Name: Los ensayos acoplados para Monitoreo replegamiento de proteínas en Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 52 s
Description: Aprende a monitorear el replegamiento de proteínas in vivo en Saccharomyces cerevisiae mediante microscopía de fluorescencia y ensayos enzimáticos. Este método permite cuantificar la eficiencia de reactivación de enzimas desplegadas en tiempo real.

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Este trabajo fue apoyado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud (NIGMS-074696) a KAM y la Sociedad Americana de Microbiología Robert D. Watkins de Becas de Postgrado Investigación Estudiantil de JLA También agradecemos a John Glover en la Universidad de Toronto para la prestación del FLE -GFP fuente de plásmido.

1. Construcción de las cepas que contienen FFL-GFP plásmido Para este estudio, Saccharomyces cerevisiae cepa BY4741 (MAT una, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) se utiliza junto con una supresión cepa HSP104 de la colección nocaut levadura (Open Biosystems / Thermo Scientific). La deleción se confirmó utilizando un anticuerpo Hsp104-específico para el análisis de Western blot. FFL-GFP se expresa a partir de p426MET25-FFL-GFP, construido a partir de una fuente LEU2 plásmido basado obtenido por el laboratorio Glover en la Universidad de Toronto 17 y obtenible a petición de los autores. Expresión de la proteína de fusión plásmido FFL-GFP es controlado por el promotor MET25 metionina-reprimible. El plásmido se transformó en cada cepa usando un protocolo fue adaptado de Gietz et. al, 1995: <ol><li> Centrifugar 25 ml o<html> f células en fase de registro en un tubo cónico de 50 ml a 4.400 rpm durante 2 min, se lavan con 500 l de doble destilada H 2 0 (ddH 2 O), y descartar sobrenadante. </li><li> Resuspender las células en 250 l de TE / LiAc (Tris-HCl 10 mM, pH = 7,5, EDTA 1 mM, acetato de litio 0,1 M). Incubar a 30 ° C sin mezclar durante 20 min. </li><li> Transferir 50 l de células competentes a un nuevo tubo junto con 5 ml (50 g) de ADN portador y 5 l (0,1-5 g) de ADN plásmido. Añadir 300 l de PEG / TE / LiAc (igual que el% de polietilenglicol TE / LiAc más 40) a esta mezcla, y las células se incuban a 30 ° C durante otros 30 min. </li><li> Añadir 1/10 volumen (v / v) de DMSO (36 l) a esta mezcla y choque térmico a 42 ° C durante 6 min. </li><li> Se centrifuga la mezcla a 6.000 rpm durante 30 segundos y quitar sobrenadante. Resuspender las células en 100 l de ddH 2 0 y células de la placa estériles en medios completos sintéticos que carecen de uracilo (SC-URA). </li></ol> 2. La inducción de la FFL-GFP nt &quot;&gt; FFL-GFP es inducida una vez que las células están en la fase de registro por lo que la mayoría de la proteína antes de choque térmico se hace para evitar recién proteínas que se han agregado terminalmente con el tiempo debido a las insuficiencias celulares relacionadas con el envejecimiento. <ol><li> Día 1: Se incuban las células en 5 ml de SC-ura a 30 ° C giratoria O / N. </li><li> Día 2: Medida OD 600 y cultivos frescos inocular en 5 ml de SC-URA OD 600 ~ 0,2. </li><li> Incubar los cultivos con rotación a 30 º C hasta que alcanzan la fase de registro OD 600 ~ 0,8-1,0. </li><li> Centrifugar las células en tubos cónicos de 15 ml a 4400 rpm durante 3 min, decantar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en 500 l de ddH 2 0; solución de transferencia a un tubo de microcentrífuga. </li><li> Centrifugar a 6000 rpm y descartar sobrenadante. </li><li> Resuspender las células en 5 ml de SC-URA-MET. Las células deben ser incubadas rotación en este medio durante 1 hora a 30 ° C. </li><li> Centrifugar las células y de lavado se repiten en ddH 2 0 y descartar sobrenadante. </li><li> Resuspend células en 5 medios SC-URA ml conteniendo 100 mg / ml de cicloheximida para inhibir la expresión de la proteína, y proceder de inmediato al paso 3. </li></ol> 3. Ensayo enzimático Recuperación FFL-GFP Este ensayo es un enfoque cuantitativo para determinar los niveles de enzima activa en una población. <ol><li> Preparación para este ensayo: <ol class="lroman"><li> Mida OD 600 para cada muestra. </li><li> Prepare la cantidad necesaria de D-luciferina necesaria basada en el número de muestras y el número de repeticiones más aproximadamente 1200 l para el tubo deseado. La concentración final de D-luciferina es ~ 23 g por 100 l de células. Inicialmente se disuelve en agua a una concentración de solución madre de 7,5 mg / ml y se diluyó hasta 455 g / ml en SC antes del experimento. En la Figura 2, tres repeticiones para cada muestra fueron analizados resultando en un total de 2,4 ml de D-luciferina que se utiliza. </li><li> Lector de placas Programa para el flash lumiensayo