Name: La manipulación genética del ratón en desarrollo a través de Hipotálamo En el útero La electroporación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Aprende a realizar electroporación in utero en el hipotálamo de embriones de ratón para manipular genes de interés. Este método permite transfectar ADN plasmídico y estudiar la función génica in vivo.

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Este trabajo fue financiado por la Fundación Alemana de Investigación (Deutsche Forschungsgemeinschaft).

1. Preparación de ADN y vidrio Micropipetas para Inyección <ol><li> Buenas micropipetas de vidrio de calidad son esenciales para reducir la velocidad inicial alta aborto debido a la pérdida de líquido amniótico. El procedimiento para sacar micropipetas de vidrio ha sido bien documentado 13,18,25. Use 1,2 mm de diámetro capilares tirado en una convencional Sutter P-97 dispositivo con los ajustes P = 500; calor = 300; Tire = 40; Velocidad = 50; Tiempo = 50. Coloque el extractor de 3 mm filamentos &quot;valle&quot; (Sutter Instrument FT330B). Los filamentos de tamaño de 2 mm han dado para nosotros los resultados menos satisfactorios. Por otro lado, biselado de la micropipeta consejos no parece mejorar los resultados para nosotros. </li><li> Disolver purificada, plásmido de ADN libre de endotoxina en PBS (cultivo celular de grado) que contiene 0,1% Fast Green a una concentración final de 1 a 2 g / l. The Green Fast hará que la solución inyectada visible en el ventrículo del cerebro embrionario. </li><li> Cargar 10 l de la solución de ADN en la micropipeta de vidrio. </li&gt; <li> Conectar la micropipeta de vidrio para el sistema de inyección (Bomba Pico) o pipeta de boca. </li></ol> 2. Anestesia Prepare la mesa de operaciones con una almohadilla eléctrica y los instrumentos quirúrgicos. Encienda las fuentes de luz fría para facilitar la visualización de los embriones. Desinfectar las herramientas quirúrgicas que utilizan, por ejemplo, un cordón esterilizador de vidrio. Tres procedimientos de anestesia son posibles para este protocolo (ver Discusión). Aquí vamos a describir el que consideramos la mejor, usar la inhalación de isoflurano para la inducción de la anestesia (tasa de flujo de 0,5 L / min), así como de mantenimiento (tasa de flujo de 1 l / min). <ol><li> Introducir el ratón embarazada en un pequeño transparente (por lo que el ratón permanece visible) recipiente conectado a la Komesaroff Marcos 5 Anestésico dispositivo por un tramo corto de tubo. </li><li> Llene el vaporizador con isoflurano, a continuación, abra la botella de oxígeno conectado al dispositivo. Sopla una o dos pulsos de isoflUrane / oxígeno (0,5 L / min) en el recipiente que contiene el ratón y el reloj de la narcosis de establecer pulg </li><li> Tome el ratón fuera, cubrir sus ojos con un ungüento para evitar que se sequen y se ajustan a la máscara de anestesia de flujo en la cabeza de inmediato. </li></ol> 3. Laparotomía <ol><li> Coloque el ratón panza arriba sobre el cojín eléctrico (de lo contrario su temperatura corporal bajará muy rápido, disminuyendo las posibilidades de recuperación) y asegurar su cuerpo en su lugar, fijando sus cuatro patas a los lados con cinta adhesiva. Evaluar la profundidad de la anestesia mediante la comprobación de la pérdida de la respuesta a la estimulación refleja (por ejemplo, los pies o el pellizco de la cola con una presión firme). </li><li> Afeitarse la superficie abdominal y desinfectar con el iodophorpovidone-yodo (Braunoderm). </li><li> Hacer una incisión longitudinal (1 a 1,5 cm de largo) sobre la piel abdominal. Luego se corta el peritoneo. Coloque una gasa de algodón alrededor de la incisión. Hacer un cuerno uterino visible y tire de ella con cuidado con unas pinzas romas en la PBS-enjuagado gauze. Enjuague el útero con PBS muy a menudo para mantener siempre humedecido (Figuras 2A y 2B). Durante todo el procedimiento de evitar tirar la mesometrio o el útero apretado, ya que la presión dentro del útero transmitirá al embrión aumenta las posibilidades de pérdida de fluido de la inyección resulta en aborto. </li></ol> 4. Inyección de ADN en el ventrículo cerebral <ol><li> Mantenga el útero de tal manera que los ventrículos del cerebro pueden ser visualizados. No cambiar la posición ampliamente un embrión que se encuentra en una posición desfavorable - esto sólo aumenta las posibilidades de aborto. </li><li> En cuanto a la cabeza del embrión a partir de la parte superior, localizar visualmente el hueco o fisura entre los hemisferios corticales izquierdo y derecho. Los hemisferios son fáciles de distinguir y los ventrículos laterales dentro de ellos (por no ser objetivo) por lo general pueden ser percibidas como formas un tanto oscuras. Si se encuentra un embrión a ser perfectamente orientada para la inyección de ADN (FigurES 2C y 2D), es posible perforar la pared uterina y entran en el tercer ventrículo a la vez. Mantenga la micropipeta de vidrio a 45 ° a la pared uterina y la punción que en el extremo rostral de la brecha entre los hemisferios corticales, penetrando por alrededor de 1 mm. De esta manera, la punta de la micropipeta de vidrio entrará en el tercer ventrículo del cerebro (no el ventrículo