Name: La generación de cardiomiocitos humanos: Protocolo de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas Feeder libres (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Aprende a diferenciar cardiomiocitos humanos a partir de células madre pluripotentes inducidas libres de alimentador mediante un protocolo basado en cuerpos embrionarios. Este método permite obtener células cardíacas funcionales para investigación cardiovascular.

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BS con el apoyo de la Universidad de Milán-Bicocca Programa de Formación de Investigadores Student Summer; investigación fue financiada con fondos del Ministerio de Salud y el Ministerio italiano de Educación, Universidad e Investigación y la Fundación Humanitas de GC italiano; Agradecemos a Michael VG Latronico para la lectura crítica del manuscrito.

1. Mantenimiento del alimentador-libre y Propagación de líneas de células humanas iPS <ol><li> Preparar los platos revestidos con Matrigel. Descongelar un vial de matriz ESC-cualificado humana en hielo durante una hora y se diluye en 25 medio DMEM-F12 ml. Añadir 1 ml a cada placa de 35 mm (o cantidades equivalentes por unidad de superficie si se utilizan otros platos), manteniendo todo en hielo y asegurar que todas las placas y los tubos son pre-enfriado. Cubrir las placas con papel de aluminio. </li></ol> Nota: las concentraciones de valores Matrigel variar según el lote. Instrucciones de dilución se indican en la hoja de datos. <ol start="2"><li> Mantener las placas en hielo durante la noche y eliminar de hielo al día siguiente. Las placas se pueden mantener en la nevera durante hasta una semana antes de usar. </li><li> Preparar el medio completo mTESR1 (o descongelar un vial de medio Nutristem) y la H-ESM (medio de ESC humana) de acuerdo con la tabla de abajo. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> H-ESM </td><td> CONC FINAL </td><td> PARA 500 ​​ml </td></tr><tr><td> Knockout sustitución Serum (KSR) </td><td> 20% </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> GlutaMAX 100X </td><td> 2 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> MEM aminoácidos no esenciales </td><td> 0,1 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> La penicilina-estreptomicina </td><td> 100 U / ml - 0,1 mg / ml </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> 0,1 mM </td><td> 900 l </td></tr><tr><td> B27 Suplemento - sin Vitamina </td><td> 1% </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Suplemento N2 </td><td> 1% </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Knockout DMEM </td><td> - </td><td> 370 ml </td></tr></tbody></table> Medio de archivo se puede almacenar a 4 ° C durante no más de 2 semanas. Para preparar el medio de crecimiento, se agrega FGF básico sólo beforla alimentación de correo a una concentración final de 20 ng / ml. </li></ol> Nota: H-ESM completa condicionada a fibroblastos embrionarios de ratón se puede usar en lugar de mTESR1 o Nutristem de células iPS. <ol start="4"><li> Colocar las placas recubiertas en un incubador a 37 ° C durante 30 min a 2 horas antes de pases. </li><li> Las células deben ser pasados ​​aproximadamente cada 5 días, incluso si no han llegado a la confluencia. Las colonias no deben tocarse. </li><li> Reemplazar medio de crecimiento con 1 ml de dispasa (1 mg / ml, se disuelven a partir de un mg / ml de caldo de 10 en PBS). </li><li> Retire diferenciar áreas con tirados pipetas Pasteur de vidrio. Las áreas que deben ser eliminados incluyen estructuras como cráteres o quístico en el centro de las colonias, y cualquier área donde las células se han separado de las colonias y aplanados y parecen estar migrando hacia el exterior. </li><li> Incubar a 37 ° C bajo una campana de cultivo hasta que las fronteras de colonias se vuelven más brillantes y comienzan a separar (por lo general alrededor de 5-7 minutos). Discard dispasa. Lavar con 1 ml de H-ESM y desechar. </li><li> En 1 ml H-ESM, use un elevador celular (espátula espátula) para colonias cosecha y recoger en un tubo de 15 ml Eppendorf. Enjuague con 1 ml H-ESM y añadir al tubo. Gira a 1.000 rcf durante 4 min y retirar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el precipitado en 1 ml de medio de crecimiento pre-calentado (ya sea mTESR1 o Nutristem). Evite romper los grumos demasiado - pipetear arriba y hacia abajo a menos de 6-8x. Determinar el número de células debe ser presentado y eliminar las células innecesarias (por lo general dilución 1:4 ó 1:5), por ejemplo para 2 placas a 01:05, eliminar 600 l, a continuación, añadir 1,6 ml de medio fresco. </li><li> Retire Matrigel a partir de placas. Las células de ubicación gota a gota, distribuir de manera uniforme sobre la placa. Evite agitar el tubo en exceso, ya que esto hará que las células se muevan hacia el centro. </li><li> Lave tubo con 1 ml de medio y se dividen entre las placas. El volumen final en cada placa debe ser de 1,5 ml de -2. </li><li> Cambio de medio cada día, excepto para el día después de pases. A pesar de que esideal para cambiar el medio todos los días, este puede ser cambiado de vez en cuando a una frecuencia de una vez cada dos días si han pasado más de 2-3 días desde el último paso sin afectar potencial de pluripotencia o diferenciación. </li><li> Si la línea celular debe ser congelado, volver a suspender en lugar de 1-2 ml de medio de congelación mFreSR utilizando una pipeta y colocar 2 1 ml / criovial. Viales lugar en una Caja criogénica a -80 ° C y la transferencia de nitrógeno líquido en 3-4 días. </li></ol> Nota: Manual microdisección de células iPS debe realizarse bajo un microscopio estereoscópico. Un (FIV) estación de trabajo en la fertilización in vitro (por ejemplo, una estación de trabajo de FIV Ksystem) integrado con un estereomicroscopio permite la manipulación de las células en condiciones estériles, mientras que se mantienen en un área de superficie calentada. Si esto no está disponible, un microscopio estereoscópico se puede mover bajo una campana de flujo laminar regular. 2. Cuerpos embrioides Agregación y Cardiac Induction <ol><li> Prepara-20 EBM medio de acuerdo con la siguiente tabla. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> EBM-20 </td><td> CONC FINAL </td><td> PARA 500 ​​ml </td></tr><tr><td> Suero Bovino Fetal (origen América del Sur) </td><td> 20% </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> Aminoácidos no esenciales MEM </td><td> 0,1 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> La penicilina - estreptomicina </td><td> 100 U - 0,1 mg / ml </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> GlutaMAX 100X </td><td> 0,1 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> 50um </td><td> 450 l </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> - </td><td> 385 ml </td></tr></tbody></table> Uso de FBS de origen América del Sur es crítico para la determinación de la eficiencia de diferenciación: el empleo de otros tipos de sueros puede afectarel proceso de diferenciación. Para preparar un EBM-20, ácido ascórbico complemento completo (AA) a una concentración final de 50 g / ml. Medio de crecimiento completo se puede almacenar a 4 ° C durante no más de una semana. </li><li> Cosecha iPS colonias como se describe anteriormente (pasos 1.6 a 1.9). </li><li> Resuspender suavemente en 1 ml EBM-20 con una pipeta de 2. Evite romper los grumos demasiado - pipetear arriba y abajo no más de 2 a 3 veces, comprobando el tamaño de las colonias bajo el microscopio estereoscópico. Placa en placas de fijación ultra-bajas en proporción de 1:1 (por ejemplo, un plato de 35 mm, utilice 1 pocillo de una placa de 6 pocillos). Enjuague tubo con 1 ml EBM-20 y añadir al plato. </li></ol> Nota: El tamaño de las colonias afecta el proceso de diferenciación, el control de la eficiencia y el momento de la inducción cardiaca. La agregación de EBs homogénea de tamaño se ha demostrado para reducir la variabilidad observada durante la diferenciación. <ol start="4"><li> El día 3, cambie EBM-20 una vez que el uso de un microscopio para evitar volver aremoción de EBS. Mantenga la pipeta cerca del borde de la placa, y retire medio. </li><li> En el día 7, el interruptor de EBs a placas recubiertas con 0,1% de gelatina y se coloca previamente a 37 ° C durante 30 min. Si es necesario, la gelatina se puede quitar y placas se dejaron bajo una campana de cultivo de células S / N. Añadir 35-40 CE por placa de 35 mm. </li><li> Compruebe EBS por golpear a las zonas y el cambio EBM-20 dos veces por semana. Marque donde se encuentran las zonas batiendo en la parte superior de la cubierta de plato, para facilitar que la localización bajo el microscopio estereoscópico. Áreas contratantes deben aparecer después de unos 10 a 20 días. </li><li> Cuando las áreas con contracción espontánea aparecen, cambian a medio y EBM-2 (preparar como EBM-20, con un 2% de SFB en su lugar) y aíslan como se describe a continuación en la sección 3. </li><li> Continúe revisando otros ámbitos por golpear y cambiar medio dos veces por semana hasta que se necesitan áreas batiendo para experimentos adicionales. </li></ol> Nota: la eficiencia del proceso de diferenciación es altamente dependientevarios factores, el más importante de los cuales son las líneas celulares específicas y el lote de suero utilizadas para inducir la diferenciación cardiaca. Para obtener el máximo rendimiento, las líneas celulares de prueba para posibles cardiomiogénico y varios lotes de suero. 3. Vencer a las áreas de aislamiento y Cultura <ol><li> Recubrir las placas de 12 pocillos (4 cm 2) o las placas de interés, con 5 mg / cm 2 fibronectina, diluido en PBS para hacer un volumen suficiente para cubrir toda la superficie por completo (300 l total por pocillo en placas de 12 pocillos). Mantenga descubierto en campana de cultivo de células y dejar secar. Las placas pueden ser envueltos y se almacenaron a 4 ° CO / N. </li><li> Retire área usando un vaso superando sacó pipeta Pasteur y el bisturí, según sea necesario. Transferencia a placas recubiertas con fibronectina con una pipeta de 1 ml. </li><li> Añadir 1 ml EBM-2. </li><li> Tacha la placa para indicar las áreas en las que se eliminaron las células y cambiar el medio. Las placas se pueden mantener durante un máximo de 1 mes, ya que otras áreas pueden empezar a bcomer más tarde. </li></ol> Nota: Si se necesitan grupos pequeños golpeando, pipetear el área explantada arriba y abajo varias veces bajo el microscopio estereoscópico, hasta que se rompe en pedazos más pequeños. Esto dará lugar a racimos de unas pocas células latiendo (ver la película 3). <ol start="5"><li> Cambio de medio dos veces a la semana hasta que esté listo para el análisis. </li></ol> Nota: Los cardiomiocitos obtenidos a partir de este protocolo poseen características morfológicas y funcionales del feto-como; maduración hacia un fenotipo adulto-como se puede obtener mediante el aumento del tiempo en cultivo para diferenciar aún más estas células. 4. Soltero Vencer celdas de aislamiento y análisis <ol><li> Escudo diapositivas 2-cámara (4 cm Área 2) u otros soportes adecuados con 5 g / cm 2 fibronectina diluido en PBS suficiente para cubrir toda la superficie de cultivo. Si se utiliza un soporte de vidrio, la capa con la laminina y la fibronectina (5 g / cm &lt;sup&gt; 2 cada uno). </li><li> Retire área batiendo con una pipeta Pasteur / bisturí de las placas de la sección 3. </li><li> Usando una pipeta de 1 ml, las células de transferencia a un tubo de 15 ml que contiene 500 l de colagenasa II (480 U / ml en PBS con Mg y Ca) y se incuba 15 min a 37 ° C, agitando el tubo una vez durante la incubación. </li><li> Pipetear hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 200. Si cualquier grupo permanecen, traslado al fresco colagenasa II y repita el paso 4.3. </li><li> Repita el paso 4.4 hasta que no haya grumos grandes se quedan. </li><li> Desactivar la colagenasa con 3 ml EBM-2 (sin AA). El tubo se puede dejar bajo el capó de un estante calentado hasta que otros tubos están listos. Centrifugar a 1000 rcf durante 4 min. </li><li> Resuspender el precipitado en 1 ml de 0,25% de tripsina / EDTA (diluido a partir de un stock de 0,5% en 1X PBS) y se incuba a 37 ° C durante 5 min. Se combinan las fracciones de digestión de la misma muestra inicial. </li><li> Inactivar la tripsina con 4 ml EBM-2 (sin AA). Pasar las células a través de una aguja 18G en una jeringa de 2,5 ml no más than de 7x. Centrifugar a 1000 rcf durante 4 min. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 1 ml EBM-2 por pocillo y la placa. Las células se pueden utilizar para los análisis funcionales y morfológicas 2-3 días después de la siembra. </li></ol>