nescence (adaptado de BioTek Gen5 &quot;luminiscencia flash ensayo con inyección&quot;, para otros instrumentos sigan las instrucciones del fabricante) <ol class="lalpha"><li> Ajustar la temperatura a 30 ° C </li><li> Establecer lector de placas para añadir D-luciferina, agitar y leer cada pozo individual. </li><li> Leer luminiscencia (lectura de punto final, 5 segundos de tiempo de integración, 180 niveles de sensibilidad) </li><li> Para el ensayo de recuperación entre cada movimiento de la lectura durante 5 min, 20 min retrasar, y agitar un adicional de 5 min. </li><li> Dispensar 50 l de D-luciferina de un inyector. </li></ol></li></ol></li><li> Luminiscencia Precaliente-shock se mide inmediatamente después las células se añaden a los medios de comunicación que contienen cicloheximida para detener la síntesis de proteínas. <ol class="lroman"><li> Transferir 100 l de células para cada muestra con el número deseado de repeticiones en un blanco placa de 96 pocillos sólida. </li><li> Los controles deberán incluir un blanco de agua y las células que contienen un vector vacío. </li><li> Inicie la lectura con el SPEcificaciones mencionados anteriormente. </li></ol></li><li> Para desnaturalizar el resto de FFL de FFL-GFP, se incuba el cultivo de 5 ml en un tubo de cultivo de vidrio a 42 ° C con agitación durante 25 min. </li><li> Lecturas de luminiscencia de ensayo de recuperación comienzan inmediatamente después de las células se retiran de la incubadora, que es punto de tiempo cero. Medida luminiscencia mismo como se describe anteriormente para el primer punto de tiempo y cada 30 min durante 90 min. </li><li> Normalizar las muestras a los valores de luminiscencia de choque de precalentamiento que se han ajustado en base a la OD 600 (dividir los valores de precalentamiento de choque por OD 600). </li></ol> 4. Microscopía de fluorescencia Este ensayo es un método semi-cuantitativo para determinar la solubilización de los agregados con el tiempo en una población de células. <ol><li> La inducción es la misma como se describe en la Sección 2, Etapas 1-8 de protocolos. </li><li> Los mismos puntos de tiempo se toman como se ha descrito anteriormente (Sección 3, Paso 4), pero para micrófonoroscopy recoger 1 ml de células en precalentar-choque y cada punto de tiempo de recuperación, y las muestras se incuban que giran a 30 ° C en tubo de cultivo. </li><li> Visualización: <ol class="lroman"><li> Centrifugar 1 ml de células a 6000 rpm durante 30 segundos y quitar sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 2 l de ddH 2 O. </li><li> Mezcle 2 l de células más 2 l de 2% de agarosa de baja fusión en la diapositiva y agregue una hoja de cubierta. Con el fin de obtener un solo plano de células presione ligeramente el dedo en el centro de la hoja de la cubierta y gire hasta que la hoja de la cubierta es difícil de mover. </li><li> Las células se visualizaron utilizando aceite objetivo de 100X microscopio de fluorescencia, el uso de DIC para visualizar las células y el filtro FITC para visualizar la fluorescencia de GFP. </li><li> Tome varias imágenes para cada cepa en cada punto de tiempo para la cuantificación. Los campos para los cuadros deben contener ~ 15 a 30 células para el análisis post-experimental cuantitativa. </li><li> Para calcular el porcentaje de células que contienen agregados de la talla 50Células -100 suman y dividen el número de células que contienen agregados. </li></ol></li></ol> 5. Soltero Microscopía Celular Este método se utiliza para seguir la solubilización de los agregados individuales en una sola celda con el tiempo. <ol><li> Inducir la expresión FFL-GFP como se describe en la Sección 2, los pasos 1-8. </li><li> Después de choque térmico, las células de centrifugación en tubo cónico de 15 ml a 4400 rpm durante 2 min. </li><li> Lavar las células con 500 l de agua y volver a suspender en 20 l de ddH 2 O. </li><li> Para cada cepa, cortar una sección de 5x5 mm de una placa de agar SC-URA y el uso de la superficie que estaba en contacto con una placa de Petri, pipeta de 4 l de células y se extendió alrededor de la superficie de agar con la punta de la pipeta. Deje reposar durante aproximadamente 1 min. </li><li> Use pinzas para colocar la sección del cubo agar boca abajo en un ~ 55 mm con fondo de cristal plato n º 0 y presione ligeramente hacia abajo. </li><li> Visualización: <ol class="lroman"><li> Ver i-iii en la Secciónion 4. </li><li> Set coordina por 2-4 puntos focales para cada cepa en función de la densidad de la cultura. </li><li> Ajuste la cámara al tomar fotografías con una Z-stack con el rango adecuado (- / + 15 m con un grosor de 0,5 a 1,0 micras slice) cada 5 minutos durante un período de 90 min. </li></ol></li></ol>

