Micromanipulación de la expresión génica en el cerebro de pez cebra adulto Uso Microinyección cerebroventricular de oligonucleótidos Morpholino

El objetivo general de este procedimiento es microinyectar oligonucleótidos morfolinos en el ventrículo cerebral del cerebro de pez cebra adulto y reducir la actividad de genes en las células gliales radiales. Esto se logra primero anestesiando al pez cebra. A continuación, se realiza una incisión en el cráneo, sobrepuesta al túbulo óptico, utilizando una aguja dental dentada.

Luego, se inyecta la solución de morfolino a través del sitio de incisión en el líquido ventricular cerebral. Finalmente, se verifica la eficiencia y precisión de la inyección mediante microscopía de fluorescencia. En última instancia, se pueden obtener resultados sobre la inhibición demasiado eficiente y generalizada de la producción de proteínas a partir de los genes de interés en las células gliales radiales del cerebro del pez cebra adulto mediante la inhibición génica mediada por morfolino, la cual puede evaluarse mediante secciones histológicas y tinciones inmunohistoquímicas.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como los enfoques transgénicos o los métodos de administración basados en electro poración, es que la IMVC requiere menos tiempo y es más eficiente para dirigirse a toda la población de células gliales radiales. Se pueden silenciar simultáneamente múltiples genes ajustables. Para preparar la mezcla de inyección, comience por elaborar una solución stock de Morpho de 500 micromolares.

Usando PBS para 10 inyecciones, prepare 10 microlitros de mezcla de inyección combinando nueve microlitros de solución de morfo diluida o no diluida con un microlitro de un colorante fluorescente de rastreo. Almacénela a temperatura ambiente. Utilice un tirador de agujas para preparar capilares de inyección de vidrio según los siguientes parámetros.

Encienda la fuente de presión y ajuste la presión a 50 PSI o 3,5 bares. Ajuste la configuración del microinyector como sigue: presión de retención 20 PSI, presión de expulsión 10 PSI, valor del período 2,5 y 100 milisegundos.

Rango de compuerta. Encienda el iluminador anular y ubique el anillo sobre la platina del microscopio. Coloque el portacapilares en una posición adecuada junto al microscopio.

Inserte la micropipeta de vidrio en el porta-pipetas y ajuste el ángulo de inyección a 45 grados. Utilizando pinzas para encontrar el extremo, rompa la punta de la micropipeta de vidrio y calibre la presión de salida proveniente del orificio. Al sumergir la punta de la aguja en el agua del pez y aplicar un pulso de presión continuo, las burbujas de aire deben formar una sola fila, lo que indica una presión u orificio óptimos.

Cargue la micropipeta de vidrio con la solución de inyección. Evitando burbujas de aire, aplique presión para eliminar el aire entre la punta de la micropipeta de vidrio y la solución de inyección cargada. Después de preparar una solución de 0,1 % en tallo del anestésico meab, transfiera el número deseado de peces a un recipiente de transporte con agua para peces.

Prepare una solución de trabajo del anestésico mezclando 200 mililitros de agua para peces con cinco mililitros de la solución stock de MISP. Llene un recipiente de Petri hasta la mitad con el anestésico para usar en las inyecciones. Incube un pez en el anestésico hasta que deje de moverse.

Luego, utilice una red para transferirlo al plato de Petri con anestésico. Para facilitar la incisión, use la pinza para sostener suavemente el pez y orientarlo con la cabeza ligeramente inclinada hacia abajo. Usando la punta de una aguja con bisel de calibre 30, haga una pequeña incisión en el cráneo sin penetrar demasiado profundamente, ya que esto causaría daño al tejido cerebral.

Mientras sostiene el pez, inserte la punta de la capilar de vidrio a través del sitio de incisión aproximadamente medio milímetro y, evitando el contacto con el tejido cerebral, oriente la capilar hacia el cefalón. Inyecte la solución, la cual debe dispersarse inmediatamente. Transfiera el pez a agua fresca para peces y permita que se recupere.

Aproximadamente 30 minutos después, reanestesie el pez y revíselo bajo un microscopio de fluorescencia para observar la distribución generalizada del líquido. Basándose en la fluorescencia roja. Devuelva el pez a su tanque y colóquelo nuevamente en circulación.

Hasta su uso para análisis conductuales o para la preparación de muestras de tejido como se observa aquí, una inyección precisa conduce a la dispersión de la solución inyectada en todo el cerebro y al targeting eficiente de las células cercanas a la superficie ventricular. Sin embargo, en las inyecciones en las que la micropipeta de vidrio atraviesa el tejido cerebral, habrá una señal fluorescente intensa en el punto de inyección. Y si la cantidad inyectada no es suficiente, se observará una señal fluorescente débil.

Esta figura demuestra que los morfos vivos pueden penetrar hasta unos pocos diámetros celulares dentro de la superficie ventricular y, por lo tanto, pueden dirigirse eficazmente a las células ventriculares en comparación con el control. La inyección de morfos contra PCNA reduce eficazmente la expresión génica en las células ventriculares. En estas imágenes de inmunofluorescencia, las tinciones inmunológicas de BRDU y QCD tras un experimento de pulso-cacería A-B-R-D-U demuestran que la inhibición de PCNA mediante morfos antisentido conduce a una reducción significativa de neuronas recién formadas, lo que sugiere que la CVMI puede utilizarse para silenciar genes endógenos que posteriormente producen consecuencias funcionales.

Por lo tanto, tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran los mecanismos moleculares implicados en la respuesta de neurogénesis regeneradora del cerebro de adultos de S de peces.