Name: Micromanipulación de la expresión génica en el cerebro de pez cebra adulto Uso Microinyección cerebroventricular de oligonucleótidos Morpholino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Aprende a manipular la expresión génica en el cerebro adulto de pez cebra mediante microinyección de oligonucleótidos morpholino en el ventrículo cerebral. Este método rápido permite estudiar funciones genéticas en neurogénesis vertebrada.

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Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 655) y la Unión Europea (Zf-Health).

1. Preparación de la mezcla Inyección <ol><li> Usa morfolinos in vivo como células ellos internalizan de manera más eficiente que las moléculas de morfolino normales. Consulte la información del fabricante para obtener más información (Tabla 1: Reactivos y materiales). </li><li> Utilice un colorante fluorescente de seguimiento (por ejemplo, CellTracker Rojo CMTPX, Invitrogen) para visualizar la exactitud de la inyección. Este colorante se metaboliza en la célula y se vuelve fluorescente sólo en la célula después de la absorción. Por lo tanto, este paso es crucial para determinar las células que están dirigidos de manera eficiente por la microinyección cerebroventricular. </li><li> Preparar salina tamponada con fosfato (PBS) (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH: 7,4) para la dilución de solución morfolino. Si se requiere una dilución de la solución de morfolino, utilice siempre PBS. </li><li> Preparar 10 l de la mezcla de inyección mediante la adición de 9 l de la solución morfolino y 1 l de the célula de seguimiento de tinte (diluido o sin diluir la concentración de reserva de la solución morfolino es 500 mM Nuestros resultados previos 22 indican que varias dosis diferentes del morfolino -.. entre 50 mM y 500 mM - dan lugar a diferentes niveles de la caída de un sistema eficiente caída de fenotipos hypomorphic). 1 l de solución es suficiente para la inyección en un cerebro de pez cebra. </li><li> Mezclar bien y almacenar a temperatura ambiente hasta que la inyección. </li></ol> 2. Preparación del aparato de inyección <ol><li> Preparar la inyección de capilares de vidrio con un extractor de aguja. Utilice los siguientes parámetros: valor del ciclo de calefacción: 463, tirando de valor del ciclo: 230, velocidad: 1,5 seg, tiempo: 75 ms. </li><li> Encienda la fuente de presión y ajustar los parámetros de presión de 50 psi o 3,5 bares. </li><li> Ajuste la configuración microinyector los siguientes: mantener la presión de 20 psi, la presión de expulsión de 10 psi, el valor de tiempo de 2,5 ms y 100 rango de gating. </li><li> Vueltaen el anillo de luz y localizar el anillo sobre la platina del microscopio. </li><li> Coloque el soporte capilar a una posición apropiada al lado del microscopio. </li><li> Insertar el capilar de vidrio en el soporte. Ajustar el ángulo de inyección a 45 grados. </li><li> Encaje de la punta de la capilar de vidrio usando un fórceps fino de gama y calibrar la salida de presión desde el orificio. Esta debe ser probado mediante la inmersión de la punta de la aguja en el pescado de agua y dando un impulso de presión continua. Las burbujas de aire resultantes deben ser sólo una fila, que es una indicación de la presión óptima / tamaño del orificio. Por favor, vea el video de demostración de esta calibración. </li><li> Cargue el capilar de vidrio con la solución de la inyección sin atrapar burbujas de aire. </li><li> Aplicar presión para eliminar el aire entre la punta del capilar de vidrio y la solución de inyección cargado. </li></ol> 3. Anestesia <ol><li> Preparar la solución madre de los anestésicos (0,1% MESAB - etil-m-aminobenzoato de metanosulfonato). </li><li> Retire número deseado de peces de los tanques a las jaulas de ratón de plástico u otro contenedor de transporte con suficiente cantidad de agua. </li><li> Prepare la solución de la anestesia en una pequeña caja de plástico mediante la mezcla de 200 ml de agua pescado con 5 ml de solución de anestésicos. La concentración final de la anestésicos: 0,0025% (v / v). </li><li> Media llenar un plato de plástico Petri con anestésicos. Utilice este plato para preparaciones inyectables. </li><li> Incubar los peces en los anestésicos hasta las somete peces. </li></ol> 4. Incisión y Microinyección cerebroventricular <ol><li> Retire el pescado de la caja con una red de pesca y colóquelo en la caja de Petri. </li><li> Aplique suavemente el pescado con el fórceps y orientar la cabeza de una manera que se inclina ligeramente hacia abajo. Esto facilitará la incisión. </li><li> Generar una pequeña hendidura en el cráneo con una aguja de púas de fin de calibre 30. Utilice sólo la punta de la aguja y no penetran más delo suficiente en el cerebro ya que esto puede ocasionar daños al tejido cerebral y se manifestará como sangrado. </li><li> Sigue sosteniendo el pez e inserte la punta del capilar de vidrio a través del sitio de la incisión. </li><li> Oriente la punta del capilar de vidrio hacia el telencéfalo. Evitar tocar el tejido cerebral ya que esto crea daños en los tejidos y también impide la dispersión de la solución inyectada. </li><li> Inyectar la solución. El líquido se dispersa inmediatamente después de la inyección. </li></ol> 5. Recuperación y análisis de la precisión de inyección <ol><li> Retire el pescado de la configuración de la inyección y el lugar en una caja de plástico con peces de agua dulce. </li><li> Permitir la recuperación. </li><li> Vuelva a anestesiar a los peces con el 0,0025% MESAB brevemente y comprobar el pez bajo el microscopio de fluorescencia. Una dispersión a fondo de la fluorescencia roja es una indicación de la amplia distribución del líquido inyectado. </li><li> Ponga el pescado de nuevo a la caja de plástico. </li><li> Conecte la caja de plástico para tque el sistema de circulación para oxigenar el pescado y mantener durante períodos de tiempo más largos. </li><li> Utilice el pescado para los propósitos deseados, tales como los análisis de comportamiento o sacrificar los animales en puntos de tiempo deseados después de la inyección para preparar muestras de tejido para análisis posteriores (tinciones histológicas, inmunohistoquímica, etc). Las siguientes referencias proporcionan ejemplos de cómo analizar el cerebro de pez cebra adulto: 9,11,17-20,24-27. El tiempo más rápido para observar una caída eficiente (más de 50% desmontables) era 12 horas en nuestros estudios 22. </li></ol> 6. Controles científicos sugeridos <ol><li> Utilice un morfolino molécula de falta de coincidencia que no se supone para causar cualquier fenotipo como un control negativo. Utilice una molécula de morfolino estándar o diseño específicamente controles morfolino para cada gen de interés. Además, utilizar el disolvente (en este caso PBS) como un control negativo adicional para evaluar los efectos no específicos o de toxicidad de la mismatch / controlar morpholino inyecciones. </li><li> Utilizar PCNA morfolinos descrito previamente 22 como controles positivos. Este morfolino causa caída eficiente en el cerebro del pez cebra adulto (75-95% de eficiencia caída dentro de 1 día de la inyección) 22. </li></ol>