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<li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+enhances+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes.</a> Circulation. 107, 1912-1916 (2003).</li>
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</ol>

No hay interés económico alguno.

Las células madre pluripotentes tienen el potencial de diferenciarse espontáneamente en los CM, aunque con baja eficiencia y alta variabilidad entre líneas. Por consiguiente, el desarrollo de métodos de inducción novedosos se ha centrado en la mejora de la eficiencia del proceso y avanzar hacia protocolos más definidos. Sin embargo, la mayoría de estos nuevos métodos de diferenciación son bastante complejos, que requieren condiciones elaboradas cultura, control preciso del tiempo y la concentración de los reactivos, y e...

Históricamente, la investigación de los mecanismos genéticos y moleculares de conducción desarrollo humano y la enfermedad se ha basado en la generación de modelos animales genéticamente modificados. Sin embargo, numerosos fenotipos humanos no pueden ser replicados con éxito en ratones, principalmente a causa de las diferencias biológicas existentes entre las dos especies. Por otra parte, el acceso a los tejidos humanos puede ser limitada y con frecuencia no permita que el material suficiente para obtener por estudios experimentales en profundidad. El campo de la biología cardiovascular sufre de estas dos limitaciones: la fisiología del corazón humano es significativamente diferente de la del ratón, y una cantidad significativa de tejido del corazón es accesible solamente post mortem o durante una cirugía de corazón. Encontrar una fuente óptima para la diferenciación funcional de los CM humana por lo tanto se ha convertido en un tema central en la biología cardiovascular, y se ha hecho un gran esfuerzo para hacer frente a este problema. Se han propuesto diversos tipos de células, itales como grapas de mioblastos esqueléticos, células locales cardíacos madre, células mononucleares de médula ósea, progenitoras endoteliales, y células madre mesenquimales. Sin embargo, los datos obtenidos usando estas células no han sido consistentes 4. La obtención de células madre embrionarias (ESC) primero 5 y el descubrimiento revolucionario de la madre (iPS) a las células pluripotentes inducidas por Yamanaka y Thomson 6,7 después parecía ofrecer soluciones: estas células tienen la capacidad de crecer indefinidamente y el potencial de dar la altura de todos los derivados de células de las tres capas germinales, incluyendo los CM. El uso de células iPS ofrece otras ventajas: ser derivados a partir de células adultas autólogas, que llevan el mismo genoma que el individuo o paciente de la que se derivan. Por lo tanto, permiten el desarrollo de modelos in vitro que facilitan la investigación de enfermedades genéticas humanas y los mecanismos de desarrollo. En virtud de esta característica, las células iPS pueden øvercome problemas relacionados con el rechazo inmunológico y las cuestiones éticas 8. Por estas razones, a pesar de que los CES aún representan el estándar de oro en el campo de la biología de células madre, los investigadores en todo el mundo se está moviendo más hacia la tecnología de células iPS. células iPS ahora se están empleando para modelar enfermedades humanas in vitro para varias condiciones, incluyendo trastornos cardiovasculares congénitos 9,10. Recientemente, la aplicación de modelado de la enfermedad de células iPS se ha realizado durante monogénicas trastornos cardíacos (por ejemplo, síndromes de QT largo, taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica) y patologías en las que los defectos cardíacos son parte de un complejo fenotipo (es decir, Leopard y síndromes Timothy, cardiomiopatía dilatada). Estos informes confirman que las células iPS de pacientes específicos que se diferencian en los CM presentan características fenotípicas y funcionales similares a la enfermedad in vivo. Sin embargo, hayquedan muchos retos para mejorar la eficacia de la inducción de las células iPS en el linaje cardiaco. La generación espontánea de los CM de CME humanas a través de la formación de agregados llamados cuerpos embrioides (EB) han probado con éxito 17. Desde este descubrimiento, se han propuesto muchos otros métodos. Muchos grupos han mejorado considerablemente la eficiencia del protocolo de diferenciación y se han movido hacia los reactivos de cultivo químicamente definidos y de productos animales libres (ver Mummery, C., et al., Circulation Research (2012) para una revisión exhaustiva de todos los métodos existentes 3 ). Sin embargo, el método clásico basado en EB agregación todavía representa el más comúnmente empleado para la realización de estudios funcionales y la investigación de mecanismos de la enfermedad. Nuestro protocolo propuesto se basa en la agregación de las células iPS en EBs y cultivo en presencia de suero y ácido ascórbico, que se ha demostrado para mejorar el proceso de diferenciación cardiaca y para positively afectar a la maduración de estas células 18,19. En este artículo vamos a ir a través de esta metodología en detalle y mostraremos cómo utilizar iPS alimentador libres de líneas celulares para la generación específica del paciente CM iPS derivadas.