lateral) (Figuras 2C y 2D). En embriones de menos orientados favorablemente es útil primero perforar la pared uterina (siempre a 45 °) en la proximidad de la cabeza embrionaria, colocar la punta de la micropipeta en la posición correcta entre los hemisferios corticales y sólo entonces perforar el cerebro. Inyectar aproximadamente 1 l de solución de ADN en el tercer ventrículo (una buena inyección llena el ventrículo con el líquido verde). Repita el mismo procedimiento con todos los embriones de un cuerno uterino. Esto permite algún tiempo para que la solución de ADN para mezclar uniformemente con el fluido del ventrículo y llegar a la entirneuroepitelio correo. </li></ol> 5. Orientación por el hipotálamo para electroporación <ol><li> Cambie el electroporador y ajuste la configuración según la edad embrionaria (por E12.5 usamos 5 pulsos de onda cuadrada, 50 V, 50 ms ON/950 mseg OFF). Uso como polo positivo del electrodo de aguja de acero inoxidable (CUY550-10) y como polo negativo de un electrodo plano y redondo (CUY700P4L). (Es importante que los electrodos son más pequeños que el embrión, ya que de lo contrario la corriente sólo fluye alrededor del embrión, pero no a través de él.) </li><li> Seleccionar para electroporación esos embriones cuya parte dorsal es hacia arriba (es decir, se volvió hacia el experimentador) (ya que la mayoría de ellos lo son), y descartar aquellos cuya orientación no es favorable. Ahora es seguro tocar al útero con los dedos etanol desinfectados o con guantes. Sosteniendo el útero con fórceps, sin embargo, podría interferir con el flujo de corriente durante la electroporación. </li><li> Pierce la pared uterina por la cabeza del embrión entre el amniotic saco y la placenta empujando hacia abajo a través de él con la punta del electrodo de aguja. Utilice el dedo índice de la otra mano, como bloque de empuje. Acerca de 5 mm de la punta del electrodo deben ser ahora entre el saco amniótico y la pared uterina, a aproximadamente el nivel del mesencéfalo (Figuras 2E y 2F). Recuerde que este es el &quot;electrodo de orientación&quot;, por lo que su posición va a determinar qué es lo más probable que se transfectaron parte del neuroepitelio hipotálamo. El embrión tiene que ser muy suavemente &quot;exprimido&quot; entre los electrodos. </li><li> Con la otra mano, la posición del electrodo plano y redondo fuera de la pared del útero en el lado opuesto de la cabeza del embrión (Figuras 2E y 2G). </li><li> Utilice el interruptor de pedal para aplicar tensión (50 V, 50 mseg ON, 950 mseg OFF, 5 pulsos de onda cuadrada). </li><li> Tire lentamente el electrodo de aguja del útero mientras que la celebración posterior del útero con el dedo índice de la otra mano - si amniolíquido tic se pierde a través de la pared perforada, por lo general el embrión será sometido a aborto. Repita el procedimiento con todos los embriones. </li><li> Devuelva el cuerno uterino en el abdomen y repetir la inyección y la electroporación en el cuerno remanente. </li></ol> 6. Para terminar la operación <ol><li> Después de la inyección y la electroporación de todos los embriones, colocar el útero en el abdomen con mucho cuidado, posicionada exactamente como eran antes y húmeda de la cavidad peritoneal con solución salina antes de cerrarlo. </li><li> Suturar el peritoneo con catgut quirúrgico (Vicryl Polyglactin 910, 5-0, Ethicon V4914). Para el cierre de la utilización piel &quot;interrumpió la puntada&quot; methodwith una sutura más resistentes (Supramid Nylon, 6-0, Serag Wiessner A 07171L). </li><li> Desinfectar la superficie del abdomen con povidona yodada (Braunoderm) e inyectar un no-esteroides anti-inflamatorios por vía subcutánea (por ejemplo, 100 l de una solución de 1:10 de Rimadyl en NaCl al 0,9%) o, mejor aún, un opioide como buprenorphine (Temgesic, 0,05 a 0,1 mg / kg de peso corporal en 0,9% NaCl) para aliviar el dolor. </li><li> Retire la madre de la máquina de anestesia y colocarlo en una jaula que es calentada por una resistencia de calentamiento. Supervisar el ratón continuamente hasta que esté completamente recuperado de la anestesia. Más tarde, visita a los animales diariamente para asegurar que se están recuperando de un procedimiento sin ningún signo de infección o dolor. </li></ol> 7. El análisis de los resultados <ol><li> Cosecha de los embriones (o postnatals) de acuerdo con el día de análisis deseado. Ratones postnatales (1 a 2 días de edad) se sacrificaron por decapitación. </li><li> Separar cada embrión de acuerdo con la anotación electroporación anterior. Diseccionar el cerebro bajo un estereomicroscopio y comprobar bajo el microscopio para la señal fluorescente verde (GFP del reportero) en la región apropiada. </li><li> El cerebro seleccionado puede ser analizada &quot;fresco&quot;: fijar el tejido durante un corto período de tiempo en 4% de paraformaldehído y incrustar en agarosa al 4% o en una gelatina-lbumin, a continuación, la sección en un dispositivo de tipo vibratomo (Figura 3). Para el análisis inmunohistoquímico más detallada (Figura 4), ​​crio-proteger el cerebro en solución de sacarosa al 30%, incrustar en medio de montaje (OCT Tissue Tek) luego se corta secciones 20 micras en un criostato. </li></ol>

