aumentos en las partículas de un milímetro.Destacando el hecho de que diferentes enzimas pueden mostrar distintas distribuciones ambientales, las cuales pueden elucidarse utilizando este ensayo. Las barras de error relativamente bajas indican que los ensayos colorimétricos de actividad enzimática en sedimentos son reproducibles y, por lo tanto, susceptibles de análisis estadístico. Al comparar diferentes muestras ambientales, las aguas naturales tienden a tener menor actividad enzimática extracelular por mililitro que los suelos o sedimentos por gramo.Como tal, se deben analizar métricamente mediante sustratos ligados a MUB. Esta figura muestra cómo la actividad de las enzimas, fosfatasa, beta, glucosidasa y NGAs, varía con la profundidad. En un lago poco profundo del norte de Mississippi, EE. UU., se sabe que el lago es pobre en nutrientes, lo cual también se sugiere por la actividad relativamente alta de la fosfatasa y de la enzima que los microorganismos producen para obtener fosfato a partir de compuestos orgánicos.Para las tres enzimas, las muestras de ensayo recolectadas en la superficie del agua y a una profundidad de 50 centímetros mostraron una actividad similar. Si bien la actividad fue mayor en la muestra de 100 centímetros, esta se tomó esencialmente en la interfaz agua-sedimento, y la presencia de partículas de sedimento en la muestra probablemente explica la mayor actividad observada, especialmente para beta-glucosidasa y n-AGAs. Como ocurre con los sustratos PNP, las pequeñas barras de error indican que, incluso con solo tres lecturas repetidas, la reproducibilidad de los ensayos fluorométricos que utilizan sustratos MUB es alta.Téngase en cuenta que las unidades para la actividad enzimática en muestras de agua están en nanomoles de sustrato consumido, mientras que las de la actividad enzimática en partículas de sedimento están en micromoles de sustrato consumido, aunque el tamaño por unidad sea comparable. Esto resalta el hecho de que los suelos y sedimentos tienden a tener una actividad extracelular mucho mayor que las aguas naturales. También demuestra la mayor sensibilidad de la técnica del sustrato ligado a MUB y la necesidad de utilizar este método para ensayar la actividad enzimática extracelular en muestras de agua una vez dominado el procedimiento.Esta técnica puede utilizarse para analizar nueve muestras de agua para hasta enzimas en poco más de una hora. Al intentar este procedimiento con suelos y sedimentos, es importante utilizar un material de masa conocida para que la actividad pueda expresarse en base al peso seco. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la actividad enzimática extracelular en una variedad de ambientes naturales utilizando técnicas colorimétricas o fluorimétricas.

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Determinación de la actividad enzimática extracelular microbiana en aguas, suelos y sedimentos de los que utilizan y alto rendimiento de microplacas Ensayos (Video) | JoVE Journal

Determinación de la actividad enzimática extracelular microbiana en aguas, suelos y sedimentos de los que utilizan y alto rendimiento de microplacas Ensayos

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