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Media and Reagents</td></tr><tr><td>Human Qualified ESC Matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>Descongele el frasco de 5 ml a 4 & grados; C en hielo O/N, alícuota en criotubos preenfriados sobre hielo, de acuerdo con las instrucciones de dilución de la hoja de datos y almacenar a -20 & grados; C .</td></tr><tr><td>Fibronectina, a partir de plasma humano, solución al 0,1%</td><td>Sigma</td><td>F0896-2MG Concentración de</td><td>trabajo: 5 &mu; g/cm2</td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma</td><td>L2020-1MG Concentración de</td><td>trabajo: 5 &mu; g/cm2</td></tr><tr><td>PBS (sin Mg y Ca), 10X</td><td>Lonza</td><td>BE17-515F</td><td></td></tr><tr><td>PBS (con Mg y Ca), 10X</td><td>Bio Sera</td><td>XC-S2067/500</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa II, proteasa neutra, grado II</td><td>Roche</td><td></td><td>4942078001 Stock: 10 mg/ml en DMEM-F12 a -20 & grados; C, solución de trabajo: 1 mg/ml en PBS (sin Mg/Ca)</td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA, 0,5%</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa tipo 2</td><td>Worthington</td><td>4176</td><td>Diluido a 480 U/ml (p. ej. 1,6 mg/ml) en PBS con Mg y Ca</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Life Technologies</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>Suero Knockout Reemplazo (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>Descongelar a 4 & grados; C, alícuota y almacenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>F&#8211; Tal Suero bovino (origen América del Sur)</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td>Los lotes deben ser probados para determinar su potencial cardiogénico. Descongele a las 4 & grados; C, inactivación por calor a 56 °C; C durante 30 min, alícuota y almacenar a -20 °; C</td></tr><tr><td>PenStrep, penicilina-estreptomicina, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA, 100X</td><td>Invitrogen</td><td>11140-135</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento N2, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B27, 50X</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>2-mercapt&#8211; etanol</td><td>Invitrogen</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina, de piel porcina</td><td>Sigma</td><td>G1890-100G</td><td>Hacer caldo al 1% en agua, almacenar a -20 &deg;C. Diluir al 0,1% en PBS y mantener a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td>Combine el suplemento 5X con el medio básico, alícuota y almacene a -20 &deg;C. No mantenga el medio completo a 4 ° C por más de 1 semana</td></tr><tr><td>Nutristem hESC XF</td><td>Stemgent de Biological Industries</td><td>05-100-1A</td><td>Descongelar a 4 & grados; C O/N, alícuota y almacenar a -20 &deg; C hasta su uso. Las alícuotas pueden mantenerse en 4 &deg; C por no más de una semana.</td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5853</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma</td><td>A4544-25G</td><td>Prepare las existencias a 10 mg/ml en agua. Almacene las alícuotas a -20 &deg; C en la oscuridad. Añadir a la MBE en la concentración final (500X)</td></tr><tr><td colspan="4">Plasticware</td></tr><tr><td>35 mm Placas de cultivo</td><td>Becton Dickinson</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Cell</td><td>Corning Incorporated</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 12 pocillos</td><td>Becton Dickinson</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Permanox Portaobjetos de cámara Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio con cámara de 2 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>177380</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 pocillos, superficie de fijación ultrabaja</td><td>Corning Incorporated</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Aguja 18G</td><td>Becton Dickinson</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de vidrio para pasteur, 230 mm</td><td>VWR International</td><td>612-1702</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 2,5 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>300188</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipments</td></tr><tr><td>IVF Workstation</td><td>KSystem, de Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon SMZ1500 Microscopio estereoscópico</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la generación de cardiomiocitos humanos: protocolo de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas feeder libres

