La generación de cardiomiocitos humanos: Protocolo de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas Feeder libres

El objetivo general de este procedimiento es diferenciar cardiomiocitos humanos a partir de células IPS humanas cultivadas en condiciones libres de alimentador. Esto se logra primero sembrando las células IPS en placas de adherencia ultrabaja para formar cuerpos embrionarios. El segundo paso del procedimiento consiste en transferir los cuerpos embrionarios formados a placas recubiertas con gelatina.

Cuando aparecen áreas contráctiles, se disecan manualmente bajo el microscopio estereoscópico y se siembran en placas recubiertas con fibronectina. Para una mayor diferenciación, el paso final consiste en obtener cardiomiocitos individuales mediante digestión enzimática de los grupos contráctiles. En última instancia, los resultados pueden mostrar la diferenciación de células similares a cardiomiocitos que expresan marcadores estructurales típicos, es decir, troponina cardíaca mediante microscopía de inmunofluorescencia.

Este método puede ayudar a responder una pregunta clave en el campo de la biología cardiovascular, como, cuáles son los mecanismos que impulsan la diferenciación y disfunción cardíacas durante el desarrollo cardiaco y las enfermedades a nivel del cardiomiocito humano. Esta es una técnica muy interesante porque permite la generación de cardiomiocitos in vitro a partir de pacientes humanos e individuos humanos. Y en segundo lugar, permite la recapitulación de la enfermedad en el tubo de ensayo, de modo que se puedan experimentar nuevos fármacos in vitro antes de pasar a estudios in vivo.

Comience la experimentación con cultivos de células IPS confluentes crecidos en placas de 35 milímetros recubiertas con matrigel. Reemplace el medio de crecimiento con un mililitro de PBS que contenga un miligramo de diss. Examine las células utilizando pipetas de vidrio pulidas.

Elimine las regiones con células diferenciadas, como estructuras con forma de cráter o quísticas en el centro de las colonias. También elimine cualquier área donde las células se hayan separado, aplanado y parezcan estar migrando hacia afuera. A continuación, incube las células restantes a 37 grados Celsius bajo una campana de cultivo hasta que los bordes de las colonias se vuelvan más brillantes y comiencen a desprenderse.

Esto generalmente toma entre cinco y siete minutos. En este punto, retire la solución dispa y lave las células con un mililitro de HESM. Luego deseche la solución de lavado.

En un mililitro fresco de HESM, utilice un lifter celular para recolectar las colonias. Recopile las colonias en un tubo de 15 mililitros. A continuación, enjuague las células con otro mililitro de HESM y centrifúguelas a 1000 ×g durante cuatro minutos.

Luego, continúe con la siembra de las células en matrigel y cambie el medio diariamente durante el cultivo. Comience por recolectar colonias IPS indiferenciadas según se describió en la sección anterior. Una vez que se hayan aislado las poblaciones indiferenciadas, suspenda suavemente estas en un mililitro de EBM 20.

Utilizando una pipeta de dos mililitros, no desagregue demasiado los agregados celulares. Limite la pipetación a dos o tres movimientos. Verifique el tamaño de las colonias bajo el estereoscopio entre cada movimiento.

Cuando las colonias tengan todas aproximadamente el mismo tamaño, no necesitan mezclarse más. Ahora siembre las células en placas de adherencia ultrabaja, utilizando una placa de seis pocillos por cada placa de células recolectadas. No olvide enjuagar el tubo con un mililitro de EBM 20 y distribuir el enjuague en la placa.

Después del tercer día de incubación, cambie el medio utilizando un microscopio para evitar la eliminación de los cuerpos embrionarios. Mantenga la pipeta cerca del borde de la placa. En el séptimo día, transfiera los cuerpos embrionarios a placas recubiertas con gelatina al 0,1 % calentadas a 37 grados Celsius durante 30 minutos.

Añada de 35 a 40 cuerpos embrionarios a cada placa de 35 milímetros en dos mililitros de medio. Durante el cultivo, cambie el medio regularmente dos veces por semana.

Revise los cuerpos embrionarios en busca de áreas con latidos y marque la ubicación de dichas áreas. En la parte superior de la tapa del recipiente, las áreas con contracciones deben aparecer aproximadamente entre los 10 y 20 días. Cuando aparezcan áreas con contracción espontánea, cambie su medio a EBM dos. Después de que aparezcan las áreas contráctiles, continúe el cultivo y la monitorización de otras áreas en la placa durante un mes como máximo.

En total. En EBM, la deficiencia del proceso de diferenciación depende en gran medida de varios factores, siendo los más críticos las líneas celulares específicas y el lote de suero utilizado para inducir la diferenciación cardíaca. Para obtener la máxima eficiencia, pruebe varias líneas para su potencial cardiogénico y diversos lotes de suero. Comience recubriendo 12.

