La manipulación genética del ratón en desarrollo a través de Hipotálamo

El objetivo general de este procedimiento es transfectar ADN plasmídico en el hipotálamo de embriones de ratón en desarrollo intrauterino con el fin de activar o represar la función de un gen de interés. Esto se logra primero anestesiando al ratón preñado y exponiendo el útero mediante laparotomía. El segundo paso consiste en inyectar la solución de ADN en el tercer ventrículo del cerebro embrionario.

A continuación, el electrodo positivo se coloca dentro del útero entre la placenta y la cabeza embrionaria. El electrodo negativo se sitúa en la superficie uterina externa y se aplican pulsos eléctricos. El paso final consiste en extraer los cerebros embrionarios transfectados seis días después.

Finalmente, se utiliza microscopía de fluorescencia para analizar las alteraciones fenotípicas de las células transfectadas, número, forma, posición, expresión de marcadores, et cetera. Las principales ventajas de esta técnica frente a métodos existentes como la transfección viral son, en primer lugar, que no requiere precauciones especiales, y en segundo lugar, que es posible dirigirse a una región específica. Y en tercer lugar, con la electroforesis Ute, el cribado de genes candidatos es más rápido.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque inyectar la solución de ADN en el tercer ventrículo y colocar adecuadamente el electrodo de aguja requiere una destreza manual avanzada junto con cierta experiencia. Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo del desarrollo hipotalámico, particularmente aquellas relacionadas con la migración celular, así como con la especificación genética de regiones y núcleos individuales. Comience este procedimiento estirando algunas micropipetas de vidrio de buena calidad, ya que son esenciales para reducir la alta tasa inicial de abortos provocados por la pérdida de líquido amniótico.

Para preparar el ADN, disuelva el ADN plasmático purificado libre de endotoxinas en PBS que contenga 0,1 % de verde rápido hasta una concentración final de uno a dos microgramos por microlitro. El verde rápido hará que la solución inyectada sea visible en el ventrículo cerebral embrionario. A continuación, cargue 10 microlitros de la solución de ADN en la micropipeta de vidrio.

Luego conecte la micropipeta de vidrio al sistema de inyección o a una pipeta bucal. En este paso, prepare la mesa quirúrgica con una almohadilla calefactora y los instrumentos quirúrgicos. Encienda las fuentes de luz fría para facilitar la visualización de los embriones. A continuación, desinfecte los instrumentos quirúrgicos utilizando un esterilizador de perlas de vidrio.

A continuación, anestesie un ratón preñado con isoflurano. Después de anestesiar al ratón, aplique una pomada en sus ojos para prevenir el secado. Posteriormente, coloque la máscara sobre su cara para mantener la anestesia de forma continua.

Ahora coloque al ratón sobre una almohadilla calefactora con el vientre hacia arriba. Sujete su cuerpo en su lugar fijando sus cuatro extremidades con cinta adhesiva. Asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado pellizcando su cola para comprobar el reflejo de retroceso.

Luego afeite la superficie abdominal y desinféctela con solución de yodo. Realice una incisión longitudinal de aproximadamente uno a un centímetro y medio de largo en la piel abdominal. Posteriormente, corte el peritoneo.

A continuación, coloque gasa de algodón alrededor de la incisión. Enjuague la gasa con PBS. Exponga un cuerno uterino sacándolo cuidadosamente con pinzas romas.

Evite tirar fuertemente del miometrio o del útero. Dado que una presión elevada dentro del útero aumentará las probabilidades de pérdida de líquido embrionario durante la inyección, lo que puede provocar un aborto. Luego, coloque el cuerno uterino sobre una gasa enjuagada con PBS y enjuáguelo con PBS cada pocos minutos para mantenerlo húmedo.

Ahora, bajo el microscopio, sostenga el útero de manera que puedan visualizarse los ventrículos cerebrales. No reubique extensamente el embrión que se encuentra en una posición desfavorable. Esto solo aumenta las probabilidades de aborto.

Observe la cabeza del embrión desde arriba para localizar la separación donde se encuentra la fisura entre los hemisferios corticales izquierdo y derecho. Los hemisferios son fáciles de distinguir, y los ventrículos laterales en su interior suelen percibirse como formas ligeramente más oscuras. Si se encuentra un embrión perfectamente orientado para la inyección de ADN, es posible atravesar la pared uterina e introducirse directamente en el tercer ventrículo.

Sujete la micropipeta de vidrio con el ADN preparado previamente a 45 grados respecto a la pared uterina y punzóquela en el extremo rostral de la fisura interhemisférica, penetrando aproximadamente un milímetro de profundidad. De este modo, la punta de la micropipeta de vidrio entrará en el tercer ventrículo del cerebro y no en el ventrículo lateral. Después inyecte aproximadamente un microlitro de solución de ADN en el tercer ventrículo; en una inyección correcta, el líquido verde llenará el ventrículo. Repita el mismo procedimiento con todos los embriones del mismo cuerno uterino.