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<li>Xin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+targeting+mechanism+of+Angiopep-conjugated+poly%28ethylene+glycol%29-co-poly%28epsilon-caprolactone%29+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles.</a> Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+for+stable+expression+of+foreign+genes+in+mammalian+cells+by+use+of+the+untranslated+leader+sequence+from+EMC+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus.</a> Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Londrigan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+promoters+for+driving+efficient+transgene+expression+in+neonatal+porcine+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets.</a> Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acerca de la anestesia: Desde electroporación en el útero en el hipotálamo puede ser técnicamente difícil y requerir tiempos más largos narcosis, preferimos para inducir y mantener la anestesia mediante la administración de una mezcla de oxígeno e isoflurano. En nuestra experiencia, los animales se mantienen adecuadamente anestesiado de esta manera por períodos de hasta una hora por lo menos, la recuperación de la madre es muy rápido, y la supervivencia de los embriones mejorar. Otros enfoques para la anestesia...

La manipulación genética del cerebro de ratón embrionario es un enfoque preferido para aprender acerca de la regulación del desarrollo. La generación de líneas de ratones mutantes sin embargo, es lento y caro. Un método poderoso para introducir cambios genéticos específicos en el desarrollo de las neuronas del cerebro de mamífero es la electroporación en el útero. Esencialmente, la técnica consiste en transfectar ADN en el neuroepitelio embrionario del cerebro por medio de impulsos eléctricos, a continuación, permitiendo que el embrión para sobrevivir durante un cierto período de tiempo, recoger el cerebro y examinarlas para su posible novela, fenotipos informativos. De esta manera, el experimentador puede probar hipótesis casi de inmediato y sin los largos períodos de espera necesarios para la producción de mutantes de ratón. La transfección de ADN en embriones en desarrollo se inició con la electroporación in ovo en embriones de pollo 1. La prueba de concepto esencial para el ratón se realizó en la cultura <shasta&gt; 2. Esto fue seguido por las primeras descripciones de la técnica en el ratón en el útero 3,4. El principal problema es para transfectar el cerebro en desarrollo de los embriones en el útero sin matarlos o de la madre. Aprender a realizar la cirugía necesaria (laparotomía, inyección, electroporación) requiere un largo periodo de entrenamiento. Una vez que la cirugía ha sido dominado hasta el punto en que la tasa de supervivencia embrionaria es aceptable, la pregunta clave es: ¿qué estructuras cerebrales son accesibles? No es sorprendente que los primeros trabajos publicados que muestran los resultados obtenidos con la electroporación in utero se centraron en el desarrollo cortical 5-9. Esto sigue siendo cierto para la mayoría de las publicaciones utilizando esta técnica, ya que la región del cerebro de ratón en desarrollo más accesible a los procedimientos quirúrgicos es la corteza (Figura 1). El procedimiento para la electroporación en el útero en la corteza ha sido descritaen la prensa 10 y 11 a 14 en el vídeo. Una modificación de la técnica se puede utilizar para tratar una parte ventral del telencéfalo, los ganglios basales 15. Más allá del telencéfalo, el diencéfalo (clásicamente dividido en tálamo y el hipotálamo) es una región del cerebro anterior más difícil de alcanzar. Un pequeño número de documentos de informes dirigidos a su parte dorsal y más accesible, el tálamo 16-19. El hipotálamo es la parte más ventral del cerebro anterior, por lo tanto, el uno localizada más profundamente a partir de la superficie dorsal (corteza) (Figura 1). Esta región sigue siendo un reto difícil para los investigadores comprometidos para manipular genéticamente el cerebro del ratón en el útero. Hasta donde sabemos, sólo muy pocos artículos informen sobre los resultados de la transfección útero en el hipotálamo de ratón 20,21. Sin embargo, la importancia funcional del hipotálamo Cañot ser exagerada, ya que regula los comportamientos como comer y beber, el apareamiento, la reproducción y crianza de los hijos 22. Por otra parte, las alteraciones en el desarrollo hipotalámico contribuyen a originar más adelante en las condiciones de vida como la obesidad, la hipertensión, la diabetes y la pubertad precoz 23. Ser capaz de alterar genéticamente el hipotálamo durante el desarrollo sería una herramienta muy poderosa para entenderlo. El protocolo quirúrgico básico para la laparotomía de ratones