<ol><li>Stocum, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStocum%2C+D+%22Regenerative+Biology+and+Medicine%22">Regenerative Biology and Medicine</a>. , Academic Press. London. (2006).</li>
<li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nat. Rev. Genet. 11 (10), 710-722 (2010).</li>
<li>Doetsch, F., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+for+brain+repair%3A+insights+from+adult+neurogenesis+in+birds+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav.+Evol%22%5BJournal%5D)">Challenges for brain repair: insights from adult neurogenesis in birds and mammals.</a> Brain Behav. Evol. 58 (5), 306-322 (2001).</li>
<li>Kaslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation%2C+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).</li>
<li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).</li>
<li>Grandel, H., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+adult+neural+stem+cell+activity+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates.</a> Dev. Genes Evol. , In Press (2013).</li>
<li>Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKempermann%2C+G+%22Adult+Neurogenesis+2%3A+Stem+Cells+and+Neuronal+Development+in+the+Adult+Brain%22">Adult Neurogenesis 2: Stem Cells and Neuronal Development in the Adult Brain</a>. , 2nd Edition, Oxford University Press. Oxford. (2010).</li>
<li>Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+in+the+astroglial+lineage+are+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Cells in the astroglial lineage are neural stem cells.</a> Cell Tissue Res. 331 (1), 179-191 (2008).</li>
<li>Grandel, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain%3A+origin%2C+proliferation+dynamics%2C+migration+and+cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell.</a> 295 (1), 263-277 (2006).</li>
<li>Chapouton, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+non-mammalian+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates.</a> Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).</li>
<li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).</li>
<li>Byrd, C. A., Brunjes, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+olfactory+bulb+of+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the olfactory bulb of adult zebrafish.</a> Neuroscience. 105 (4), 793-801 (2001).</li>
<li>Pellegrini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+aromatase-positive+radial+glial+cells+as+progenitor+cells+in+the+ventricular+layer+of+the+forebrain+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Identification of aromatase-positive radial glial cells as progenitor cells in the ventricular layer of the forebrain in zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 501 (1), 150-167 (2007).</li>
<li>Lam, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gfap+and+nestin+reporter+lines+reveal+characteristics+of+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish.</a> 238 (2), 475-486 (2009).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Wnt-responsive+cells+in+the+zebrafish+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Identification of Wnt-responsive cells in the zebrafish hypothalamus.</a> Zebrafish. 6 (1), 49-58 (2009).</li>
<li>Kaslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+adult+zebrafish+cerebellum%3A+initiation+and+maintenance+of+a+novel+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the adult zebrafish cerebellum: initiation and maintenance of a novel stem cell niche.</a> J. Neurosci. 29 (19), 6142-6153 (2009).</li>
<li>Ganz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+and+Fgf+dependence+of+adult+neural+progenitors+in+the+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity and Fgf dependence of adult neural progenitors in the zebrafish telencephalon.</a> Glia. 58 (11), 1345-1363 (2010).</li>
<li>März, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+progenitor+cell+subtypes+in+the+ventricular+zone+of+the+zebrafish+adult+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon.</a> Glia. 58 (7), 870-888 (2010).</li>
<li>Rothenaigner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+by+distinct+viral+vectors+identifies+bona+fide+neural+stem+cells+in+the+adult+zebrafish+telencephalon+and+characterizes+their+division+properties+and+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate.</a> Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).</li>
<li>Kroehne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li>
<li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neural+stem+cells+and+their+progeny+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum.</a> Dev. Biol. 342 (1), 26-38 (2010).</li>
<li>Kizil, C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebroventricular+microinjection+%28CVMI%29+into+adult+zebrafish+brain+is+an+efficient+misexpression+method+for+forebrain+ventricular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells.</a> PLoS One. 6 (11), e27395(2011).</li>
<li>Morcos, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vivo-Morpholinos%3A+a+non-peptide+transporter+delivers+Morpholinos+into+a+wide+array+of+mouse+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Vivo-Morpholinos: a non-peptide transporter delivers Morpholinos into a wide array of mouse tissues.</a> Biotechniques. 45 (6), 613-614 (2008).</li>
<li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemokine+receptor+cxcr5+regulates+the+regenerative+neurogenesis+response+in+the+adult+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain.</a> Neural Dev. 7, 27(2012).</li>
<li>Chapouton, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((her5+expression+reveals+a+pool+of+neural+stem+cells+in+the+adult+zebrafish+midbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">her5 expression reveals a pool of neural stem cells in the adult zebrafish midbrain.</a> Development. 133 (21), 4293-4303 (2006).</li>
<li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+neurogenesis+from+neural+progenitor+cells+requires+injury-induced+expression+of+Gata3%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3.</a> Developmental Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).</li>