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Con el fin de investigar los hechos de conducir el desarrollo del corazón y determinar los mecanismos moleculares que conducen a enfermedades del miocardio en los seres humanos, es fundamental primero para generar cardiomiocitos humanos funcionales (CM). El uso de estas células en el descubrimiento de fármacos y estudios de toxicología también sería altamente beneficioso, permitiendo que las nuevas moléculas farmacológicas para el tratamiento de trastornos cardíacos que ser validado pre-clínicamente en las células de origen humano. De las posibles fuentes de CM, las células madre pluripotentes inducidas (iPS) se encuentran entre los más prometedores, ya que se pueden derivar directamente de tejido del paciente fácilmente accesibles y poseen una capacidad intrínseca para dar lugar a todos los tipos de células del cuerpo 1. Se han propuesto varios métodos para la diferenciación de las células iPS en los CM, que van desde los clásicos cuerpos embrioides (EB) enfoque de agregación de química definida protocolos de 2,3. En este artículo se propone un protocolo basado en EBS y mostrar cómo esta metod se puede emplear para generar de manera eficiente las células CM-como funcionales a partir de células iPS alimentador-libres.

En nuestros estudios hemos generado los CM de varias líneas de células iPS. Estas líneas se generaron inicialmente en una capa de alimentación MEF pero se colocaron inmediatamente en Matrigel usando un medio definido (ya sea mTESR1 o Nutristem). Varios ensayos se utilizaron para verificar el mantenimiento de las propiedades morfológicas, la expresión de marcadores típicos de células pluripotentes (OCT-4, SSEA4 y TRA1-60) y su estabilidad genoma (Figura 1). La inducción en el...

Las células madre pluripotentes, cualquiera de las células madre pluripotentes embrionarias o inducidas (iPS), constituyen una valiosa fuente de células diferenciadas humanas, incluyendo cardiomiocitos. Aquí, nos centraremos en la inducción cardiaca de las células iPS, que muestra cómo usarlos para obtener cardiomiocitos humanos funcionales a través de un protocolo de los organismos con sede en embrioide.