embarazadas que usamos aquí es similar a la utilizada en otros protocolos 11,13,14,24. Vamos a describir aquí brevemente para completar. Clave para nuestro procedimiento, por otro lado, son del tipo de anestesia, el lugar de la inyección, el tipo de electrodos y la inserción y la posición del electrodo positivo con respecto a la cabeza del embrión. Nosotros preferimos para inducir y mantener la anestesia por inhalación de gas sobre la anestesia intraperitoneal sencilla, ya que el primero permite laperíodos algo más largos de la narcosis necesarios para una cirugía difícil. Resultados inhalación isoflurano en la recuperación más rápida de la anestesia, ya que por lo general la madre demuestra un comportamiento normal ya minutos después de la cirugía. El punto más fácil de la inyección de la solución de ADN con la micropipeta de vidrio es el ventrículo lateral, que sin embargo es completamente inadecuado para la electroporación hipotálamo. Inyección directa en el tercer ventrículo es de hecho fundamental orientar la diencephalic estructuras profundas. Es posible transfectar del hipotálamo o de E12.0 E12.5 con electrodos estándar, off-the-shelf. Hemos encontrado algunos de los electrodos fabricados por Nepa Gene (Chiba, Japón) particularmente adecuado para este propósito. Con nuestro procedimiento se obtiene la transfección de todo el neuroepitelio hipotalámica o, transfección regional parcial dependiendo de la orientación del electrodo. Aquí se demuestra la técnica mediante la transfección del cuerpo mammillary, podría decirse quela más profunda y rebajada de todos los núcleos hipotalámicos. Además, se muestra el análisis histológico detallado de las células transfectadas hacia abajo hasta el nivel celular de la resolución. Una comparación de la electroporación en el útero con otros enfoques para transfectar el cerebro en desarrollo en el útero del ratón se puede encontrar en la sección de Discusión.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><fuerte>REACTIVOS</fuerte></td></tr><tr><td>Acepromazina</td><td>Sanofi GmbH</td><td></td><td>anestésico</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter</td><td>HDG9623</td><td>anestésico</td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Pharma GmbH</td><td></td><td>anestésico</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Fluka</td><td>44715</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rimadyl</td><td>Pfizer</td><td></td><td>antiinflamatorio no esteroideo</td></tr><tr><td>Braunoderm</td><td>Braun</td><td>3887138</td><td>povidona yodada</td></tr><tr><td>Tampón de fosfato solución salina PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Temgesic (buprenorfina)</td><td>Essex Pharma</td><td></td><td>analgésico opioide</td></tr><tr><td>ungüento para los ojos</td><td>Pan-Ophtal</td><td>7136926</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Bayer</td><td></td> <td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><EQUIPO > FUERTE</dispositivo ></td></tr> <tr><td>anestesia fuerte Komesaroff Mark-5</td><td>Medical Developments Australia</td><td>ACN 004 903 682</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tirador capilar P-97</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td> <td>y nbsp;</td></tr><tr><td>Compresstoma</td><td>Precisionary Instr.</td><td>VF-300</td><td>Dispositivo tipo vibrátomo</td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica CM3050S</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Electroporador</td><td>Nepa Gene Co., Ltd.</td><td>CUY21EDIT</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Electrodo 1</td><td>Nepa Gene Co., Ltd.</td><td>CUY550-10</td><td>Electrodo de aguja de acero inoxidable, punta de 10 mm, 0,5 mm de diámetro.</td></tr><tr><td>Electrodo 2</td><td>Nepa Gene Co., Ltd.</td><td>CUY700P4L</td><td>Cubierta Redonda Placa de Platino de 4 mm de diámetro</td></tr><tr><td>Fibra óptica fuente de luz fría</td><td>Leica</td><td>KL2500 LCD</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio</td><td>Aparato Harvard</td><td>GC120T-15</td><td>1. 2 mm de diámetro exterior x 0. 94 mm de diámetro interno</td></tr><tr><td>Esterilizador de perlas de vidrio</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST250</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Harvard Apparatus</td><td>py872-5272</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dispositivo de inyección</td><td>World Precision Instruments</td><td>Pneumatic Pico Pump PV820</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sutura de sutura recubierta de hilo Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>V4914</td><td>Sutura de sutura peritoneal</td></tr><tr><td>Thr. Supramid</td><td>Serag Wiessner</td><td>TO07171L</td><td>sutura cutánea</td></tr></tbody></table>

