Name: Imágenes y Reconstrucción 3D de Estructuras Embrionarias cerebrovasculares en pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-22T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Aprende a evaluar estructuras cerebrovasculares en embriones de Danio rerio mediante microscopía confocal y reconstrucción 3D. Este método permite estudiar la angiogénesis y los efectos de tratamientos químicos.

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Los autores agradecen a los miembros pasados ​​y presentes de nuestros laboratorios que ayudaron a desarrollar estas técnicas. Parte de la financiación proporcionada al DE por una subvención del Instituto de California para la Medicina Regenerativa / CIRM (RN1-00538).

1. Pez cebra Cría, generación de embriones, y Tratamiento <ol><li> Llevar a cabo los siguientes protocolos de pez cebra, bajo la guía de un cuidado de los animales y el uso comité institucional (IACUC) y dentro de las pautas de cuidado de animales de la NIH u otros organismos / directrices reguladoras. </li><li> Cepas de pez cebra que expresan proteínas fluorescentes en tejidos específicos, células u órganos están disponibles en el Centro Internacional de Recursos de pez cebra (ZIRC). Por ejemplo, la Tg (KDR: EGPF) s843 expresar EGFP en células endoteliales vasculares 6, que se pueden usar para producir estructuras vasculares 3D completos como se muestra en este protocolo. Otras líneas de pez cebra transgénico están disponibles en ZIRC. </li><li> Casa pez cebra adulto en un sistema de acuicultura apropiada que monitoriza el pH, la salinidad, la temperatura, el oxígeno disuelto, la luz y otros factores ambientales 7. El pez cebra muestra aquí fueron alojados en un sistema de Aquaneering Inc. (San Diego, CA) a 28,5 ° C con un lig 14 horasoscuridad ciclo ht/10 horas. Alimente adultos de pez cebra con una dieta equilibrada de artemia y NRD 4.6 Alimentos para peces (Artemia directo, Ogden, Utah). </li><li> Varón adulto y el pez cebra hembra en edad reproductiva deben ser alojados por separado para aumentar el éxito de apareamiento. </li><li> Estimular la puesta de huevos y la fertilización mediante la colocación de las hembras (2-4) y los varones (4-6) juntos en un contenedor de acoplamiento que tiene un fondo de malla con agujeros lo suficientemente grandes como para que los huevos caen a través de, pero era demasiado pequeña para los adultos de pez cebra para pasar . Configure apareamientos la noche antes; huevos se ponen cerca de la madrugada, por lo general, mientras que el ciclo de luz diurna aumenta lentamente en intensidad (amanecer). Entrada para los huevos en la parte inferior del recipiente de apareamiento cada 15-30 minutos. </li><li> Recoger los huevos usando un colador de malla y limpia con tampón E3 (NaCl 5 mM, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO4). La transferencia de los huevos a 100 mm placas de cultivo llenos de buffer de E3 y almacenar en una incubadora de 28 ° C. </li><li> Para estudiar los productos químicos que alteran CERebrovascular ramificación agregar concentraciones químicas deseadas. Por ejemplo ramificación neovasular puede ser inducida con inhibidor de la γ-secretasa (GSI IX/DAPT/N- [N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanil)] éster-S-phenylglycinet-butil) solubilizado en DMSO al 4, comenzando 24 horas después de la fecundación (HPF). En aquel tiempo los embriones puntos siguen estando dentro del corion, y muchas sustancias químicas pueden pasar a través de él 8. Si una condición de tratamiento tiene neuronales o motoras efectos que perjudiquen la capacidad de los embriones de liberarse del corion, a continuación, los embriones deben ser-chorionated des entre 24 y 48 HPF, que se pueden hacer con fórceps de pronasa 2. Los embriones que se muestran en las imágenes proporcionadas fueron dechorionated agarrando suavemente el corion con dos pinzas afiladas y lagrimeo abierto. </li><li> Si es necesario / deseado, la formación de pigmento puede ser inhibida por la adición de 0,003% de N-feniltiourea (PTU) a la memoria intermedia de E3 a 24 HPF. </li></ol> 2. Confocal de Cerebrovascular Structdas en fijo embriones de pez cebra <ol><li> Sacrificio embriones en 250 mg / L tricaína metanosulfonato, y luego arreglarlos por inmersión en 2-4% de paraformaldehído la noche a 4 ° C. Los contenedores con embriones fluorescentes deben ser envueltos en papel de aluminio. Una vez fijado, los embriones deben ser almacenados en PBS a 4 ° C hasta fotografiado - intensidad de la fluorescencia de EGFP se vuelve menos resuelto después de una semana, pero la morfología (como se ve en campo claro) se conserva mucho más tiempo. </li><li> Preparar para montar el embrión mediante la eliminación de primero un ojo usando una aguja de tungsteno afilado. Cortar alrededor del tejido que conecta el ojo primero y luego cortar los músculos, y finalmente cortar el