<li>Kyritsis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+inflammation+initiates+the+regenerative+response+in+the+adult+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain.</a> Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).</li>
<li>Rosen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113(2009).</li>
<li>Rikin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reverse+genetic+approach+to+test+functional+redundancy+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A reverse genetic approach to test functional redundancy during embryogenesis.</a> J. Vis. Exp. (42), e2020(2010).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método se describe aquí permite la administración fácil y rápida de morfolinos en el cerebro del pez cebra adulto. Hemos demostrado que nuestro método de inyección bloquea eficientemente la expresión génica en las células ventriculares y resultados en consecuencias funcionales en la respuesta de la neurogénesis. Hay puntos importantes para ser cautelosos acerca al ejecutar la microinyección cerebroventricular. Por ejemplo, el efecto de las moléculas de morfolino depende de la concentración utilizada. Esta concentración tiene que ser determinada por el usuario final. Se recomienda a partir de la solución madre (500 M) y la realización de diluciones en serie, y lo ideal sería que antes de la prueba por inyección en embriones utilizando protocolos estándar embrión inyección 28-30. Anteriormente, se obtuvieron diferentes niveles de eficiencia de caída con concentraciones de morfolinos que van desde 50 mM a 500 mM 22. En segundo lugar, el orificio del capilar de vidrio no debe ser large ya que esto dará lugar a una amplia afluencia de líquido en el cerebro después de la inyección. Del mismo modo, la abertura no debe ser demasiado estrecha ya que esto evitará inyección adecuada. Se puede determinar la combinación óptima orificio de presión por bombeo de aire en una placa de Petri con agua. Las burbujas de derivados deben estar en una sola fila, pero no en múltiples filas. Se demuestra esto en el video. En tercer lugar, la incubación de los peces en los anestésicos es crítico. El pescado no debe tener más de 2 min de los anestésicos. Esto obstaculizará la tasa de recuperación después de la inyección. En cuarto lugar, la localización de la incisión es crítico para dispersar a fondo el líquido inyectado. La región ventricular en el techo óptico es más grande por encima de la línea media y se estrecha lateralmente. Por lo tanto, el experimentador debe generar la hendidura en el cráneo cerca de la línea media y justo caudal a la placa de cráneo que cubre la región telencefálica. Una de las ventajas de la Inyección de cerebroventricularn método (CVMI) es su Rapidness. CVMI es un método rápido para analizar la función de genes. Esta característica es importante y útil en comparación con la generación de líneas transgénicas para estudios funcionales, que generalmente toman varios meses. Además, CVMI conduce a una distribución uniforme del líquido inyectado y por lo tanto proporciona una manipulación relativamente exhaustivo de la actividad del gen, cuando se compara con las inyecciones de coordinación o de electroporación. Con CVMI, múltiples genes pueden ser derribados simultáneamente prepara la inyección de mezcla que contiene múltiples morfolinos oligonucleótido. CVMI se puede utilizar para inyectar diferentes concentraciones de un determinado oligonucleótidos de morfolino, y por lo tanto se puede utilizar para el análisis de fenotipos hypomorphic. Por último, este paradigma inyección no causa toxicidad o comprometer la supervivencia de los animales. La técnica CVMI podría ampliarse a otro tipo de estudios, como la inyección de péptidos moduladores, las drogas, el ADN plásmido o modulador RNA molecules u otras sustancias que pudieran afectar a la fisiología de las células. Ensayo combinación de moléculas y la realización de análisis de dosis-respuesta son posibles con este método, lo que permite el estudio de fenotipos hypomorphic. Con estas propiedades, CVMI demuestra ser un ensayo rápido y fácil para los estudios de expresión en el cerebro adultos de pez cebra, y se abre de detección rápida y análisis funcionales. El pez cebra cerebro adulto puede producir constitutivamente nuevas neuronas a lo largo de todo el eje rostrocaudal y también puede regenerarse después de lesiones traumáticas. Esto está en marcado contraste con los cerebros de los mamíferos con la neurogénesis limitado y en todo caso, más bien pobre capacidad de regeneración. Tal actividad de células madre generalizada y la capacidad de recuperación de pez cebra hace un organismo modelo útil para la comprensión de los programas moleculares necesarios para la regeneración del sistema nervioso central, que actualmente son en gran parte desconocidos. Por lo tanto, la investigación de la base molecular de la capacidad regenerativa de zebrafish cerebro es un interesante campo de investigación que podría explicar la diferencia fundamental la forma de pescado y de mamíferos cerebros reaccionan después de una lesión, y también dotar avenidas para terapias médicas regenerativas en los seres humanos. Para entender la infraestructura molecular de vertebrados plasticidad cerebral y la regeneración, las células gliales constituyen un área de investigación importante, ya que son los progenitores neurogénica 3,8,20. Por lo tanto, utilizando la técnica de CVMI para alterar la función del gen en las células gliales radiales del cerebro del pez cebra es instrumental en la aclaración de cómo el cerebro de pescado puede actividad progenitora pareja para neurogénesis adulta eficiente y respuesta regenerativa. Recientemente hemos demostrado la implicación y exigencia de varios factores y vías de señalización en la respuesta regenerativa neurogénesis del cerebro de pez cebra adultos 24,26,27, y estos estudios fueron posibles gracias a la utilización del método CVMI. En general, el conocimiento que obtenemos de pez cebra cerebro podría ser aprovechada para imponer regenecapacidad figurativa a las células gliales de mamífero que reaccionan a las lesiones y que por lo tanto, ayudar a diseñar terapias clínicas para trastornos neurológicos humanos y lesiones agudas.