La generación de cardiomiocitos humanos: Protocolo de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas Feeder libres

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

El objetivo general de este procedimiento es diferenciar cardiomiocitos humanos a partir de células IPS humanas cultivadas en condiciones libres de alimentador. Esto se logra primero sembrando las células IPS en placas de adherencia ultrabaja para formar cuerpos embrionarios. El segundo paso del procedimiento consiste en transferir los cuerpos embrionarios formados a placas recubiertas con gelatina.Cuando aparecen áreas contráctiles, se disecan manualmente bajo el microscopio estereoscópico y se siembran en placas recubiertas con fibronectina. Para una mayor diferenciación, el paso final consiste en obtener cardiomiocitos individuales mediante digestión enzimática de los grupos contráctiles. En última instancia, los resultados pueden mostrar la diferenciación de células similares a cardiomiocitos que expresan marcadores estructurales típicos, es decir, troponina cardíaca mediante microscopía de inmunofluorescencia.Este método puede ayudar a responder una pregunta clave en el campo de la biología cardiovascular, como, cuáles son los mecanismos que impulsan la diferenciación y disfunción cardíacas durante el desarrollo cardiaco y las enfermedades a nivel del cardiomiocito humano. Esta es una técnica muy interesante porque permite la generación de cardiomiocitos in vitro a partir de pacientes humanos e individuos humanos. Y en segundo lugar, permite la recapitulación de la enfermedad en el tubo de ensayo, de modo que se puedan experimentar nuevos fármacos in vitro antes de pasar a estudios in vivo.Comience la experimentación con cultivos de células IPS confluentes crecidos en placas de 35 milímetros recubiertas con matrigel. Reemplace el medio de crecimiento con un mililitro de PBS que contenga un miligramo de diss. Examine las células utilizando pipetas de vidrio pulidas.Elimine las regiones con células diferenciadas, como estructuras con forma de cráter o quísticas en el centro de las colonias. También elimine cualquier área donde las células se hayan separado, aplanado y parezcan estar migrando hacia afuera. A continuación, incube las células restantes a 37 grados Celsius bajo una campana de cultivo hasta que los bordes de las colonias se vuelvan más brillantes y comiencen a desprenderse.Esto generalmente toma entre cinco y siete minutos. En este punto, retire la solución dispa y lave las células con un mililitro de HESM. Luego deseche la solución de lavado.En un mililitro fresco de HESM, utilice un lifter celular para recolectar las colonias. Recopile las colonias en un tubo de 15 mililitros. A continuación, enjuague las células con otro mililitro de HESM y centrifúguelas a 1000 ×g durante cuatro minutos.Luego, continúe con la siembra de las células en matrigel y cambie el medio diariamente durante el cultivo. Comience por recolectar colonias IPS indiferenciadas según se describió en la sección anterior. Una vez que se hayan aislado las poblaciones indiferenciadas, suspenda suavemente estas en un mililitro de EBM 20.Utilizando una pipeta de dos mililitros, no desagregue demasiado los agregados celulares. Limite la pipetación a dos o tres movimientos. Verifique el tamaño de las colonias bajo el estereoscopio entre cada movimiento.Cuando las colonias tengan todas aproximadamente el mismo tamaño, no necesitan mezclarse más. Ahora siembre las células en placas de adherencia ultrabaja, utilizando una placa de seis pocillos por cada placa de células recolectadas. No olvide enjuagar el tubo con un mililitro de EBM 20 y distribuir el enjuague en la placa.Después del tercer día de incubación, cambie el medio utilizando un microscopio para evitar la eliminación de los cuerpos embrionarios. Mantenga la pipeta cerca del borde de la placa. En el séptimo día, transfiera los cuerpos embrionarios a placas recubiertas con gelatina al 0,1 % calentadas a 37 grados Celsius durante 30 minutos.Añada de 35 a 40 cuerpos embrionarios a cada placa de 35 milímetros en dos mililitros de medio. Durante el cultivo, cambie el medio regularmente dos veces por semana.Revise los cuerpos embrionarios en busca de áreas con latidos y marque la ubicación de dichas áreas. En la parte superior de la tapa del recipiente, las áreas con contracciones deben aparecer aproximadamente entre los 10 y 20 días. Cuando aparezcan áreas con contracción espontánea, cambie su medio a EBM dos. Después de que aparezcan las áreas contráctiles, continúe el cultivo y la monitorización de otras áreas en la placa durante un mes como máximo.En total. En EBM, la deficiencia del proceso de diferenciación depende en gran medida de varios factores, siendo los más críticos las líneas celulares específicas y el lote de suero utilizado para inducir la diferenciación cardíaca. Para obtener la máxima eficiencia, pruebe varias líneas para su potencial cardiogénico y diversos lotes de suero. Comience recubriendo 12.Las placas con cinco microgramos por centímetro cuadrado de fibronectina en PBS, 300 microlitros por