nervio óptico para desplazar el ojo. (Nota: Si quita proyección de imagen los dos lados se desea ambos ojos.) </li><li> Una vez que se retira el ojo, montar el embrión en un cubreobjetos usando una gota de 3% de metilcelulosa. Orientar el embrión de manera que el lado con el ojo extraído se enfrenta el cubreobjetos y es lo más cercano al vidrio como sea posible. Cubrir todo el embrión con metillcellulose para evitar la desecación durante la exploración. </li><li> Imagen del embrión montado inmediatamente utilizando un microscopio confocal invertido equipado con una alta calidad de objetivo de 20x Plan de Apo (apertura numérica = 0.75 o superior). Esta configuración es preferible un microscopio no invertida que requeriría intercalando el embrión entre dos planos de vidrio, y presionando el embrión contra el cristal superior. </li><li> Recoger rebanadas ópticos en 1 m incrementos mediante un ajuste de la abertura mediana o grande. Pasos más grandes de 2,5 m también se pueden utilizar, pero puede ser más difícil para determinar el orden espacial de los objetos más pequeños. Las aberturas pequeñas producen detalle más agudo, pero las exploraciones más largos requeridos pueden blanquear EGFP y también limitar la profundidad de formación de imágenes en el embrión que se puede lograr. Un microscopio confocal permite la formación de imágenes a mitad de camino a través de un embrión. </li><li> Si se desea la formación de imágenes de todo el pescado, retire los dos ojos al principio (véase la nota en el paso 3.2), gire el embrión después imaging un lado y repita los pasos 2.3 a 2.5 para el lado opuesto. </li></ol> 3. Reconstrucción 3D de Embryonic pez cebra cerebrovasculatura <ol><li> Utilice la distribución Fiji 3 de ImageJ código abierto (http://fiji.sc), que está optimizado para representaciones en 3D, de forma gratuita, y es compatible con PC, Mac y Linux. </li><li> Importar pilas confocal a Fiji por ir a Plugins&gt; LOCI&gt; BioFormats Importador 9 a continuación, seleccione el archivo confocal, por ejemplo name.ids para pilas de Nikon (Figura 2A). Seleccione Ver pila con el modo HyperStack, color: escala de grises, compruebe autoescala, compruebe canales divididos. </li><li> Estas selecciones se abrirán cuatro paneles de canales separados; para EGFP único se necesitarán, por lo general el tercero hacia abajo. Cierre los otros tres paneles (rojo, azul y alfa) dejando la imagen de 16 bits con un nombre largo, seguido de C = 1 (Figura 2A). </li><li> Ajuste de umbral en los escaneos aunque la imagen utilizando el desplazamiento tab en la parte inferior para encontrar un sector que tiene la región o estructura de interés, a continuación, ir a Imagen&gt; Ajustar&gt; Umbral (Figura 2 C). </li><li> En el panel que aparece, deslice la barra superior (nivel de negro) a la izquierda de modo que la estructura se puede ver bastante bien sobre el fondo, y dejar la corredera inferior (nivel de blanco) donde es (Figura 2D). Seleccione B &amp; W, seleccione Fondo oscuro. No seleccione Umbral calcular para cada imagen a menos que se requieren diferentes ajustes para cada sector, seleccione fondo Negro. Este proceso crea una nueva imagen de 8 bits. </li><li> ADVERTENCIA: El umbral no se puede deshacer o guardado en ImageJ, por lo que la pila confocal tendrá que volver a cargar cada vez que se necesita un cambio. Anote los números y probar diferentes configuraciones hasta conseguir el resultado deseado. </li><li> Ir a Plugins&gt; 3D Visor&gt; Umbral 0, Remuestreo factor de 1 (mejor) o 2 (bueno), anule la selección de los cuadros de color rojo y azul para hacer una salida de 3D verde - de lo contrario, will producir una representación blanco - seleccione Aplicar (no automático) (Figura 2E). </li><li> Girar, girar y ampliar o reducir la imagen 3D con el ratón y los controles del teclado (Figura 2F). </li><li> Guardar imágenes fijas en cualquier momento mediante el uso de la opción de captura en el menú. El tamaño del cuadro de imagen en la pantalla dicta dimensiones en píxeles de la imagen producida por lo que si una imagen de alta resolución se desea hacer la caja más grande, arrastre la esquina inferior derecha. </li><li> Crear una película que hace girar 3D seleccionando Ver&gt; Registro de la rotación de 360 grados (Figura 2G). Incumplimientos de rotación a 2 grados por paso, pero se puede cambiar a los 5 grados, por ejemplo, lo que creará tamaños de archivos mucho más pequeños, pero pueden agregar sacudidas a la animación. </li><li> Guarde el archivo en uno de los varios formatos disponibles para su posterior visualización con los reproductores multimedia, subir a Internet, o utilizar en presentaciones de PowerPoint. La fuente reproductor multimedia abierto, VLC ( <a href="http://www.videolan.org/vlc/index.html">ht</a>tp :/ / www.videolan.org / vlc / index.html), es gratuita y se ocupa de estos videos muy bien. </li></ol>