la manipulación genética del ratón en desarrollo a través de hipotálamo<em&gt; en el útero</em&gt; la electroporación

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

La modificación genética de regiones específicas del cerebro de los mamíferos es el desarrollo de un enfoque experimental muy potente. Sin embargo, la generación de nuevos mutantes de ratón suele ser lento y frustrante. Se ha demostrado que el acceso al cerebro de ratón en desarrollo en el útero con la supervivencia post-operatoria razonable es posible. Sin embargo, los resultados de este procedimiento se han reportado casi exclusivamente para la parte más superficial y de fácil acceso del cerebro en desarrollo, es decir, la corteza. El tálamo, una región más estrecha y más medial, ha resultado más difícil objetivo. Transfección en los núcleos más profunda, especialmente aquellos del hipotálamo, es quizás los resultados más difíciles y por lo tanto, muy pocos han sido reportados. Aquí se demuestra un procedimiento para orientar todo el neuroepitelio hipotalámica o parte de él (regiones hipotalámicas) para la transfección por medio de electroporación. Las claves de nuestro enfoque ya narcosis tiempos, inyección en el third ventrículo, y amable y la colocación de los electrodos apropiados. Además, mostramos los resultados de la focalización y el posterior análisis histológico del núcleo hipotalámico más rebajada, el cuerpo mamilares.