Neurogénesis del adulto es un rasgo común a los vertebrados, sin embargo, su grado de prevalencia y eficiencia varía con la filogenia 1,2,3,4,5,6. Por ejemplo, los cerebros de mamíferos adultos contienen regiones de células madre en gran parte restringidos a la prosencéfalo 7,8, mientras que el pez cebra teleósteos contiene dieciséis dominios diferentes de células madre y las zonas neurogénicos asociados en la totalidad de su cerebro 4,5,9,10. Esta variación entre los mamíferos y el pez cebra podría reflejar una disparidad en los mecanismos de mantenimiento de células madre y la capacidad neurogénica de las células progenitoras. La competencia de toda la vida del pez cebra para producir las neuronas en el cerebro también podría suponer consecuencias clínicas como los mecanismos moleculares utilizados por el pez cebra cerebro podrían ser aprovechadas para aplicaciones terapéuticas para hacer frente a las enfermedades neurodegenerativas en seres humanos. Células madre de varias zonas del cerebro de pez cebra adulto han sido analizados y se ha demostrado que lacélulas que recubren la superficie ventricular de esas regiones sirven como células progenitoras 9,11-20. Los análisis detallados en el telencéfalo pez cebra, por ejemplo, identifican las células gliales radiales, que delimitan la superficie ventricular de esta región del cerebro que ser progenitores neurogénicos 19, 20. Esto es válido para otras regiones, como el cerebelo y el techo óptico, donde-ubicado ventricularly células neuroepiteliales proporcionan la entrada neurogénica 16,21. Para este fin, la comprensión de los mecanismos moleculares que regulan la competencia neurogénica generalizada en el cerebro del pez cebra adultos requiere la manipulación de la expresión génica en las células progenitoras. Varios métodos se han descrito anteriormente para la modulación de la función de genes en el pez cebra. Estos incluyen la generación de líneas transgénicas que expresan variantes condicionales deseados de una única proteína inyecciones focales, basados ​​en plásmidos acoplados a electroporación o tratamientos químicos. Anteriormente hemos diseñado unmétodo para la administración de diversas sustancias, incluyendo oligonucleótidos de morfolino o proteínas en el cerebro del pez cebra adultos usando microinyección cerebroventricular como una forma rápida y eficiente de modulación de la función de genes en las células ventriculares del adulto pez cebra cerebro anterior 22. En nuestros estudios, morfolinos in vivo se utilizan debido a su química que implica la molécula de morfolino unido covalentemente a péptidos ricos en arginina de entrega, que permiten la entrega eficiente a las células de interés sin necesidad de permeabilización adicionales, tales como la electroporación 23. Esto permitiría una orientación completa del tejido deseado después de la inyección, al igual que lo observado en adultos de pez cebra telencéfalo 22. El uso de morfolinos in vivo son por lo tanto superior a los métodos ya existentes de los tejidos dirigidos tales como electroporación o inyección focal de moléculas de ADN. Aquí, se demuestra visualmente cómo llevamos a cabo esta operación y proporcionar unprotocolo paso a paso. Comenzamos con la explicación de la preparación de la mezcla de inyección y el pescado para ser inyectado, y proceder mediante la demostración de cómo el aparato de inyección está configurado. Proporcionamos una descripción del método de inyección de cerebroventricular, que implica la generación de una incisión en el cráneo y la inyección de los morfolinos utilizando microinyector. También dio detalles sobre los puntos críticos es necesario ser cauteloso durante todo el procedimiento declarando como optimización o guías de solución de problemas.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reactivo/Material</td></tr><tr><td>CellTracker Red CMTPX</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>C34552</td><td>Uso en dilución 1:100 para medir la precisión de la inyección</td></tr><tr><td>MESAB (etil-m-aminobenzoato metanassulfonato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>Para anestesiar el pescado</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Sarstedt</td><td>821.472</td><td>Para la manipulación del pescado durante la inyección y la obtención de imágenes</td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato</td><td>Life Technologies, GIBCO</td><td>10010-056</td><td>Como medio de dilución estéril</td></tr><tr><td>Vivo morpholinos</td><td>Gene Tools Inc.</td><td>Personalizado</td><td>Más información sobre vivo morpholinos: <a href="http://www.gene-tools.com" target="_blank">www.gene-tools.com</a></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Aguja de púas</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305178</td><td>Para generar la incisión en el cráneo</td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Olympus, Leica, Zeiss</td><td>Varía según el fabricante</td><td>Parte de toda la configuración de la inyección</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td>Para romper la punta del capilar de vidrio Cámara de</td></tr><tr><td>fluorescencia</td><td>Zeiss, Nikon, Leica</td><td>Varía según el fabricante</td><td>Para visualizar la fluorescencia después de la inyección</td></tr><tr><td>Pinzas de disección Gillies</td><td>World Precision Instruments</td><td>501265</td><td>Para mantener el pez en posición</td></tr><tr><td>Inyección de vidrio capilares</td><td>World Precision Instruments</td><td>TWF10</td><td>Para microinyección</td></tr><tr><td>Kit PicoNozzle (soporte para microinyectores)</td><td>World Precision Instruments</td><td>5430-12</td><td>Para microinyección</td></tr><tr><td>PicoPump neumático (microinyector)</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td>Para microinyección</td></tr><tr><td>Iluminador de anillo; Guía de luz anular</td><td>Parkland Scientific</td><td>ILL-RLG</td><td>Para iluminar el espécimen</td></tr></tbody></table>