<ol><li>Staudt, D., Stainier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+the+molecular+and+cellular+mechanisms+of+heart+development+using+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish.</a> Annu Rev Genet. 46, 397-418 (2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , University of Oregon Press. (2007).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Cameron, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s-related+peptide+amyloid-%CE%B2+plays+a+conserved+role+in+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's-related peptide amyloid-β plays a conserved role in angiogenesis.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Cunvong, K., Huffmire, D., Ethell, D. W., Cameron, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-%CE%B2+increases+capillary+bed+density+in+the+adult+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Amyloid-β increases capillary bed density in the adult zebrafish retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54, 1516-1521 (2013).</li>
<li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li>
<li>Lawrence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+husbandry+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review.</a> Aquaculture. 269, 1-20 (2007).</li>
<li>Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+major+permeability+barrier+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Characterization of a major permeability barrier in the zebrafish embryo.</a> Biol Reprod. 59, 1240-1250 (1998).</li>
<li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274(2010).</li>
<li>Opitz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+zebrafish+illuminate+the+dynamics+of+thyroid+morphogenesis+and+its+relationship+to+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenic zebrafish illuminate the dynamics of thyroid morphogenesis and its relationship to cardiovascular development.</a> Dev Biol. 372, 203-216 (2012).</li>
<li>Gleave, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroanatomical+phenotyping+of+the+mouse+brain+with+three-dimensional+autofluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Neuroanatomical phenotyping of the mouse brain with three-dimensional autofluorescence imaging.</a> Physiol Genomics. 44, 778-785 (2012).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Markaki, Y., Smeets, D., Cremer, M., Schermelleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+applications+for+super-resolution+3D+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization applications for super-resolution 3D structured illumination microscopy.</a> Methods Mol Biol. 950, 43-64 (2013).</li>
<li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> J Vis Exp. 68, e4272(2012).</li>
</ol>

No hay nada que revelar.