La mayoría de las neuronas del hipotálamo nacen entre E11.5 a E15.2, según el análisis de nacimiento-dating en la rata 26 traducido en el desarrollo de algo más corta ratón 27,28. El pico de la neurogénesis hipotálamo se alcanza a E12.5 29-31. En consecuencia, a la edad de transfección elegido para el presente estudio (E12.5), una gran proporción de neuronas hipotalámicas puede ser etiquetado en cualquier nivel rostro-caudal dado. Análisis en E18.5 en seccion...

A pesar de la importancia clínica y funcional del hipotálamo,<em&gt; En el útero</em&gt; Manipulación genética de su desarrollo rara vez se ha intentado. Te mostramos un procedimiento detallado para<em&gt; En el útero</em&gt; Electroporación en el hipotálamo del ratón y muestran resultados representativos de transfección hipotálamo total y parcial (regional).

La manipulación genética del ratón en desarrollo a través de Hipotálamo<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

El objetivo general de este procedimiento es transfectar ADN plasmídico en el hipotálamo de embriones de ratón en desarrollo intrauterino con el fin de activar o represar la función de un gen de interés. Esto se logra primero anestesiando al ratón preñado y exponiendo el útero mediante laparotomía. El segundo paso consiste en inyectar la solución de ADN en el tercer ventrículo del cerebro embrionario.A continuación, el electrodo positivo se coloca dentro del útero entre la placenta y la cabeza embrionaria. El electrodo negativo se sitúa en la superficie uterina externa y se aplican pulsos eléctricos. El paso final consiste en extraer los cerebros embrionarios transfectados seis días después.Finalmente, se utiliza microscopía de fluorescencia para analizar las alteraciones fenotípicas de las células transfectadas, número, forma, posición, expresión de marcadores, et cetera. Las principales ventajas de esta técnica frente a métodos existentes como la transfección viral son, en primer lugar, que no requiere precauciones especiales, y en segundo lugar, que es posible dirigirse a una región específica. Y en tercer lugar, con la electroforesis Ute, el cribado de genes candidatos es más rápido.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque inyectar la solución de ADN en el tercer ventrículo y colocar adecuadamente el electrodo de aguja requiere una destreza manual avanzada junto con cierta experiencia. Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo del desarrollo hipotalámico, particularmente aquellas relacionadas con la migración celular, así como con la especificación genética de regiones y núcleos individuales. Comience este procedimiento estirando algunas micropipetas de vidrio de buena calidad, ya que son esenciales para reducir la alta tasa inicial de abortos provocados por la pérdida de líquido amniótico.Para preparar el ADN, disuelva el ADN plasmático purificado libre de endotoxinas en PBS que contenga 0,1 % de verde rápido hasta una concentración final de uno a dos microgramos por microlitro. El verde rápido hará que la solución inyectada sea visible en el ventrículo cerebral embrionario. A continuación, cargue 10 microlitros de la solución de ADN en la micropipeta de vidrio.Luego conecte la micropipeta de vidrio al sistema de inyección o a una pipeta bucal. En este paso, prepare la mesa quirúrgica con una almohadilla calefactora y los instrumentos quirúrgicos. Encienda las fuentes de luz fría para facilitar la visualización de los embriones. A continuación, desinfecte los instrumentos quirúrgicos utilizando un esterilizador de perlas de vidrio.A continuación, anestesie un ratón preñado con isoflurano. Después de anestesiar al ratón, aplique una pomada en sus ojos para prevenir el secado. Posteriormente, coloque la máscara sobre su cara para mantener la anestesia de forma continua.Ahora coloque al ratón sobre una almohadilla calefactora con el vientre hacia arriba. Sujete su cuerpo en su lugar fijando sus cuatro extremidades con cinta adhesiva. Asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado pellizcando su cola para comprobar el reflejo de retroceso.Luego afeite la superficie abdominal y desinféctela con solución de yodo. Realice una incisión longitudinal de aproximadamente uno a un centímetro y medio de largo en la piel abdominal. Posteriormente, corte el peritoneo.A continuación, coloque gasa de algodón alrededor de la incisión. Enjuague la gasa con PBS. Exponga un cuerno uterino sacándolo cuidadosamente con pinzas romas.Evite tirar fuertemente del miometrio o del útero. Dado que una presión elevada dentro del útero aumentará las probabilidades de pérdida de líquido embrionario durante la inyección, lo que puede provocar un aborto. Luego, coloque el cuerno uterino sobre una gasa enjuagada con PBS y enjuáguelo con PBS cada pocos minutos para mantenerlo húmedo.Ahora, bajo el microscopio, sostenga el útero de manera que puedan visualizarse los ventrículos cerebrales. No reubique extensamente el embrión que se encuentra en una posición desfavorable. Esto solo aumenta las probabilidades de aborto.Observe la cabeza del embrión desde arriba para localizar la separación donde se encuentra la fisura entre los hemisferios corticales izquierdo y derecho. Los hemisferios son fáciles de distinguir, y los ventrículos laterales en su interior suelen percibirse como formas ligeramente más oscuras. Si se encuentra un embrión perfectamente orientado para la inyección