micromanipulación de la expresión génica en el cerebro de pez cebra adulto uso microinyección cerebroventricular de oligonucleótidos morpholino

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Se requiere la manipulación de la expresión génica en los tejidos para llevar a cabo estudios funcionales. En este trabajo se demuestra la técnica de microinyección cerebroventricular (CVMI) como un medio para modular la expresión de genes en el cerebro del pez cebra adulto. Mediante el uso de CVMI, las sustancias se pueden administrar en el líquido cerebroventricular y ser distribuidos a fondo a lo largo del eje rostrocaudal del cerebro. En particular nos centramos en el uso de oligonucleótidos antisentido de morfolino, que son herramientas potentes para derribar la expresión génica in vivo. En nuestro método, cuando se aplica, las moléculas de morfolino son absorbidos por las células que recubren la superficie ventricular. Estas células incluyen las células gliales radiales, que actúan como progenitores neurogénicos. Por lo tanto, derribando la expresión génica en las células gliales radiales es de suma importancia para analizar la respuesta generalizada neurogénesis en el pez cebra, y también dar una idea de cómo los vertebrados podrían sostener Neurogen adultosrespuesta nesis. Tal comprensión también ayudaría a los esfuerzos para la aplicación clínica en los trastornos neurodegenerativos humanos y la regeneración del sistema nervioso central. Por lo tanto, presentamos el método de microinyección cerebroventricular como una forma rápida y eficiente para alterar la expresión de genes y la respuesta de la neurogénesis en el cerebro anterior adultos de pez cebra. También ofrecemos consejos para solucionar problemas y otra información útil sobre cómo llevar a cabo el procedimiento CVMI.