Los métodos descritos aquí proporcionan una base para los estudios visuales del sistema vascular en el desarrollo de pez cebra. Los especímenes vivos se pueden utilizar para evaluar los parámetros fisiológicos, tales como la frecuencia cardíaca y el volumen sistólico del corazón, mientras que las muestras fijas se pueden utilizar para la formación de imágenes confocal de alta resolución. Drosophila y C. elegans permite la formación de imágenes de todo el cuerpo, pero el pez cebra son vertebrados y proporcionan un modelo útil para los tejidos de vertebrados, incluyendo un sistema vascular de células forrado endotelial. Estos estudios pueden incorporar líneas transgénicas importantes y recursos genómicos de la comunidad de investigación de pez cebra. Reconstrucción 3D y renderizado de imágenes de confocal de embriones de pez cebra, tal como se describe aquí, permitir un enfoque de la biología de sistemas para la ramificación vascular y la densidad de los vasos sanguíneos que no es posible con los modelos animales más grandes, como las ratas y los ratones. Además, como amniotas pez cebra se desarrollan en un entorno modificable (tampón E3), donde se puede agregar fácilmente chemicals que inhiben las enzimas específicas u otros procesos que afectan al desarrollo vascular. La concentración y el tiempo de entrega de productos químicos pueden ser alterados, lo que permite al investigador condiciones de tratamiento para afinar. 1. Modificaciones y solución de problemas Las modificaciones de este sistema puede incorporar líneas transgénicas de pez cebra que expresan proteínas fluorescentes EGFP o otros en una variedad de tejidos, de órganos o región patrones específicos 10. Además, el análisis de los cambios neovasculares de la retina de pez cebra recientemente se ha publicado 5. Problemas con la pigmentación en embriones de pez cebra adultos mayores y pueden ser compensadas por el cruce con líneas transgénicas que no producen pigmentos escala o pigmentario de la retina. Problemas con fluorescencia disminuida resultan típicamente de fijación de condiciones inapropiadas. El paraformaldehído (4%) durante 1 día es el óptimo, pero fijadores más fuertes, tales como glutaraldehído, tetróxido de osmio o alcohol, mayodestruir EGFP fluorescencia. Después de la fijación, los embriones deben mantenerse en PBS a 4 ° C y siempre protegidos de la luz directa del sol. 2. Limitaciones de esta técnica La calidad y la resolución de representaciones en 3D producidas con este protocolo dependen de la calidad de las imágenes generadas. Penetración de la luz a través de estos embriones se limita al plano sagital medial utilizando un microscopio confocal estándar. Este aspecto de la imagen limita la profundidad de las imágenes en los embriones de más edad y los adultos, pero los sistemas de microscopía multifotónica más avanzados permiten la proyección de imagen a mayores profundidades. 3. Importancia con respecto a los métodos existentes Este protocolo proporciona un enfoque para el análisis de redes de vasos sanguíneos en un nivel de sistemas que puede incorporar un animal entero. Representaciones anteriores de tales datos a menudo se basaban en serie de imágenes dispuestas juntos, pero 3D proporciona una mejor resolución de la relación espacialciones implicadas. 4. Las futuras aplicaciones Nuevos avances en la formación de imágenes y procesamiento de tejidos ofrecerá muchas nuevas aplicaciones para estos métodos que pueden incluir hacer embriones de más edad o adultos transparente 11-14. Mayor transparencia aumentará en gran medida la penetración del tejido por los láseres confocal y multi-fotón. Además, como la velocidad de las cámaras y los tubos fotomultiplicadores aumentar pronto podría ser posible producir representaciones en 3D de peces en tiempo real, proporcionando una 4 ª dimensión de análisis. 5. Los pasos críticos Un paso crítico en este protocolo es la preparación para la formación de imágenes, que incluye la fijación adecuada. Imaging se debe hacer lo más pronto posible después de la fijación de los objetivos de alta calidad que tienen las mejores aperturas numéricas disponibles. Resolución depende del sistema de imagen utilizado, por lo que los sistemas de alta calidad son generalmente mejores. La generación de representaciones en 3D requiere mucha memoriaPorque de esta manera nuevos, computadoras de alta gama con una gran cantidad de memoria y buenos procesadores gráficos son recomendables. El sistema de la biología visual descrito aquí ha sido optimizado para el pez cebra transgénico que expresan EGFP en células endoteliales vasculares, aunque estos métodos se pueden adaptar a los embriones transgénicos que expresan la GFP, o de otras proteínas fluorescentes, en las poblaciones de neuronas, músculos, glándulas o de cualquier número de otras células. La principal ventaja de trabajar con este sistema es la posibilidad de estudiar lo que está sucediendo en todo el embrión en cualquier momento durante este período de desarrollo, en los animales fijos y / o en vivo.

El pez cebra proporciona un potente sistema para estudiar la biología del desarrollo, y la transparencia relativa de sus embriones es susceptible a los estudios basados ​​en la imagen 1. El pez cebra ahora se ha utilizado como un modelo para el desarrollo de vertebrados durante décadas. Teleósteos, incluyendo el pez cebra, tienen un sistema vascular vertebrados simplificado que no tiene homólogo razonable en los invertebrados. La sangre es bombeada desde la cámara anterior de un corazón de dos cámaras a través de las branquias, donde se oxigena. La sangre de las branquias converge en la aorta dorsal y pasa a través de las arterias que se ramifican en vasos más pequeños y más pequeños, eventualmente capilares alcance en tejidos de órganos. Dentro de oxígeno capilares se libera y el dióxido de carbono es absorbido. En el lado venoso de los capilares de la sangre fluye hacia las venas más grandes y más grandes y finalmente se introduce en la cámara posterior del corazón, donde el ciclo se repite. Un pez cebra adulta puede poner 200 o más huevos a la vez, y once fertilizado, se desarrollan rápidamente 2. Dentro de un día al eje del cuerpo está bien desarrollada, incluyendo los músculos que se contraen y se mueven al embrión por el interior de la membrana coriónica. De 2-7 días después de la fertilización (dpf) la mayoría de los sistemas del cuerpo a desarrollar, incluyendo los ojos y el sistema nervioso central que puede coordinar a nadar hacia la comida o lejos de la luz brillante. Hasta 7 embriones dpf son lo suficientemente pequeños para permitir la visualización con microscopia. Las líneas transgénicas que expresan proteínas fluorescentes se pueden obtener imágenes con microscopía confocal o de fluorescencia. Confocal de imágenes se puede combinar con el software de código abierto 3 para crear representaciones en 3D de estructuras vasculares completos en embriones de pez cebra que ofrecen una perspectiva de la biología de sistemas del desarrollo vascular. Estudios relacionados con los cambios en la complejidad vascular y cerebrovascular se beneficiarán de este protocolo, ya que permite un análisis a nivel de sistemas de redes vasculares 4,5. Una compilación de los métodos y recursos son proporcionard para permitir una fácil adopción y de estas técnicas para los estudios que requieren de formación de imágenes de estructuras vasculares en embriones de pez cebra. La eficiencia de costes del pez cebra como un modelo animal es la combinación con tecnologías de la imagen emergentes para proporcionar nuevas plataformas con las que evaluar los efectos angiogénicos de vías moleculares en el desarrollo de vertebrados y la homeostasis.