de ADN, es posible atravesar la pared uterina e introducirse directamente en el tercer ventrículo.Sujete la micropipeta de vidrio con el ADN preparado previamente a 45 grados respecto a la pared uterina y punzóquela en el extremo rostral de la fisura interhemisférica, penetrando aproximadamente un milímetro de profundidad. De este modo, la punta de la micropipeta de vidrio entrará en el tercer ventrículo del cerebro y no en el ventrículo lateral. Después inyecte aproximadamente un microlitro de solución de ADN en el tercer ventrículo; en una inyección correcta, el líquido verde llenará el ventrículo. Repita el mismo procedimiento con todos los embriones del mismo cuerno uterino.Esto permitirá que la solución de ADN se mezcle uniformemente con el líquido ventricular y alcance todo el neuroepitelio. Ahora encienda el electroperforador y ajuste la configuración según la edad embrionaria. Utilice la aguja de acero inoxidable como polo positivo y el electrodo redondo plano como polo negativo; seleccione los embriones con el lado dorsal hacia arriba para la electroporación.Luego, atraviese la pared uterina junto a la cabeza del embrión, entre el saco amniótico y la placenta, introduciendo hacia abajo la punta del electrodo de aguja a través de ella. A continuación, utilice el dedo índice de la otra mano como punto de apoyo para el empuje. Aproximadamente cinco milímetros de la punta del electrodo deben quedar entre el saco amniótico y la pared uterina, a la altura del mesencéfalo.Dado que este es el electrodo de localización, su posición determinará qué parte del neuroepitelio hipotalámico es más probable que se transficte. A continuación, coloque el electrodo redondo y plano fuera de la pared uterina, en el lado opuesto a la cabeza del embrión, con la otra mano. Luego, presione suavemente al embrión entre los electrodos.Utilice el interruptor de pedal para aplicar voltaje. Después, retire lentamente la aguja electrodo del útero mientras sostiene el útero con el dedo índice de la otra mano. Si se pierde líquido amniótico a través de la pared perforada, por lo general el embrión sufrirá un aborto.Después de la inyección y la electroporación de todos los embriones, coloque el útero nuevamente en el abdomen del ratón con mucha precaución y colóquelo exactamente como estaba antes. Luego humedezca la cavidad peritoneal con solución salina antes de cerrarla. Suture el peritoneo con hilo de catgut quirúrgico y luego suture la piel con un hilo más resistente.Desinfecte la superficie del abdomen con solución de yodo e inyecte un antiinflamatorio no esteroideo por vía subcutánea para aliviar el dolor. A continuación, retire a la madre del equipo de anestesia y colóquela en una jaula calentada con una almohadilla térmica. Observe al ratón hasta que se recupere completamente de la anestesia y revíselo diariamente para asegurarse de que se está recuperando del procedimiento sin signos de infección ni dolor.En este paso, recolecte los embriones o animales posnatales según el día deseado de análisis. Seleccione los embriones que fueron inyectados con ADN y electroporados, y diseque los cerebros bajo este microscopio estereoscópico. Luego, verifique la presencia de señal fluorescente verde en la región adecuada.Para analizar el cerebro del embrión seleccionado, fije el tejido durante un breve tiempo en paraformaldehído al 4%. A continuación, incruste el tejido en agar al 4% o en albúmina de gelatina. Luego, corte el cerebro en el vibrátomo.Estas figuras muestran el hipotálamo tras la transfección in utero de ADN plasmídico, portador de genes reporteros fluorescentes, GFP o CFP, en el día E 12.5. Esta es una sección sagital que muestra un hipotálamo transfectado desde la región rostral hasta la caudal, y aquí se observa la sección transversal con las células marcadas a diferentes niveles a lo largo del eje medial-lateral. Esta sección sagital muestra un cuerpo mamilario específicamente transfectado y la marcación de su característico árbol axonal, y en el lado electro parado de esta sección transversal se observa una banda marcada que corresponde a neuronas nacidas en el día E 12.5.Para analizar más detenidamente las secciones, se prepararon secciones horizontales paralelas al plano de los procesos gliales radiales que emergen del receso mamilario. Las neuronas ambi O nacidas del neuroepitelio transfectado el día E 12,5 fueron identificadas el día E 18,5 mediante anticuerpos contra GFP.En este ejemplo, el anticuerpo marcó un grupo restringido de células del MBO. Este grupo se localizó entre dos áreas laterales y mediales del MBO sin marcar, correspondientes a neuronas del MBO nacidas antes y después del día 12,5 de desarrollo embrionario (E 12,5), y la tinción doble con un anticuerpo contra nestina. En rojo se muestra el modo de migración de neuronas individualmente marcadas a lo largo de los procesos gliales radiales del neuroepitelio. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 30 minutos si se lleva a cabo correctamente.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inyectar el ADN en el tercer ventrículo y cómo colocar la aguja como electrodo positivo entre el embrión, la cabeza y la placenta para dirigirse eficazmente al hipotálamo. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como inmunohistoquímica o hibridación in situ para responder preguntas adicionales sobre el fenotipo de las neuronas transfectadas.

