El uso de En vivo Imágenes para controlar la progresión de la infección por citomegalovirus Experimental del ratón en neonatos

El objetivo general de este procedimiento es realizar imágenes in vivo de neonatos de ratón para investigar la diseminación del citomegalovirus luminiscente. Esto se logra preparando primero la dilución adecuada del virus a partir de una solución madre. A continuación, se inyecta a los neonatos el MCMV luminiscente en la cavidad peritoneal.

En momentos posteriores a la inyección. Los cachorros son anestesiados e inyectados con Lucifer antes de la toma de imágenes in vivo. En última instancia, las imágenes in vivo se utilizan para mostrar y cuantificar la replicación y diseminación del virus en la cavidad peritoneal y el sistema nervioso central.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como las filtraciones virales en órganos después de la eutanasia de animales infectados, es que se consume menos tiempo y menos recursos. La demostración del procedimiento estará a cargo Mr.Il Macan, un técnico de mi laboratorio. En el siguiente estudio se utiliza una cepa de MCMV que expresa luciferasa obtenida del laboratorio de Ulrich Kowski.

Para amplificar la cepa, agregue el virus a las células cultivadas en medio libre de suero a 37 grados Celsius. Después de una hora, retire el sobrenadante y reemplácelo con DMEM suplementado con suero de ternera fetal al 10%. Cinco días después, se cosecha el cultivo y las alícuotas se almacenan a menos 80 grados centígrados.

Hasta nuevo uso. Después de valorar la suspensión viral mediante ensayo de placa, diluir la muestra a 50 pfu en 50 microlitros de DMEM y dejar actuar en hielo hasta que se realicen inyecciones listas para usar en neonatos de entre cuatro y 20 horas de edad. Antes de manipular a los cachorros, manipule la camada y las heces con las manos enguantadas.

Para evitar la introducción de olores extraños que podrían estresar a la madre para realizar una inyección de práctica, llene una jeringa de insulina con azul de metileno al 1% diluido en DPBS. Cuando esté listo, sostenga al neonato por la piel dorsal como se ve aquí con el lado ventral hacia arriba. Introduzca la aguja por debajo de las cuatro patas y empújela suavemente por vía subcutánea en la cavidad peritoneal.

Una vez que la punta de la aguja esté en la posición correcta, inyecte el metilo en azul. A continuación, retire lentamente la aguja y limpie la sangre del lugar de la inyección. Regrese el neonato a la jaula de inicio después de la inyección después de una inyección de práctica exitosa, repita este procedimiento con la suspensión viral preparada anteriormente.

Las imágenes se toman siete días después de la inyección, manipulando a los neonatos con cautela como se muestra anteriormente. Inyecte cada uno con una mezcla de anestésicos y Lucifer mientras espera de 12 a 15 minutos Para que el LUCIFERINO alcance su máxima emisión, asegúrese de que la plataforma en la cámara de adquisición del dispositivo de imágenes esté calentada para mantener la temperatura corporal correcta. Después de que los cachorros son anestesiados y marcados para su identificación, están listos para ser colocados en el sistema de imágenes.

En primer lugar, realizar la adquisición de la luz emitida por todo el cuerpo. Dado que el virus se ha replicado en varios órganos diana, la duración de la exposición debe ser corta. Aquí, la adquisición se realiza durante 10 a 20 segundos.

Es útil obtener imágenes de baja resolución de varios animales dentro de una ronda de adquisición, y luego acercar la plataforma para enfocar una parte de un animal en particular o un órgano aislado después de la disección. Para adquirir una señal de luz solo de la cabeza, cubra el resto del cuerpo con un papel grueso y oscuro que enmascare los fotones, realice la adquisición durante cinco a 10 minutos y repita esto para el lado opuesto del animal. En las mismas condiciones.

Después de las imágenes, regrese a los cachorros a una jaula con calefacción para mantener su temperatura corporal mientras están anestesiados. Estas imágenes se tomaron a los días 7, 9, 11 y 14 después de la infección, el título viral general en el animal parece disminuir con el tiempo. En este ejemplo, el cuerpo está cubierto, dejando la cabeza expuesta.

Esto revela una mancha discreta a nivel del oído izquierdo cuya intensidad aumenta entre el día siete y el 14, lo que sugiere que la diseminación de MCMV al cerebro se puede observar dinámicamente in vivo. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la inmunohistoquímica, para responder preguntas adicionales sobre la ubicación precisa del virus en el cerebro.