<table><tbody><tr><td>N &ndash; Feniltiourea&nbsp;</td><td>Alfa Aesar, catálogo #41972</td><td></td><td>0.2 M en búfer E3, mantenido en 4 &#176; C</td></tr><tr><td>Tampón E3</td><td>Sigma</td><td></td><td>5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4</td></tr><tr><td>Microscopio confocal&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>D-EclipseC1 en una Nikon TE-2000U</td></tr><tr><td>Platos con fondo de vidrio</td><td>Mat-Tek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSI IX/DAPT</td><td></td><td></td><td>N-[N-(3,5-Difluorofenacetil-L-alanil)]-S-fenilglicineta-éster butílico EMD Biosciences</td></tr><tr><td>24 placas de pocillos&nbsp;</td><td>Becton-Dickinson, cat# 351147</td><td></td><td>Pipetas de transferencia BD Falcon</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>VWR, cat #414004-001</td><td></td><td>Pipetas de transferencia desechables VWR</td></tr><tr><td>Metilcelulosa&nbsp;</td><td>Alfa Aesar, cat#43146</td><td></td><td>3% en tampón E3</td></tr><tr><td>NRD 4/6 Alimento para peces&nbsp;</td><td>Camarones en salmuera Camarones en salmuera secos directos</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Camarones en salmuera Alambre</td><td></td>de tungsteno vivo <td></td></tr><tr><td>directo &nbsp;</td><td>Piezas Pequeñas # TW-016-60</td><td></td><td>0.016" OD</td></tr><tr><td>Tricaína</td><td>VWR # 101107-950</td><td></td><td>Tricaína metanosulfonato 250 mg/L en tampón E3</td></tr></tbody></table>

imágenes y reconstrucción 3d de estructuras embrionarias cerebrovasculares en pez cebra

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

El pez cebra son una poderosa herramienta para estudiar la biología del desarrollo y la patología en vivo. El pequeño tamaño y la transparencia relativa de embriones de pez cebra los hacen particularmente útiles para el examen visual de los procesos tales como el corazón y el desarrollo vascular. En varios estudios recientes pez cebra transgénico que expresan EGFP en las células endoteliales vasculares se utilizaron para la imagen y analizar las redes vasculares complejas en el cerebro y la retina, utilizando microscopía confocal. Las descripciones se proporcionan a preparar, tratar y la imagen embriones de pez cebra que expresan mayor proteína verde fluorescente (EGFP), y luego generar representaciones 3D integrales del sistema cerebrovascular. Los protocolos incluyen el tratamiento de embriones, la imagen confocal, y protocolos de fijación que preservan la fluorescencia de EGFP. Además, se proporcionan consejos útiles sobre la obtención de imágenes de alta calidad de las estructuras vasculares cerebrales, como la eliminación del ojo sin dañar el tejido neural cercano. Peligros potencialescon la imagen confocal se discuten, junto con los pasos necesarios para generar reconstrucciones en 3D de pilas de imágenes confocal utilizando software de código abierto disponible gratuitamente.