pocillo, deben cubrir completamente la superficie de cada pocillo. Deje que las placas sequen destapadas en una cabina de cultivo celular. Para eliminar el área de formación de gotas del cultivo celular, utilice una pipeta de vidrio estirada y un escalpelo.Luego, utilizando una pipeta de un mililitro, transfiera de cuatro a cinco pinzas a cada pocillo de una placa recubierta con fibronectina. Una vez que se hayan realizado todas las recolecciones, agregue un mililitro de EBM dos a los pocillos cargados en la placa de recolección y marque las áreas de las que se eliminaron células. A continuación, cambie el medio y regrese la placa al flujo laminar.Si se requieren agregados más pequeños que laten bajo un microscopio estereoscópico, pase las áreas explantadas a través de una pipeta. Esto produce pequeños grupos que contienen algunas células latentes. En cultivo.Cambie el medio dos veces por semana hasta que estén listos para el análisis. Primero, prepare portaobjetos cuadrados de cuatro centímetros con dos cámaras recubriéndolos con 20 microgramos de fibronectina diluidos en suficiente PBS para cubrir la superficie. Si se utiliza un soporte de vidrio, agregue 20 microgramos adicionales de laminina.Aísle el área de cultivo con perlas como se describió anteriormente. Utilizando una pipeta de un mililitro, transfiera las células a un tubo de 15 mililitros que contenga 500 microlitros de tubo de colagenasa. Incube las células durante 15 minutos y agite el tubo una vez durante la incubación.Después de 15 minutos, pase las células a través de una pipeta de 200 microlitros para eliminar los agregados si aún quedan. Transfiera las células a colagenasa dos fresca y repita la incubación cuando no queden agregados grandes. Finalice la digestión añadiendo tres mililitros de EBM dos sin ácido ascórbico según se preparan cada uno.Guarde los tubos en una placa calefactada bajo la campana extractora y luego centrifúgelos a 1000 veces G durante cuatro minutos a temperatura ambiente. Una vez centrifugados, prepare una suspensión de las fracciones celulares del mismo muestra inicial en un mililitro de tripsina-EDTA al 0,25 % en PBS. A continuación, incube la suspensión durante cinco minutos en el bloque calefactor e inactívela la tripsina con cuatro mililitros de EB M2 sin ácido ascórbico.A continuación, pase las células a través de una aguja de calibre 18 en una jeringa de 2,5 mililitros hasta siete veces, hasta que no se observen grandes agregados al microscopio. Luego, centrifugue las células a 1000 veces G durante cuatro minutos. Ahora, resuspenda el sedimento celular en E BM dos e incube en portaobjetos con dos cámaras.Las células estarán listas para los análisis tras dos o tres días de incubación. Los CMS se generaron a partir de varias líneas de células IPS. Estas líneas se generaron inicialmente en una capa alimentadora de metilo e inmediatamente se colocaron en matrigel utilizando un medio definido.Las células mostraron una morfología similar a la de las CSE humanas, con bordes brillantes en contraste de fase y núcleos prominentes. El análisis de inmunofluorescencia mostró que las células IPS expresaron correctamente el factor de transcripción T four y expresaron el antígeno de superficie TRA one 60. El análisis citofluorométrico confirmó la expresión de antígenos de superficie típicos de pluripotencia, SS EEA four y TRA one 60.La estrategia de selección se muestra en el gráfico de dispersión izquierdo. También se realizó un análisis de cariotipo de las células FS IP cultivadas en gel de matriz. La inducción hacia la línea cardíaca se desencadenó mediante la agregación de las células IPS en cuerpos embrioides, junto con el cultivo en presencia de un tipo específico de suero.Y dado que las áreas con contracción por ácido sórbico representaban entre el 20 y el 35 % de la cultura total, dependiendo de la línea celular utilizada. Los CMS contráctiles se aislaron de estas regiones mediante digestión enzimática y se analizó su expresión proteica. La R-T-P-C-R detectó expresión de canales iónicos específicos cardíacos en las células latientes derivadas de IPS, pero no en las células no latientes.Estos canales incluyeron una alfa uno, una subunidad de un canal de calcio dependiente del voltaje, una subunidad alfa de un canal de sodio sensible al voltaje de tipo cinco, un canal de potasio sensible al voltaje de la subfamilia tipo KQT y ambas formas de miosina. El análisis de inmunofluorescencia de la cadena pesada reveló que los cardiomiocitos individuales derivados de IPS expresaban las proteínas estructurales, actina alfa sarcomérica, troponina I cardíaca y la conexión específica cardíaca, conexina 43. Después de todo, esta técnica allanó verdaderamente el camino para la modelización de enfermedades miocárdicas in vitro y permite la experimentación con fármacos en un entorno humano sin necesidad de inyectar los fármacos en los cuerpos humanos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo mantener células IPS en condiciones libres de suero y diferenciarlas en cardiomiocitos mediante un método basado en la agregación de cuerpos embrioides.

