La generación de cardiomiocitos humanos: Protocolo de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas Feeder libres

El objetivo general de este procedimiento es diferenciar los cardiomiocitos humanos de las células IPS humanas cultivadas en condiciones libres de alimento. Esto se logra primero colocando células IPS en placas de unión ultra baja para formar cuerpos embrionarios. El segundo paso del procedimiento es transferir los cuerpos embrionarios formados a placas recubiertas de gelatina.

Cuando aparecen áreas de contracción, se diseccionan manualmente bajo el microscopio estereoscópico y se colocan en placas recubiertas de fibronectina. Para una mayor diferenciación, el paso final es obtener cardiomiocitos individuales por digestión enzimática de los grupos en contracción. En última instancia, los resultados pueden mostrar la diferenciación de células similares a cardiomiocitos que expresan marcadores estructurales típicos, es decir, troponina cardíaca a través de microscopía de inmunofluorescencia.

Este método puede ayudar a responder una pregunta clave en el campo de la biología cardiovascular, como por ejemplo, cuáles son los mecanismos que impulsan la diferenciación y disfunción cardiovascular durante el desarrollo cardiovascular y las enfermedades a nivel del cardiomiocitos humano. Se trata de una técnica muy interesante porque permite la generación de cardiomiocitos in vitro a partir de pacientes humanos e individuos humanos. Y en segunda instancia, permite la recapitulación de la enfermedad en el tubo de ensayo para que se puedan experimentar nuevos fármacos in vitro antes de pasar al in vivo.

Experimentación Comience con cultivos celulares IPS confluentes cultivados en placas recubiertas de matrigel de 35 milímetros. Reemplace el medio de crecimiento con un mililitro de PBS que contenga un miligramo de diss. Examine las células con pipetas de vidrio sondeado.

Elimine las regiones con células diferenciadas, como cráteres o estructuras quísticas en el centro de las colonias. También elimine cualquier área donde las células se hayan separado, aplanado y parezcan estar migrando hacia afuera. Ahora incube las células restantes a 37 grados centígrados bajo una campana de cultivo hasta que los bordes de la colonia se vuelvan más brillantes y comiencen a desprenderse.

Esto suele tardar entre cinco y siete minutos. En este punto, retire la solución de dispa y lave las células con un mililitro de HESM. A continuación, desecha la solución de lavado.

En un mililitro fresco de HESM, use un elevador de células para cosechar las colonias. Recoge las colonias en un tubo de 15 mililitros. A continuación, enjuague las células con otro mililitro de HESM y gírelas a 1000 veces G durante cuatro minutos.

A continuación, proceda a la siembra de las células en matrigel y cambie el medio diariamente durante el cultivo. Comience cosechando colonias IPS indiferenciadas como se describe en la sección anterior. Una vez aisladas las poblaciones indiferenciadas, suspenderlas suavemente en un mililitro de EBM 20.

Con una pipeta de dos mililitros, no rompa demasiado los grumos de células. Limite el pipeteo a dos o tres carreras. Verifique el tamaño de las colonias bajo el estereoscopio entre trazos.

Cuando las colonias son todas del mismo tamaño, no necesitan mezclarse más. Ahora coloque las celdas en placas de fijación ultra baja, llenando una placa de seis pocillos por placa de células cosechadas. No olvide enjuagar el tubo con un mililitro de EBM 20 y distribuir el enjuague a la placa.

Después del tercer día de incubación, cambie el medio con un microscopio para evitar la extracción de los cuerpos embrionarios. Mantenga la pipeta cerca del borde de la placa. Al séptimo día, mueva los cuerpos de los embriones a placas recubiertas con gelatina al 0,1% calentadas a 37 grados centígrados durante 30 minutos.

Agregue de 35 a 40 cuerpos embrionarios a cada plato de 35 milímetros en dos mililitros de medio. Durante el cultivo. Cambie el medio dos veces por semana regularmente.

Revise los cuerpos de los embriones en busca de áreas de palpitación y marque dónde se encuentran las áreas de abalorios. En la parte superior de la tapa del plato, las áreas de contracción de los cordones deben aparecer después de aproximadamente 10 a 20 días. Cuando aparezcan áreas con contracción espontánea, cambie su medio a EBM dos Después de que aparezcan las áreas de contracción, continúe cultivando y monitoreando otras áreas en la placa hasta por un mes.

En total. En la MBE dos, la deficiencia del proceso de diferenciación depende en gran medida de varios factores, los más críticos de los cuales son las líneas celulares específicas y el lote de suero utilizado para inducir la diferenciación cardiovascular. Para obtener la mayor eficiencia, pruebe varias líneas para el potencial cardiogénico y varios lotes de suero Comience por el recubrimiento 12.