La reconstrucción 3D de estructuras vasculares proporciona una perspectiva global y visualmente interesante de desarrollo del pez cebra. Figuras métodos 1 y 2 muestran ya que normalmente realizan. Figura 3 muestra varios ángulos de estructuras vasculares en un 6 dpf embrión de pez cebra que expresa EGFP en células endoteliales. Con un color verde o blanco sólido que puede ser difícil de apreciar intensidad de la señal; seudo-coloración proporcionar intensidad de la imagen de una tabla de consulta y permite una mejor percepción de la profundidad cuando las estructuras se superponen. Un ejemplo de una imagen en 3D pseudo-color de la vasculatura en un 6 dpf pez cebra se proporciona en la Figura 4. Fluorescencia de formación de imágenes de embriones vivos se puede utilizar para estudiar las características fisiológicas que incluyen el ojo y el movimiento del cuerpo, y la actividad cardíaca. Figuras 3 y 4 mostrar resultados representativos obtenidos con estos métodos, utilizando la línea de pez cebra transgénico<html> descrito. Imágenes de resolución depende de las características de microscopio, pero el brillo de la señal de EGFP es suficiente para una buena calidad de imagen con la mayoría de los sistemas comerciales. Reconstrucción y rendición de representaciones en 3D, es consistente y opciones dentro de este software de código abierto proporcionan consistentemente buenos resultados. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. Eliminación de ojos. A) Un embrión 3 dpf fija con una necesidad de tungsteno situado al lado del ojo. El tejido se cortó alrededor del ojo a partir de esta posición. B) El ojo es cae y los músculos oculares subyacentes y el nervio óptico se cortan. La cuenca vacía está indicado con el círculo de trazos. C) El mismo embrión se dio la vuelta y montado con metil-celulosa, con el ojo intacto hacia arriba.<html> hres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2. Paso a paso la reconstrucción 3D de una pila de imagen confocal. A) Abrir el archivo (4104.1.ids) cargado en Fiji usando Plugins&gt; LOCI&gt; BIOFORMAT seleccionar. B) Después de encontrar un sector con la región de interés, se selecciona el ajuste de umbral como se muestra. C) Threshold se ajusta al 214 utilizando la parte superior se selecciona slider y aplicar. espectador D) 3D se llama como se muestra. E) La reconstrucción 3D se muestra de un pez cebra con el ojo intacto, para la orientación. F) La imagen ha sido ampliada y se hace girar. G) Una película de la rotación de 360 grados se hace como se muestra.<html> res.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3. Perspectivas de la reconstrucción 3D. A) perspectiva medial de 6 embriones dpf reflejado con objetivo de 10x, la boca está a la derecha, no branquias dentro de la boca. B) lateral del mismo embrión, nota aleta es un bucle en el medio. C) El mismo embrión reflejado con objetivo 20x, perspectiva medial, la resolución de enmalle nota. D) La perspectiva lateral de 20x de imagen objetivo. La aleta está en el borde derecho del panel. E) vista antero medial de 20x de imagen objetivo, branquias nota dentro de la boca. F) Abdomen del mismo embrión fotografiado con un objetivo de 20x, la cabeza hacia la derecha. Nota vasculatura en el saco de la yema en la parte inferior derecha.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4. Diferencias de intensidad en 6 dpf embrión. Imagen de una reconstrucción 6 dpf usando un look-up-tabla pseudocolor para la intensidad de la señal. Boca, el cerebro, branquias y saco vitelino están etiquetados para la orientación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still.jpg" width="500" /> Figura 5. Película del sistema vascular reconstruida en un pez cebra 4 dpf. El pescado fue fotografiada en el 2,5 micras. Las imágenes erande imagen una media del embrión. Comparar las estructuras vasculares con estructuras en un pez cebra tratados-GSI proporcionadas en la Figura 6. Tenga en cuenta la menor densidad de los vasos sanguíneos en la cabeza y branquias más grandes. (Consulte el archivo complementario &quot;Zfish_spin.avi&quot; zona de descargas) <img alt="La figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still1.jpg" width="500" /> Figura 6. 3D Movie del sistema vascular en el embrión tratado-GSI en 4 dpf. El pescado fue fotografiada en el 2,5 micras a través de lateral a la línea media. Comparar las estructuras vasculares con el control 4 dpf peces se muestra en la Figura 5. La espalda arqueada y el tamaño más pequeño son típicos en los embriones tratados con este producto químico. (Ver la &quot;GSI-treated_4dpf_fish.avi&quot; archivo suplementario en Descargas)

Imágenes del desarrollo cerebrovascular en larvas de pez cebra se describe. También se proporcionan técnicas para facilitar la proyección de imagen 3D y modificar desarrollo cerebrovascular el uso de tratamientos químicos.

Imágenes y Reconstrucción 3D de Estructuras Embrionarias cerebrovasculares en pez cebra