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Investigación

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Biology

Biología

Hemos establecido un protocolo para la inducción de cardioblastos directa de pluripotentes células madre embrionarias humanas mantenidas en condiciones definidas con pequeñas moléculas, lo que permite la derivación de una gran cantidad de células progenitoras cardiacas humanas y funcionales cardiovasculares cardiomiocitos para su reparación.

Derivación eficiente de los Derechos Humanos precursores cardiacos y cardiomiocitos de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

El artículo describe la metodología detallada para diferenciar eficazmente células madre pluripotentes humanas en cardiomiocitos mediante la modulación de la vía Wnt selectivamente, seguido por citometría de flujo análisis de marcadores de referencia para evaluar la homogeneidad e identidad de la población.

Alta Eficiencia Diferenciación de células madre pluripotentes humanas a cardiomiocitos y Caracterización por citometría de flujo

Aquí, describimos un protocolo robusto para la derivación de cardiomiocitos humanos que combina la diferenciación cardíaca modulada por moléculas pequeñas y la purificación de cardiomiocitos mediada por privación de glucosa, lo que permite la producción de cardiomiocitos purificados para fines de modelado de enfermedades cardiovasculares y detección de fármacos.

Derivación de cardiomiocitos altamente purificada de células madre humanas pluripotentes inducidas Uso Pequeño Diferenciación molécula modulada y posterior glucosa inanición

La generación de cardiomiocitos a partir de células madre pluripotentes in vitro permite el acceso a grandes cantidades de tejido cardíaco in vitro para aplicaciones clínicas y de ciencia básica.  Este protocolo utiliza el factor atrializante Grem2 tanto para aumentar el número de cardiomiocitos obtenidos como para generar cardiomiocitos con un fenotipo auricular.

La diferenciación de los cardiomiocitos auricular partir de células madre pluripotentes Uso del antagonista de BMP Grem2

Aquí, presentamos un protocolo de diferenciación de cardiomiocitos robusto, rápido y escalable para células madre pluripotentes humanas (hPSCs). Los cardiomiocitos obtenidos mediante este método a gran escala pueden proporcionar un número de células suficiente para su uso eficaz en el modelado de enfermedades cardiovasculares humanas, el cribado de fármacos de alto rendimiento y las posibles aplicaciones clínicas.

La producción a gran escala de los cardiomiocitos de células madre pluripotentes utilizando un pequeño protocolo de diferenciación basada en la molécula altamente reproducible

Presentamos tres protocolos nuevos y más eficientes para la diferenciación de células madre pluripotentes inducidos por el hombre en cardiomiocitos, células endoteliales, y células del músculo liso y un método de entrega que permite mejorar el injerto de las células transplantadas mediante la combinación de la inyección de células con la entrega de citoquinas parche mediada.

Pluripotentes células madre derivadas de células cardiacas para la reparación del miocardio

La caracterización electrofisiológica de los cardiomiocitos derivados de las células madre pluripotentes humanas (hPSC-CMs) es crucial para el modelado de la enfermedad cardiaca y para la determinación de las respuestas de los fármacos. Este protocolo proporciona la información necesaria para disociar y planificar hPSC-CM en arrays de múltiples electrodos, medir su potencial de campo, y un método para analizar intervalos QT y RR.

Análisis Electrofisiológico de Cardiomiocitos Pluripotentes Humanos Pluripotentes (hPSC-CMs) Usando Matrices Multi-Electrodo (MEAs)

Aquí, presentamos un método para aprovechar eficientemente el potencial de diferenciación cardiaca de jóvenes fuentes de células madre mesenquimales humanas con el fin de generar las células funcionales, contratantes, cardiomiocitos-como en vitro.

In Vitro Diferenciación de células madre mesenquimales humanas en células funcionales en cardiomiocitos

Aquí describimos un método escalable, con una simple combinación de activina A y mediada por el lentivirus Id1-sobreexpresión, para generar progenitores cardiacos primera de corazón como campo y ventricular como cardiomiocitos desde células madre humanas pluripotentes.

Generación del primer corazón campo-como progenitores cardiaca y Ventricular como cardiomiocitos desde células madre humanas pluripotentes

Este artículo contiene un conjunto de protocolos para el desarrollo de redes de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPSC-CM) cultivadas en placas MEA multipocillos para electroportar la membrana celular de forma reversible para mediciones potenciales de acción. Las grabaciones de alto rendimiento se obtienen de los mismos sitios de celda repetidamente durante días.

Redes de cardiomiocitos derivados de iPSC humanos en matrices de microelectrodos multipolos para grabaciones potenciales de acción recurrente

Aquí, presentamos un protocolo para generar y expandir de manera robusta los cardiomiocitos humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica del paciente.

Generación y expansión de cardiomiocitos humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica de pacientes

Aprende a diferenciar cardiomiocitos humanos a partir de células madre pluripotentes inducidas libres de alimentador mediante un protocolo basado en cuerpos embrionarios. Este método permite obtener células cardíacas funcionales para investigación cardiovascular.

La generación de cardiomiocitos humanos: Protocolo de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas Feeder libres (Video) | JoVE Journal

La generación de cardiomiocitos humanos: Protocolo de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas Feeder libres

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