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Aquí presentamos un protocolo que proporciona una herramienta para examinar los mecanismos reguladores de genes específicos durante el desarrollo del hipocampo. El empleo de la electroporación ex útero y el cultivo de cortes organotípicos permite la regulación hacia arriba y hacia abajo de la expresión de genes de interés en células individuales y seguir su destino durante el desarrollo.

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Este protocolo describe en detalle cómo transfectar específicamente diferentes regiones en el sistema nervioso central C57BL/6 a través de la electroporación en el útero. En este protocolo se incluyen instrucciones detalladas para las transfecciones de regiones que se desarrollan en la corteza, el hipocampo, el tálamo, el hipotálamo, el núcleo septal lateral y el cuerpo estriado.

Específica Striatum Cortex, hipocampo, Thalamus-, hipotálamo, núcleo-septal lateral y<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporación en el ratón C57BL / 6

El papel de los genes recientemente descubiertos asociados a la enfermedad en la patogénesis de los trastornos neuropsiquiátricos sigue siendo oscuro. Una técnica bilateral modificada de electroporación de útero permite la transferencia de genes en grandes poblaciones de neuronas y el examen de los efectos causales de los cambios de expresión génica en el comportamiento social.

Un gasoducto que utiliza la electroporación bilateral en Utero para interrogar influencias genéticas en el comportamiento de los roedores

En este protocolo, describimos cómo inyectar lentivirus la cavidad amniótica del ratón en E7.5, lo que lleva a una transducción uniforme de toda la placa neural, con efectos perjudiciales mínimos sobre la supervivencia o el desarrollo embrionario.

Focalización de la placa neural murina mediante nanoinyección in utero (NEPTUNE) en el día embrionario 7.5

Aprende a realizar electroporación in utero en el hipotálamo de embriones de ratón para manipular genes de interés. Este método permite transfectar ADN plasmídico y estudiar la función génica in vivo.

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