Microinyección cerebroventricular conduce a la amplia distribución de la solución inyectada Usando el esquema de flujo de trabajo y la técnica de la microinyección cerebroventricular representado en la Figura 1, se administraron oligonucleótidos de morfolino en el cerebro del pez cebra adultos. Un protocolo de inyección precisa conduce a la dispersión del líquido inyectado a través del cerebro y eficiente focalización de las células cercanas a la superficie ventricular (Figura 2A). Inyecciones donde el capilar de vidrio empala el tejido cerebral tendrán una señal fluorescente densa en el punto de la inyección (Figura 2B). Si la cantidad inyectada no es suficiente, se observó señal fluorescente débil (Figura 2 C). Microinyección cerebroventricular se puede utilizar para derribar la expresión génica en la región del ventrículo del cerebro adultos de pez cebra Hemos demostrado ªen morfolinos in vivo puede penetrar unos pocos diámetros de células dentro de la superficie ventricular y por lo tanto pueden dirigirse de manera eficiente las células ventriculares (Figuras 3A, 3B). Inyección de morfolino pueden expresión de genes desmontables ya que aliviará la producción de la proteína correspondiente (un ejemplo es PCNA como se muestra en las figuras 3C, 3D). Hemos demostrado previamente que derribar genes utilizando esta técnica conduce a consecuencias funcionales durante la neurogénesis adulta (Figuras 3E, 3F) o respuesta regeneración (Figuras 3G, 3H). Hemos demostrado que el rango de caída eficiente (más de 50% desmontables) se consigue aproximadamente 12 horas después de la inyección de la morfolinos 22. También se observó que período de caída eficiente es hasta aproximadamente 5 días después de la inyección de la proteína PCNA 22. Más de 70% desmontables fue visto hasta 3 días después de la inyección 22. Las curvas son desmontables o dependienten el nivel de expresión de las proteínas endógenas y la eficiencia de las moléculas de morfolino, y tiene que ser determinada para cada gen por el experimentador. En nuestros estudios, no hemos visto que el procedimiento CVMI pone en peligro la supervivencia del animal, probablemente debido a que la administración de las moléculas morpholino es local y no causa una toxicidad sistémica. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1.jpg" /> Figura 1. Representación esquemática de la técnica de inyección cerebroventricular. (A) La inyección se realiza desde el dorsal del pez cebra adultos (1) en el nivel de techo óptico (OT, 2). Se hace una incisión sobre la placa de cráneo tectal óptica con una aguja de calibre 30 (3). Uso de capilares de vidrio, las moléculas de morfolino se inyectan en el líquido ventricular (4). Una dispersión a fondo es unachieved instantáneamente (5). (B) La cánula y su extremo de púas se muestra en la alta ampliación. (C) La orientación de la aguja antes de la incisión. (D) La incisión es un círculo y se indica por líneas de trazos. (E) La inyección capilar está situado como se muestra y se lleva a cabo la inyección. Todos los paneles fueron adaptadas de ref. 22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="La figura 2" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig2.jpg" /> Figura 2. Comparación de la eficiencia de inyección y la precisión. (A) Una buena inyección conduce a la orientación de las células cercanas a la superficie ventricular. (B) Si se introduce el vaso capilar en el tejido cerebral, lo que generará una señal de fluorescencia céntrico. (C </strong&gt;) Si la cantidad de inyección es baja, esto dará lugar a la menor señal de fluorescencia. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3.jpg" /> Figura 3. . Morpholino penetración, eficiencia de caídas de genes y las consecuencias funcionales (A) GFP inmunotinción de las secciones transversales telencefálicas del control morpholino inyectado Tg (H2A: GFP) línea transgénica que muestra núcleos GFP-positivas. (B) GFP inmunotinción de las secciones transversales telencefálicas de gfp antisentido morpholino inyectado Tg (H2A: GFP) línea transgénica que muestra núcleos GFP-positivas. Tenga en cuenta la diferencia en la señal de GFP en la región ventricular. v: ventrículo. (C) PCNA inmunotinción en el control de morfolino-inyectado cerebro que muestran la distribución generalizada de células PCNA positivas. ( <strong&gt; D) PCNA PCNA inmunoticción en antisentido morpholino cerebros de inyección que muestran significativamente reducidas cantidades de células PCNA positivas, demostrando que CVMI lata desmontables genes endógenos. (E) y BrdU HuC / D inmunotinción en el control morpholino-inyectados cerebros para determinar las neuronas recién nacidas después de un experimento BrdU pulso-caza descrito antes de los 22. (F) y BrdU HuC / D inmunotinción de PCNA cerebros antisentido morpholino-inyectados para determinar las neuronas recién nacidas después de un experimento BrdU pulso-caza descrito antes de los 22. (G) Golpear-PCNA hacia abajo conduce a una reducción significativa en la generación de neuronas recién nacidas, lo que indica que CVMI se puede utilizar para desmontables genes endógenos, que dan lugar a consecuencias funcionales. Todos los paneles fueron adaptadas de ref. 22 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> .