Las placas con cinco microgramos por centímetro cuadrado de fibronectina en PBS, 300 microlitros por pocillo, deben cubrir completamente la superficie de cada pocillo. Deje que las placas sequen destapadas en una cabina de cultivo celular. Para eliminar el área de formación de gotas del cultivo celular, utilice una pipeta de vidrio estirada y un escalpelo.

Luego, utilizando una pipeta de un mililitro, transfiera de cuatro a cinco pinzas a cada pocillo de una placa recubierta con fibronectina. Una vez que se hayan realizado todas las recolecciones, agregue un mililitro de EBM dos a los pocillos cargados en la placa de recolección y marque las áreas de las que se eliminaron células. A continuación, cambie el medio y regrese la placa al flujo laminar.

Si se requieren agregados más pequeños que laten bajo un microscopio estereoscópico, pase las áreas explantadas a través de una pipeta. Esto produce pequeños grupos que contienen algunas células latentes. En cultivo.

Cambie el medio dos veces por semana hasta que estén listos para el análisis. Primero, prepare portaobjetos cuadrados de cuatro centímetros con dos cámaras recubriéndolos con 20 microgramos de fibronectina diluidos en suficiente PBS para cubrir la superficie. Si se utiliza un soporte de vidrio, agregue 20 microgramos adicionales de laminina.

Aísle el área de cultivo con perlas como se describió anteriormente. Utilizando una pipeta de un mililitro, transfiera las células a un tubo de 15 mililitros que contenga 500 microlitros de tubo de colagenasa. Incube las células durante 15 minutos y agite el tubo una vez durante la incubación.

Después de 15 minutos, pase las células a través de una pipeta de 200 microlitros para eliminar los agregados si aún quedan. Transfiera las células a colagenasa dos fresca y repita la incubación cuando no queden agregados grandes. Finalice la digestión añadiendo tres mililitros de EBM dos sin ácido ascórbico según se preparan cada uno.

Guarde los tubos en una placa calefactada bajo la campana extractora y luego centrifúgelos a 1000 veces G durante cuatro minutos a temperatura ambiente. Una vez centrifugados, prepare una suspensión de las fracciones celulares del mismo muestra inicial en un mililitro de tripsina-EDTA al 0,25 % en PBS. A continuación, incube la suspensión durante cinco minutos en el bloque calefactor e inactívela la tripsina con cuatro mililitros de EB M2 sin ácido ascórbico.

A continuación, pase las células a través de una aguja de calibre 18 en una jeringa de 2,5 mililitros hasta siete veces, hasta que no se observen grandes agregados al microscopio. Luego, centrifugue las células a 1000 veces G durante cuatro minutos. Ahora, resuspenda el sedimento celular en E BM dos e incube en portaobjetos con dos cámaras.

Las células estarán listas para los análisis tras dos o tres días de incubación. Los CMS se generaron a partir de varias líneas de células IPS. Estas líneas se generaron inicialmente en una capa alimentadora de metilo e inmediatamente se colocaron en matrigel utilizando un medio definido.

Las células mostraron una morfología similar a la de las CSE humanas, con bordes brillantes en contraste de fase y núcleos prominentes. El análisis de inmunofluorescencia mostró que las células IPS expresaron correctamente el factor de transcripción T four y expresaron el antígeno de superficie TRA one 60. El análisis citofluorométrico confirmó la expresión de antígenos de superficie típicos de pluripotencia, SS EEA four y TRA one 60.

La estrategia de selección se muestra en el gráfico de dispersión izquierdo. También se realizó un análisis de cariotipo de las células FS IP cultivadas en gel de matriz. La inducción hacia la línea cardíaca se desencadenó mediante la agregación de las células IPS en cuerpos embrioides, junto con el cultivo en presencia de un tipo específico de suero.

Y dado que las áreas con contracción por ácido sórbico representaban entre el 20 y el 35 % de la cultura total, dependiendo de la línea celular utilizada. Los CMS contráctiles se aislaron de estas regiones mediante digestión enzimática y se analizó su expresión proteica. La R-T-P-C-R detectó expresión de canales iónicos específicos cardíacos en las células latientes derivadas de IPS, pero no en las células no latientes.

Estos canales incluyeron una alfa uno, una subunidad de un canal de calcio dependiente del voltaje, una subunidad alfa de un canal de sodio sensible al voltaje de tipo cinco, un canal de potasio sensible al voltaje de la subfamilia tipo KQT y ambas formas de miosina. El análisis de inmunofluorescencia de la cadena pesada reveló que los cardiomiocitos individuales derivados de IPS expresaban las proteínas estructurales, actina alfa sarcomérica, troponina I cardíaca y la conexión específica cardíaca, conexina 43. Después de todo, esta técnica allanó verdaderamente el camino para la modelización de enfermedades miocárdicas in vitro y permite la experimentación con fármacos en un entorno humano sin necesidad de inyectar los fármacos en los cuerpos humanos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo mantener células IPS en condiciones libres de suero y diferenciarlas en cardiomiocitos mediante un método basado en la agregación de cuerpos embrioides.