Las placas de pocillos con cinco microgramos por centímetro cuadrado de fibronectina en PBS: 300 microlitros por pocillo deben cubrir completamente la superficie de cada pocillo. Deje que las placas se sequen sin tapar en una campana de cultivo celular. Para eliminar el área de perlas del cultivo celular, use una pipeta de vidrio estirado y un bisturí.

Luego, usando una pipeta de un mililitro, transfiera de cuatro a cinco pinzas a cada pocillo de una placa recubierta de fibronectina. Una vez que se hayan realizado todas las recolecciones, agregue un mililitro de EBM dos a los pocillos cargados en la placa de recolección marque las áreas donde se eliminaron las células. A continuación, cambie el medio y vuelva a colocar la placa en la campana de cultivo.

Si se requieren grupos de batido más pequeños bajo un microscopio estereoscópico, pase las áreas explantadas a través de una pipeta. Esto produce pequeños grupos que contienen unas pocas células batientes. En la cultura.

Cambie el medio dos veces por semana hasta que estén listos para el análisis. Primero, prepare portaobjetos de cuatro centímetros cuadrados de dos cámaras recubriéndolos con 20 microgramos de fibronectina diluida en suficiente PBS para cubrir la superficie. Si se utiliza un soporte de vidrio, agregue 20 microgramos adicionales de laminina.

Aísle el área de cultivo de cuentas como se describió anteriormente. Con una pipeta de un mililitro, transfiera las células a un tubo de 15 mililitros que contiene 500 microlitros de colagenasa. Incubar las células durante 15 minutos y agitar el tubo una vez durante la incubación.

Después de 15 minutos, mueva las células a través de una pipeta de 200 microlitros para eliminar los grumos si quedan grumos. Transfiera las células a colagenasa fresca dos y repita la incubación cuando no queden grumos grandes. Termine la digestión agregando tres mililitros de EBM dos sin ácido tan soico como están preparados cada uno.

Guarde los tubos en una rejilla caliente debajo del capó, luego centrifugue a 1000 veces G durante cuatro minutos a temperatura ambiente. Una vez centrifugado, realizar una suspensión de las fracciones celulares de la misma muestra inicial en un mililitro de 0,25%tripsina EDTA en PBS. Luego incubar la suspensión durante cinco minutos en el bloque calentado, inactivar la tripsina con cuatro mililitros de E BM dos sin ácido como soico.

A continuación, pase las células a través de una aguja de calibre 18 en una jeringa de 2,5 mililitros hasta siete veces hasta que no se vean grandes grumos bajo el microscopio. A continuación, centrifugar las células a 1000 veces G durante cuatro minutos. Ahora vuelva a suspender el pellet de la celda en E BM dos y póngalos en dos portaobjetos de la cámara del pozo.

Las células estarán listas para los análisis después de dos o tres días de incubación. Los CMS se generaron a partir de varias líneas celulares IPS. Estas líneas se generaron inicialmente en una capa alimentadora de metanfetamina e inmediatamente se colocaron en matrigel utilizando un medio definido.

Las células mostraban una morfología similar a la ESC humana, con bordes brillantes de fase y núcleos prominentes. El análisis de inmunofluorescencia mostró que las células IPS expresaron correctamente el factor de transcripción T cuatro y expresaron el antígeno de superficie TRA one 60. El análisis citofluorométrico confirmó la expresión de antígenos de pluripotencia superficial típicos, SS EEA cuatro y TRA uno 60.

La estrategia de compuerta se muestra en el dispersor de la izquierda. También se realizó un análisis del cariotipo de las células IP FS cultivadas en gel de matriz. La inducción en el linaje cardíaco fue desencadenada por la agregación de las células IPS en ebs, junto con el cultivo en presencia de un tipo específico de suero.

Y como ácido sórbico, las áreas de contracción representaron entre el 20 y el 35% del cultivo total, dependiendo de la línea celular utilizada. Los CMS contraídos se aislaron de estas regiones mediante digestión enzimática y se analizaron para determinar la expresión de proteínas. R-T-P-C-R encontró expresión de canales iónicos específicos cardíacos expresados en las células de latido derivadas de IPS, pero no en las células no latentes.

Estos canales incluían un alfa, una subunidad de un canal de calcio dependiente del voltaje, una subunidad alfa de un canal de sodio dependiente de voltaje de tipo cinco, un canal dependiente de voltaje de potasio de la subfamilia KQT, como la subfamilia, y ambas formas de miosina. El análisis de inmunofluorescencia de cadena pesada reveló que los cardiomiocitos derivados de IPS individuales expresaban las proteínas estructurales, alfa sarcomérico, actina, troponina I cardíaca y la unión específica cardíaca, conexión 43. Después de todo, esta técnica realmente allanó el camino para el modelado de enfermedades miocárdicas in vitro y permite la experimentación de medicamentos en el entorno humano sin inyectar el medicamento en los cuerpos humanos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo mantener las células IPS en condiciones libres y diferenciarlas en cardiomiocitos a través de un método basado en la agregación de cuerpos embrionarios.