La manipulación genética del ratón en desarrollo a través de Hipotálamo En el útero La electroporación

El objetivo general de este procedimiento es transfectar el ADN plasmático en el hipotálamo de embriones de ratón que se desarrollan en el útero con el fin de activar o reprimir la función de un gen de interés. Esto se logra anestesiando primero a la rata embarazada y exponiendo el útero a través de la laparotomía. El segundo paso es inyectar la solución de ADN en el tercer ventrículo del cerebro embrionario.

A continuación, el electrodo positivo se coloca dentro del útero entre la placenta y la cabeza del embrión. El electrodo negativo se coloca en la superficie uterina externa y se aplican pulsos eléctricos. El paso final es extraer los cerebros embrionarios transfectados seis días después.

En última instancia, la microscopía de fluorescencia se utiliza para analizar las alteraciones fenotípicas de las células transfectadas, el número, la forma, la posición, la expresión de marcadores, etc. Las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes, como la transfección viral, son, en primer lugar, que no requiere precauciones especiales y, como dos instalaciones, es posible dirigirse a una región específica. Y en tercer lugar, con la electroporación de Ute, el cribado de genes candidatos es más rápido.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque inyectar la solución de ADN en el tercer ventrículo y colocar el electrodo de aguja correctamente requiere un sesgo manual avanzado junto con cierta experiencia. Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo del desarrollo hipotalámico, particularmente aquellas relevantes para la migración celular, así como cómo se especifican genéticamente las regiones individuales y el núcleo. Comience este procedimiento extrayendo algunas micropipetas de vidrio de buena calidad, ya que son esenciales para reducir la alta tasa de aborto inicial debido a la pérdida de líquido amniótico.

Para preparar el ADN, disuelva el ADN plasmático libre de endotoxinas purificado en PBS que contiene 0.1% de verde rápido hasta una concentración final de uno a dos microgramos por microlitro. El verde rápido hará que la solución inyectada sea visible en el ventrículo cerebral embrionario. A continuación, cargue 10 microlitros de la solución de ADN en la micropipeta de vidrio.

A continuación, conecte la micropipeta de vidrio al sistema de inyección o a una pipeta bucal. En este paso, prepare la mesa quirúrgica con una almohadilla térmica y el instrumental quirúrgico Encienda las fuentes de luz fría para facilitar la visualización de los embriones. A continuación, desinfecte los instrumentos quirúrgicos con un esterilizador de perlas de vidrio.

A continuación, anestesia a una rata embarazada con isde flúor. Después de que el ratón haya sido anestesiado, aplique ungüento en sus ojos para evitar que se seque. Posteriormente se le coloca la mascarilla en la cara para mantener la anestesia de forma continua.

Ahora coloque el mouse en una almohadilla térmica con la panza hacia arriba. Asegure su cuerpo en su lugar fijando sus cuatro extremidades con cinta adhesiva. Asegúrate de que el ratón esté completamente anestesiado pellizcando su cola para el reflujo.

A continuación, afeitar la superficie abdominal y desinfectarla con una solución de yodo. Haga una incisión longitudinal de aproximadamente uno a un centímetro y medio de largo en la piel abdominal. Después, corta el peritoneo.

A continuación, coloque una gasa de algodón alrededor de la incisión. Enjuague la gasa con PBS. Exponga un cuerno uterino tirando de él con cuidado con pinzas romas.

Evite tensar el miometrio o el útero. Ya que la alta presión dentro del útero aumentará las posibilidades de pérdida de líquido embrionario tras la inyección, lo que resulta en un aborto. Luego, coloque el cuerno uterino sobre una gasa enjuagada con PBS y enjuáguelo con PBS cada pocos minutos para mantenerlo humedecido.

Ahora, bajo el microscopio, sostenga el útero de tal manera que se puedan visualizar los ventrículos cerebrales. No reposicione extensamente el embrión que se encuentra en una posición desfavorable. Esto solo aumenta las posibilidades de aborto.

Observe la cabeza del embrión desde la parte superior para ubicar el espacio donde se encuentra la fisura entre los hemisferios corticales izquierdo y derecho. Los hemisferios son fáciles de distinguir, y los ventrículos laterales dentro de ellos generalmente se pueden percibir como formas algo más oscuras. Si se descubre que un embrión está perfectamente orientado para la inyección de ADN, es posible perforar la pared uterina y entrar en el tercer ventrículo de una vez.

Sostenga la micropipeta de vidrio con el ADN preparado anteriormente a 45 grados de la pared uterina y punciónela en el extremo rostral de la fisura interhemisférica, penetrando hasta aproximadamente un milímetro de profundidad. De esta forma, la punta de la micropipeta de vidrio entrará en el tercer ventrículo del cerebro y no en el ventrículo lateral. Después de inyectar aproximadamente un microlitro de solución de ADN en el tercer ventrículo, el líquido verde llenará el ventrículo en una buena inyección, repita el mismo procedimiento con todos los embriones del mismo cuerno uterino.