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar las estructuras cerebrovasculares en peces cebra embrionarios. Esto se logra primero recolectando huevos fertilizados de pez cebra y estableciendo las condiciones de tratamiento. Después de un período de crecimiento de tres días, los peces cebra son sacrificados, fijados y se extrae cuidadosamente un ojo antes de montar la muestra sobre un cubreobjetos.Luego, la vasculatura cerebral se imagina mediante microscopía confocal. Finalmente, se generan representaciones tridimensionales (3D) de la vasculatura utilizando software de código abierto. En última instancia, el análisis de las reconstrucciones se utiliza para determinar los efectos de las condiciones de tratamiento sobre la ramificación y densidad de los vasos sanguíneos.En el cerebro en desarrollo del pez cebra. Esta técnica evalúa todo el sistema vascular de los embriones de pez cebra. Nos ha permitido estudiar la biología de la beta amiloide a nivel de sistemas orgánicos.La demostración visual de este método es fundamental, ya que la disección y el análisis de imágenes son difíciles de aprender debido a su complejidad técnica. Para comenzar, críe una cepa transgénica de pez cebra que exprese la proteína verde fluorescente mejorada en los tejidos deseados a 28,5 grados Celsius con un ciclo de 14 horas de luz y 10 horas de oscuridad. En este ejemplo, los peces transgénicos que expresan EGFP en células endoteliales vasculares se crían la noche anterior al montaje de la recolección de huevos; coloque machos y hembras en tanques de apareamiento con fondos de malla. A la mañana siguiente, retire el divisor y permita que los peces se apareen, verificando la presencia de huevos cada 15 minutos.Después de usar un colador de malla para recoger los huevos y E tres medio para lavarlos, utilice E tres para transferir los huevos a placas de cultivo de 100 milímetros e incubarlos a 28 grados Celsius para alterar la ramificación cerebrovascular. A partir de las 24 horas post-fecundación, añada un compuesto químico, como un inhibidor de la gamma secretasa solubilizado en DMSO. Si se desea, añada PTU al 0,03 % para inhibir la formación de pigmento.Después de transferir los embriones en solución a los pocillos de una placa de 12 pocillos, incubar a 28,5 grados Celsius hasta que los embriones alcancen la etapa de desarrollo deseada. Después de sacrificar los embriones en trica y fijarlos con aldehído durante la noche a cuatro grados Celsius, almacenar los embriones en PBS en la oscuridad a cuatro grados Celsius.Para extraer el ojo del embrión, utilice una aguja de tungsteno afilada y corte alrededor del tejido que conecta un ojo. Luego, corte los músculos y finalmente el nervio óptico para remover el ojo. Una vez extraído el ojo, dé la vuelta al embrión sobre un cubreobjetos, colocando la cuenca ocular vacía hacia abajo, en contacto con el cubreobjetos.Agregue una gota de metilcelulosa al 3 % para mantener al embrión en su lugar y cubrirlo por completo con el fin de prevenir la desecación. Durante la adquisición de imágenes mediante un microscopio confocal invertido con un objetivo plan APO 20x, observe inmediatamente el embrión; muchos sistemas de imagen solo podrán resolver estructuras vasculares hasta la mitad de esta muestra. Si este es el caso, suspenda el embrión en PBS, vuelva a montarlo en el lado contralateral y realice más adquisiciones para llevar a cabo la reconstrucción tridimensional de imágenes cerebrovasculares usando ImageJ, que está optimizado para renderizaciones 3D.Importe pilas confocales yendo a complementos, loci, importador de formatos bio, y luego seleccione el archivo confocal; para pilas de Nikon, seleccione ver pila con hiper pila y configure el modo de color en escala de grises. Luego, active auto escala y dividir canales. Estas selecciones abrirán cuatro paneles de canales separados.Cierre todos los archivos excepto la imagen de 16 bits cuyo nombre de archivo va seguido de c igual a uno. Ajuste el umbral utilizando la pestaña de desplazamiento en la parte inferior para recorrer las imágenes y encontrar una sección que contenga la región o estructura de interés. A continuación, vaya a imagen ajustar umbral.En el panel que aparece, deslice la barra superior hacia la izquierda para que la estructura sea claramente visible sobre el fondo, y deje la barra inferior en su lugar para crear una nueva imagen de ocho bits. Seleccione blanco y negro. Luego, fondo oscuro.No seleccione calcular el umbral para cada imagen a menos que se requieran ajustes diferentes para cada corte. A continuación, vaya a complementos, visor 3D, umbral cero, factor de remuestreo uno o dos, y desactive las casillas de color rojo y azul para generar una salida 3D verde. De lo contrario, producirá una representación blanca.Luego, seleccione aplicar. Utilice los controles del mouse y del teclado para rotar, girar y acercar la imagen 3D con el fin de guardar imágenes fijas en cualquier momento. Utilice la opción de captura en el menú.El tamaño del cuadro de imagen en la pantalla determina las dimensiones en píxeles de la imagen generada, por lo que si se desea una imagen de alta resolución, aumente el tamaño del cuadro arrastrando la esquina inferior derecha. Cree una película 3D giratoria seleccionando la opción de grabar rotación de 360 grados. Finalmente, guarde el archivo en uno de los varios formatos disponibles y utilice el reproductor multimedia gratuito y de código abierto VLC para ver contenido 3D.La reconstrucción de estructuras vasculares proporciona una perspectiva amplia y visualmente interesante del desarrollo del pez cebra. Aquí se muestran varios ángulos de estructuras vasculares en un embrión de pez cebra de seis días post-fecundación que expresó EGFP en células endoteliales con colores monocromáticos verdes o blancos. Puede ser difícil apreciar la intensidad de la señal, pero la pseudocoloración proporciona la intensidad de la imagen a partir de una tabla de consulta, lo que permite una mejor percepción de profundidad de estructuras superpuestas.Por ejemplo, esta figura muestra una imagen tridimensional pseudo coloreada de la vasculatura en un pez cebra seis días después de la fertilización, tras su desarrollo. Esta técnica nos permitió explorar los efectos vasculares de la beta amiloide en el cerebro de un vertebrado. Después de ver este video, deberían tener una buena comprensión de cómo visualizar las redes vasculares en pececillos de cebra embrionarios, lo que proporciona un sistema económico y accesible para estudiar la angiogénesis.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este vídeo, que muestran un método para analizar el cerebro de los vertebrados en desarrollo en embriones de pez cebra en vivo con una resolución única célula mediante microscopía confocal. Esto incluye el método por el cual se inyecta el embrión del pez cebra de una sola célula y, posteriormente, montar y obtener imágenes del cerebro en desarrollo.

Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

Después de la formación del tubo neural, el neuroepitelio se contrae y se dobla mientras que el tubo se llena de líquido cefalorraquídeo embrionarias (ECSF) para formar los ventrículos del cerebro embrionario. Hemos desarrollado esta técnica de inyección del ventrículo para visualizar mejor el espacio lleno de líquido, en contraste con la forma neuroepitelial en un embrión vivo.

Cerebro del pez cebra ventrículo inyección

Imagen confocal Time-lapse es una técnica de gran alcance útil para caracterizar el desarrollo embrionario. Aquí se describe la metodología y caracterizamos la morfogénesis craneofacial de tipo salvaje, así como PDGFRA, Smad5 y smo embriones mutantes.

Analizando Craneofacial en la morfogénesis de pez cebra Utilizando 4D Microscopía Confocal

Obtener imágenes del comportamiento dinámico de orgánulos y otras estructuras subcelulares in vivo puede arrojar luz sobre su función en condiciones fisiológicas y de enfermedad. Aquí, presentamos métodos para marcar genéticamente dos orgánulos, centrosomas y mitocondrias, e imágenes de su dinámica en embriones vivos de pez cebra utilizando microscopía confocal y de campo amplio.

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

Aquí, presentamos un método de montaje versátil que permite la obtención de imágenes a largo plazo del desarrollo posterior del cuerpo de embriones vivos de pez cebra sin perturbar el desarrollo normal.

Un método de montaje versátil para largo plazo de imágenes de Desarrollo de pez cebra

La imagen in vivo es una poderosa herramienta que se puede utilizar para investigar los mecanismos celulares subyacentes al desarrollo del sistema nervioso. Aquí describimos una técnica para el uso de la microscopía confocal de lapso de tiempo para visualizar un gran número de células etiquetadas en Brainbow multicolor en tiempo real dentro del sistema nervioso de pez cebra en desarrollo.

Visualización del cerebro en desarrollo en el pez cebra vivo mediante imágenes confocales de barco iris y lapso de tiempo

Este protocolo describe un enfoque para el etiquetado in toto y la imagen multidimensional del desarrollo temprano del ojo del pez cebra. Describimos el etiquetado, la incrustación y las imágenes de cuatro dimensiones (4D) utilizando microscopía confocal de barrido láser, y las consideraciones para optimizar la adquisición de conjuntos de datos para diseccionar los mecanismos de la morfogénesis de la copa óptica.

Imágenes en 4 dimensiones de la morfogénesis de la copa óptica del pez cebra

Aquí presentamos un método para obtener imágenes del cerebro embrionario del pez cebra in vivo hasta etapas larvales y juveniles. Este procedimiento microinvasivo, adaptado de enfoques electrofisiológicos, proporciona acceso a detalles celulares y subcelulares de neuronas maduras y se puede combinar con estudios optogenéticos y neurofarmacológicos para caracterizar la función cerebral y la intervención farmacológica.

Imágenes in vivo de tejido cerebral completamente activo en larvas y juveniles de pez cebra despiertos mediante la extirpación del cráneo y la piel

Aquí se presenta un protocolo para obtener imágenes in vivo de todo el cerebro de larvas de pez cebra utilizando microscopía de fluorescencia tridimensional. El procedimiento experimental incluye la preparación de muestras, la adquisición de imágenes y la visualización.

In vivo Imágenes de todo el cerebro de larvas de pez cebra usando microscopía de fluorescencia tridimensional

Este protocolo describe un método de microscopía óptica de bajo costo para evaluar la morfología y función cardíaca en embriones de pez cebra, lo que permite una evaluación reproducible de la cardiotoxicidad del desarrollo sin la necesidad de sistemas de imágenes avanzados.

Imágenes cardíacas funcionales en embriones de pez cebra mediante microscopía estándar y análisis de video: aplicaciones en investigación ambiental y biomédica

Aprende a evaluar estructuras cerebrovasculares en embriones de Danio rerio mediante microscopía confocal y reconstrucción 3D. Este método permite estudiar la angiogénesis y los efectos de tratamientos químicos.

Imágenes y Reconstrucción 3D de Estructuras Embrionarias cerebrovasculares en pez cebra

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