Esto permitirá que la solución de ADN se mezcle uniformemente con el líquido ventricular y alcance todo el neuroepitelio. Ahora encienda el electroperforador y ajuste la configuración según la edad embrionaria. Utilice la aguja de acero inoxidable como polo positivo y el electrodo redondo plano como polo negativo; seleccione los embriones con el lado dorsal hacia arriba para la electroporación.

Luego, atraviese la pared uterina junto a la cabeza del embrión, entre el saco amniótico y la placenta, introduciendo hacia abajo la punta del electrodo de aguja a través de ella. A continuación, utilice el dedo índice de la otra mano como punto de apoyo para el empuje. Aproximadamente cinco milímetros de la punta del electrodo deben quedar entre el saco amniótico y la pared uterina, a la altura del mesencéfalo.

Dado que este es el electrodo de localización, su posición determinará qué parte del neuroepitelio hipotalámico es más probable que se transficte. A continuación, coloque el electrodo redondo y plano fuera de la pared uterina, en el lado opuesto a la cabeza del embrión, con la otra mano. Luego, presione suavemente al embrión entre los electrodos.

Utilice el interruptor de pedal para aplicar voltaje. Después, retire lentamente la aguja electrodo del útero mientras sostiene el útero con el dedo índice de la otra mano. Si se pierde líquido amniótico a través de la pared perforada, por lo general el embrión sufrirá un aborto.

Después de la inyección y la electroporación de todos los embriones, coloque el útero nuevamente en el abdomen del ratón con mucha precaución y colóquelo exactamente como estaba antes. Luego humedezca la cavidad peritoneal con solución salina antes de cerrarla. Suture el peritoneo con hilo de catgut quirúrgico y luego suture la piel con un hilo más resistente.

Desinfecte la superficie del abdomen con solución de yodo e inyecte un antiinflamatorio no esteroideo por vía subcutánea para aliviar el dolor. A continuación, retire a la madre del equipo de anestesia y colóquela en una jaula calentada con una almohadilla térmica. Observe al ratón hasta que se recupere completamente de la anestesia y revíselo diariamente para asegurarse de que se está recuperando del procedimiento sin signos de infección ni dolor.

En este paso, recolecte los embriones o animales posnatales según el día deseado de análisis. Seleccione los embriones que fueron inyectados con ADN y electroporados, y diseque los cerebros bajo este microscopio estereoscópico. Luego, verifique la presencia de señal fluorescente verde en la región adecuada.

Para analizar el cerebro del embrión seleccionado, fije el tejido durante un breve tiempo en paraformaldehído al 4%. A continuación, incruste el tejido en agar al 4% o en albúmina de gelatina. Luego, corte el cerebro en el vibrátomo.

Estas figuras muestran el hipotálamo tras la transfección in utero de ADN plasmídico, portador de genes reporteros fluorescentes, GFP o CFP, en el día E 12.5. Esta es una sección sagital que muestra un hipotálamo transfectado desde la región rostral hasta la caudal, y aquí se observa la sección transversal con las células marcadas a diferentes niveles a lo largo del eje medial-lateral. Esta sección sagital muestra un cuerpo mamilario específicamente transfectado y la marcación de su característico árbol axonal, y en el lado electro parado de esta sección transversal se observa una banda marcada que corresponde a neuronas nacidas en el día E 12.5.

Para analizar más detenidamente las secciones, se prepararon secciones horizontales paralelas al plano de los procesos gliales radiales que emergen del receso mamilario. Las neuronas ambi O nacidas del neuroepitelio transfectado el día E 12,5 fueron identificadas el día E 18,5 mediante anticuerpos contra GFP.

En este ejemplo, el anticuerpo marcó un grupo restringido de células del MBO. Este grupo se localizó entre dos áreas laterales y mediales del MBO sin marcar, correspondientes a neuronas del MBO nacidas antes y después del día 12,5 de desarrollo embrionario (E 12,5), y la tinción doble con un anticuerpo contra nestina. En rojo se muestra el modo de migración de neuronas individualmente marcadas a lo largo de los procesos gliales radiales del neuroepitelio. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 30 minutos si se lleva a cabo correctamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inyectar el ADN en el tercer ventrículo y cómo colocar la aguja como electrodo positivo entre el embrión, la cabeza y la placenta para dirigirse eficazmente al hipotálamo. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como inmunohistoquímica o hibridación in situ para responder preguntas adicionales sobre el fenotipo de las neuronas transfectadas.