Esto permitirá que la solución de ADN se mezcle uniformemente con el líquido ventricular y llegue a todo el epitelio neurológico. Ahora encienda el electro perter y ajuste la configuración de acuerdo con la edad embrionaria. Utilice el electrodo de aguja de acero inoxidable como polo positivo y el electrodo plano redondo como polo negativo, seleccione los embriones con el lado dorsal hacia arriba para la electroporación.

A continuación, perfore la pared uterina junto a la cabeza del embrión entre el saco amniótico y la placenta empujando la punta del electrodo de la aguja hacia abajo a través de él. A continuación, utiliza el dedo índice de la otra mano como bloque de empuje. Unos cinco milímetros de la punta del electrodo deben estar entre el saco amniótico y la pared uterina, aproximadamente al nivel del mesencéfalo.

Como este es el electrodo dirigido, su posición determinará qué parte del neuroepitelio hipotalámico tiene más probabilidades de transfectarse. A continuación, coloque el electrodo redondo y plano fuera de la pared del útero en el lado opuesto de la cabeza del embrión con la otra mano. A continuación, apriete suavemente el embrión entre los electrodos.

Utilice el interruptor de pedal para aplicar voltaje. Después de eso, saque lentamente el electrodo de la aguja del útero mientras sostiene el útero con el dedo índice de la otra mano. Si el líquido amniótico se pierde a través de la pared perforada, por lo general el embrión se someterá a un aborto.

Después de la inyección y electroporación de todos los embriones, vuelva a colocar el útero en el abdomen del ratón con mucho cuidado y colóquelos exactamente como estaban antes. A continuación, humedecer la cavidad peritoneal con solución salina antes de cerrarla. Suturar el peritoneo con tripa de gato quirúrgico, luego suturar la piel con una sutura más resistente.

Desinfecte la superficie del abdomen con una solución de yodo e inyecte un antiinflamatorio no esteroideo por vía subcutánea para aliviar el dolor. A continuación, retire a la madre de la máquina de anestesia y colóquela en una jaula, que se calienta con una almohadilla térmica. Monitoree al ratón hasta que esté completamente recuperado de la anestesia y revíselo diariamente para asegurarse de que se esté recuperando del procedimiento sin ningún signo de infección o dolor.

En este paso, recolectar los embriones o postnatales de acuerdo al día deseado de análisis. Seleccione los embriones a los que se les inyectó ADN y se electroporaron y diseccionen los cerebros bajo este microscopio estereoscópico. A continuación, compruebe si hay señal fluorescente verde en la región adecuada.

Para analizar el cerebro del embrión seleccionado, fije el tejido durante un breve período de tiempo en 4% de paraldehído. A continuación, insértelo en aros 4%o en albúmina de gelatina. A continuación, secciona el cerebro en el vibrato.

Estas figuras muestran el hipotálamo después de la transfección intrauterina de ADN plasmático, portador de genes reporteros fluorescentes, GFP o CFP en E 12.5. Esta es una sección sagital que muestra un hipotálamo transfectado de rostral a coddle, y aquí está la sección transversal con las células marcadas a diferentes niveles a lo largo del eje lateral de la media. Esta sección sagital muestra un cuerpo mamilar específicamente transfectado y el marcaje de su árbol axonal característico, y en el lado del desfile eléctrico de esta sección transversal muestra una banda etiquetada correspondiente a las neuronas nacidas en E 12.5.

Para analizar las secciones más de cerca. Se prepararon las secciones horizontales paralelas al plano de las apófisis gliales radiales que emanan del receso mamilar. Las neuronas ambi O nacidas del neuroepitelio transfectado el día E 12.5 se identificaron el día E 18.5 mediante anticuerpos contra GFP.

En este ejemplo, el anticuerpo marcó un grupo restringido de células MBO. Este grupo se localizó entre dos áreas de MBO lateral y medial no marcadas correspondientes a neuronas MBO, nacidas antes y después de E 12.5, y la cotinción con un anticuerpo contra neston. En rojo muestra el modo de migración de las neuronas marcadas individualmente en las apófisis gliales radiales del epitelio neuro Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 30 minutos si se realiza correctamente.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo inyectar el ADN en el tercer ventrículo y cómo colocar la aguja como electrodo positivo entre el embrión, la cabeza y la placenta para dirigirse de manera eficiente al hipotálamo. Siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la inmunohistoquímica o la hibridación de inid, para responder a preguntas adicionales sobre el fenotipo de las neuronas transfectadas.