En este artículo se demuestra un método para la manipulación de la expresión génica en las células ventriculares del telencéfalo adultos de pez cebra utilizando oligonucleótidos antisentido morpholino. Se presenta este método como un protocolo eficiente y rápida que puede ser utilizado para los estudios funcionales en el cerebro de los vertebrados adultos.

Micromanipulación de la expresión génica en el cerebro de pez cebra adulto Uso Microinyección cerebroventricular de oligonucleótidos Morpholino

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

El objetivo general de este procedimiento es microinyectar oligonucleótidos morfolinos en el ventrículo cerebral del cerebro de pez cebra adulto y reducir la actividad de genes en las células gliales radiales. Esto se logra primero anestesiando al pez cebra. A continuación, se realiza una incisión en el cráneo, sobrepuesta al túbulo óptico, utilizando una aguja dental dentada.Luego, se inyecta la solución de morfolino a través del sitio de incisión en el líquido ventricular cerebral. Finalmente, se verifica la eficiencia y precisión de la inyección mediante microscopía de fluorescencia. En última instancia, se pueden obtener resultados sobre la inhibición demasiado eficiente y generalizada de la producción de proteínas a partir de los genes de interés en las células gliales radiales del cerebro del pez cebra adulto mediante la inhibición génica mediada por morfolino, la cual puede evaluarse mediante secciones histológicas y tinciones inmunohistoquímicas.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como los enfoques transgénicos o los métodos de administración basados en electro poración, es que la IMVC requiere menos tiempo y es más eficiente para dirigirse a toda la población de células gliales radiales. Se pueden silenciar simultáneamente múltiples genes ajustables. Para preparar la mezcla de inyección, comience por elaborar una solución stock de Morpho de 500 micromolares.Usando PBS para 10 inyecciones, prepare 10 microlitros de mezcla de inyección combinando nueve microlitros de solución de morfo diluida o no diluida con un microlitro de un colorante fluorescente de rastreo. Almacénela a temperatura ambiente. Utilice un tirador de agujas para preparar capilares de inyección de vidrio según los siguientes parámetros.Encienda la fuente de presión y ajuste la presión a 50 PSI o 3,5 bares. Ajuste la configuración del microinyector como sigue: presión de retención 20 PSI, presión de expulsión 10 PSI, valor del período 2,5 y 100 milisegundos.Rango de compuerta. Encienda el iluminador anular y ubique el anillo sobre la platina del microscopio. Coloque el portacapilares en una posición adecuada junto al microscopio.Inserte la micropipeta de vidrio en el porta-pipetas y ajuste el ángulo de inyección a 45 grados. Utilizando pinzas para encontrar el extremo, rompa la punta de la micropipeta de vidrio y calibre la presión de salida proveniente del orificio. Al sumergir la punta de la aguja en el agua del pez y aplicar un pulso de presión continuo, las burbujas de aire deben formar una sola fila, lo que indica una presión u orificio óptimos.Cargue la micropipeta de vidrio con la solución de inyección. Evitando burbujas de aire, aplique presión para eliminar el aire entre la punta de la micropipeta de vidrio y la solución de inyección cargada. Después de preparar una solución de 0,1 % en tallo del anestésico meab, transfiera el número deseado de peces a un recipiente de transporte con agua para peces.Prepare una solución de trabajo del anestésico mezclando 200 mililitros de agua para peces con cinco mililitros de la solución stock de MISP. Llene un recipiente de Petri hasta la mitad con el anestésico para usar en las inyecciones. Incube un pez en el anestésico hasta que deje de moverse.Luego, utilice una red para transferirlo al plato de Petri con anestésico. Para facilitar la incisión, use la pinza para sostener suavemente el pez y orientarlo con la cabeza ligeramente inclinada hacia abajo. Usando la punta de una aguja con bisel de calibre 30, haga una pequeña incisión en el cráneo sin penetrar demasiado profundamente, ya que esto causaría daño al tejido cerebral.Mientras sostiene el pez, inserte la punta de la capilar de vidrio a través del sitio de incisión aproximadamente medio milímetro y, evitando el contacto con el tejido cerebral, oriente la capilar hacia el cefalón. Inyecte la solución, la cual debe dispersarse inmediatamente. Transfiera el pez a agua fresca para peces y permita que se recupere.Aproximadamente 30 minutos después, reanestesie el pez y revíselo bajo un microscopio de fluorescencia para observar la distribución generalizada del líquido. Basándose en la fluorescencia roja. Devuelva el pez a su tanque y colóquelo nuevamente en circulación.Hasta su uso para análisis conductuales o para la preparación de muestras de tejido como se observa aquí, una inyección precisa conduce a la dispersión de la solución inyectada en todo el cerebro y al targeting eficiente de las células cercanas a la superficie ventricular. Sin embargo, en las inyecciones en las que la micropipeta de vidrio atraviesa el tejido cerebral, habrá una señal fluorescente intensa en el punto de inyección. Y si la cantidad inyectada no es suficiente, se observará una señal fluorescente débil.Esta figura demuestra que los morfos vivos pueden penetrar hasta unos pocos diámetros celulares dentro de la superficie ventricular y, por lo tanto, pueden dirigirse eficazmente a las células ventriculares en comparación con el control. La inyección de morfos contra PCNA reduce eficazmente la expresión génica en las células ventriculares. En estas imágenes de inmunofluorescencia, las tinciones inmunológicas de BRDU y QCD tras un experimento de pulso-cacería A-B-R-D-U demuestran que la inhibición de PCNA mediante morfos antisentido conduce a una reducción significativa de neuronas recién formadas, lo que sugiere que la CVMI puede utilizarse para silenciar genes endógenos que posteriormente producen consecuencias funcionales.Por lo tanto, tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran los mecanismos moleculares implicados en la respuesta de neurogénesis regeneradora del cerebro de adultos de S de peces.

