Imágenes y Reconstrucción 3D de Estructuras Embrionarias cerebrovasculares en pez cebra

El objetivo general de este procedimiento es evaluar las estructuras cerebrovasculares en embriones de pez cebra. Esto se logra recolectando primero huevos de pez cebra fertilizados y estableciendo las condiciones de tratamiento. Después de un período de crecimiento de tres días, el pez cebra se sacrifica fijo y se retira cuidadosamente un ojo antes de montar el espécimen en un cubreobjetos.

A continuación, se obtienen imágenes de la vasculatura cerebral mediante microscopía confocal. Por último, se generan representaciones 3D de la vasculatura utilizando software de código abierto. En última instancia, el análisis de las reconstrucciones se utiliza para determinar los efectos de las condiciones de tratamiento sobre la ramificación y la densidad de los vasos sanguíneos.

En el cerebro del pez cebra en desarrollo. Esta técnica evalúa todo el sistema vascular del pez cebra embrionario. Nos ha permitido estudiar la biología de la beta amiloide a nivel de sistemas de órganos.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que la disección y el análisis de imágenes son difíciles de aprender porque son técnicamente desafiantes. Para empezar, cría una cepa de pez cebra transgénica que exprese proteína fluorescente verde mejorada en los tejidos deseados a 28,5 grados centígrados con un ciclo de 14 horas de luz y 10 horas de oscuridad. En este ejemplo, los peces transgénicos que expresan EGFP en las células endoteliales vasculares se crían la noche anterior a la recolección de huevos, colocan a machos y hembras en tanques de apareamiento con fondos de malla. A la mañana siguiente, retire el divisor y permita que los peces se apareen verificando si hay huevos cada 15 minutos.

Después de usar un colador de malla para recolectar los huevos y E tres medios para lavarlos, use E tres para transferir los huevos a placas de cultivo de 100 milímetros e incubarlos a 28 grados centígrados para alterar la ramificación cerebrovascular. A partir de las 24 horas después de la fertilización, agregue un producto químico como un inhibidor de la gamma secretasa solubilizado en DMSO. Si lo desea, agregue 0.03% PTU para inhibir la formación de pigmento.

Después de transferir los embriones en solución a los pocillos de una placa de 12 pocillos incubar a 28,5 grados centígrados hasta que los embriones alcancen la etapa de desarrollo deseada. Después de sacrificar embriones en trica y fijarlos con aldehído durante la noche a cuatro grados centígrados. Almacene los embriones en PBS en la oscuridad a cuatro grados centígrados.

Para extraer el ojo del embrión, use una aguja de tungsteno afilada y corte alrededor del tejido que conecta un ojo. A continuación, corte los músculos y finalmente el nervio óptico para extirpar el ojo. Una vez que se extrae el ojo, voltee el embrión sobre un cubreobjetos con la cuenca del ojo vacía hacia abajo y tocando el cubreobjetos.

Agregue una gota de metilcelulosa al 3% para mantener el embrión en su lugar y cubrir todo el embrión para evitar la desecación. Durante la obtención de imágenes con un microscopio confocal invertido con una imagen objetiva APO de 20 x plan, el embrión de inmediato, muchos sistemas de imagen solo podrán resolver las estructuras vasculares a mitad de este espécimen. Si este es el caso, resus, suspender el embrión en PBS y volver a montarlo en el lado contralateral para obtener imágenes posteriores para realizar la reconstrucción 3D de las imágenes cerebrovasculares utilizando la imagen J, que está optimizada para representaciones 3D.

Importe pilas confocales yendo a plugins, loci, importador de formatos de biografía y luego seleccione el archivo confocal para pilas Nikon, seleccione view stack with hyper stack y establezca el modo de color en escala de grises. A continuación, compruebe el escalado automático y los canales divididos. Estas selecciones abrirán cuatro paneles de canales separados.

Cierre todas las imágenes excepto la de 16 bits con el nombre del archivo seguido de c igual a uno. Ajuste el umbral mediante la pestaña de desplazamiento de la parte inferior para examinar y encontrar un sector que tenga la región o estructura de interés. A continuación, vaya al umbral de ajuste de imagen.

En el panel que aparece, deslice la barra superior hacia la izquierda para que la estructura se pueda ver bastante bien sobre el fondo y deje la diapositiva inferior donde está para crear una nueva imagen de ocho bits. Seleccione b y w. Luego fondo oscuro.

No seleccione calcular umbral para cada imagen a menos que se requieran diferentes ajustes para cada sector. A continuación, vaya a los complementos 3D viewer threshold zero resampling factor uno o two, y anule la selección de las casillas de color rojo y azul para crear una salida 3D verde. De lo contrario, producirá una representación en blanco.

A continuación, seleccione aplicar. Utilice los controles del ratón y del teclado para girar, girar y hacer zoom en la imagen 3D y guardar imágenes fijas en cualquier punto. Utilice la opción de captura en el menú.

El tamaño del cuadro de imagen en la pantalla dicta las dimensiones en píxeles de la imagen producida, por lo que si desea una imagen de alta resolución, haga el cuadro más grande arrastrando la esquina inferior derecha. Cree una película 3D giratoria seleccionando ver, grabar, girar 360 grados. Finalmente, guarde el archivo en uno de los varios formatos disponibles y use el reproductor multimedia gratuito de código abierto VLC para ver en 3D.

La reconstrucción de las estructuras vasculares proporciona una perspectiva completa y visualmente interesante del desarrollo del pez cebra. Aquí se muestran varios ángulos de las estructuras vasculares en un embrión de pez cebra seis días después de la fertilización que expresaba EGFP en células endoteliales con colores verdes o blancos monocromáticos. Puede ser difícil apreciar la intensidad de la señal, pero el pseudocoloreado proporciona la intensidad de la imagen a partir de una tabla de búsqueda, lo que permite una mejor percepción de la profundidad de las estructuras superpuestas.

Por ejemplo, esta figura muestra una imagen 3D pseudo coloreada de la vasculatura en un pez cebra seis días después de la fertilización después de su desarrollo. Esta técnica nos permitió explorar los efectos vasculares de la beta amiloide en el cerebro de un vertebrado. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar las redes vasculares en el pez cebra embrionario, lo que proporciona un sistema económico y accesible para estudiar la angiogénesis.