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

Microinyección es un método bien establecido y eficaz para la introducción de sustancias extrañas en embriones de pez cebra fecundado. Este sentido, demuestran una sólida técnica de microinyección para la realización de la sobreexpresión de ARNm, y morpholino oligonucleótidos estudios caída de genes en el pez cebra.

Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra.

Este vídeo muestra cómo morfolino o ARNm puede ser inyectado en embriones de pez cebra en el estadio de una célula para aumentar o disminuir el nivel de productos específicos de genes durante el desarrollo posterior.

Microinyección de embriones de pez cebra para analizar la función génica

Un método para entregar morfolinos directamente en el pez cebra en otocyst 24hpf se ha desarrollado. Con microinyección de morfolinos en el lumen de la vesícula ótica y la electroporación para llevar a cabo la penetración, hemos sido capaces de evitar el efecto de morfolinos en el cerebro y obtener efectos específicos en el oído interno.

Entrega directa de Morpholinos FOMIN Hacia el otocyst pez cebra por inyección y electroporación afecta el desarrollo del oído interno

Un método para derribar condicionalmente la expresión de una proteína de destino en la retina del pez cebra adulto se describe, lo que implica la inyección intravítrea morfolinos antisentido y electroporating ellos en la retina. La proteína resultante es derribado por varios días, lo que permite realizar pruebas de función de la proteína en la regeneración o la retina intacta.

En electroporación in vivo de Morpholinos en la retina de pez cebra adultos

Se describe un método para derribar condicionalmente la expresión de una proteína diana durante la regeneración de la aleta del pez cebra adulto. Esta técnica implica la inyección de micro y electroporación morfolinos antisentido de oligonucleótidos en el tejido de la aleta, que permite probar el papel de la proteína en varias etapas de regeneración de la aleta, incluyendo la curación de heridas, la formación blastema, y ​​consecuencia regenerativa.

En electroporación in vivo de Morpholinos en la regeneración de adultos de pez cebra Aleta de cola

El protocolo describe la eliminación dirigida de la expresión génica en el pez cebra mediante la inyección de morfolino en la cola.

Inyección de morfolino: un método para eliminar la expresión génica objetivo para estudiar la función en el pez cebra

Un método de genética inversa adaptable para el pez cebra para evaluar la función de genes durante las etapas posteriores del desarrollo y la homeostasis fisiológica, tales como la regeneración de tejidos usando inyecciones intraventriculares de morfolinos de genes específicos.

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Presentamos un protocolo para aislar a las neuronas, macrófagos y microglia del cerebro de pez cebra larvas bajo condiciones fisiológicas y patológicas. Al aislamiento, el RNA se extrae de estas células a analizar su perfil de expresión génica. Este protocolo permite la colección de ARN de alta calidad para realizar análisis posteriores como qPCR y transcriptómica.

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Aprende a manipular la expresión génica en el cerebro adulto de pez cebra mediante microinyección de oligonucleótidos morpholino en el ventrículo cerebral. Este método rápido permite estudiar funciones genéticas en neurogénesis vertebrada.

Micromanipulación de la expresión génica en el cerebro de pez cebra adulto Uso Microinyección cerebroventricular de oligonucleótidos Morpholino (Video) | JoVE Journal

Micromanipulación de la expresión génica en el cerebro de pez cebra adulto Uso Microinyección cerebroventricular de oligonucleótidos Morpholino

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