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

En este artículo la proteína modelo FFL-GFP se utilizó para demostrar que el disaggregase levadura, Hsp104 contribuye a la proteína re-solubilización y reparación. Los ensayos enzimáticos y microscopía interrogados diferencialmente el estado de la misma proteína sustrato para determinar la eficiencia y el rendimiento de replegamiento. Resultados de los ensayos de recuperación enzimáticos sugieren que no sólo es la recuperación máxima en la cepa mutante hsp104D ineficiente, pero la magnitud inicial de la tensión...

En los seres humanos trastornos neurodegenerativos incluyendo la enfermedad de Alzheimer, Parkinson, y las enfermedades de Huntington se han relacionado con el mal plegamiento y la agregación de la proteína 10. Las células emplean chaperones moleculares para prevenir atrapamiento cinética de las proteínas celulares en las estructuras inactivas mal plegadas 6. Los acompañantes que participen en redes de interacción complejas dentro de la célula, pero no se conocen con exactitud cómo la suma de estas interacciones contribuye a proteostasis organismo. Uno de los principales chaperonas responsables de la mayoría de plegamiento de la proteína citosólica es la proteína de choque térmico de 70 kDa (Hsp70) de la familia 19. Se ha demostrado que en la pérdida de la levadura de Hsp70 disminuye la capacidad de doblar naciente de FFL heteróloga expresada y para replegar la proteína endógena, ornitina transcarbamilasa, in vivo 18, 7. La capacidad de analizar plegable con resolución de tiempo casi real, facilitará la comprensión de cómo los factores celulares cont adicionalribute a este proceso de Hsp70-dependiente. Además, plegado / replegamiento reacciones no puede ser completamente dependiente de estas proteínas que contribuyen, por lo que los ensayos deben ser lo suficientemente sensible como para detectar tanto los cambios grandes y pequeños en la cinética y la eficiencia. El disaggregase célula de levadura, Hsp104, juega un papel vital en la reparación de las proteínas mal plegadas agregados. Aunque Hsp104 homólogos han sido identificados en hongos y plantas, esta familia parece estar ausente en metazoos. Se ha propuesto que otras chaperonas tales como los de la familia Hsp110 realizan algunos de los conocidos Hsp104 actividades en mamíferos 16. Hsp104 es un +, complejo de proteínas hexameric AAA que funciona en la levadura de proteínas remodelación de agregados, que contribuyen a replegado y reparación 13. Hsp104, junto con la levadura Hsp70, ssa1, y la levadura Hsp40, Ydj1, se requiere para la recuperación de FLE desnaturalizado en células de levadura 5, 8. La pequeña proteína de choque térmico, Hsp26, también se ha demostrado que es Requirojo para la desagregación Hsp104 mediada OFF 2. FFL, es una proteína de dos dominios que se une el sustrato luciferina en el sitio activo y después de un cambio conformacional que requiere ATP y el oxígeno, descarboxila el sustrato liberando oxiluciferina, dióxido de carbono (CO 2), monofosfato de adenosina (AMP), y la luz 11, 9, 3. El sustrato disponible comercialmente FFL, D-luciferina, resulta en la emisión de luz entre 550-570 nm que pueden ser detectados usando un luminómetro 15. FLE es exquisitamente sensible a la desnaturalización de los tratamientos químicos o calor y agregados rápidamente al despliegue. Cuando se expone a temperaturas entre 39-45 ° C OFF se desarrolló reversible e inactivadas 12. Por el contrario, GFP y sus derivados son altamente resistentes a desplegamiento de la proteína tensiones 14. Por lo tanto, la fusión de estas dos proteínas permite OFF para funcionar como un resto experimentalmente lábil capaz de dirigirse funcional TFP a intracelular de depósitos que se pueden visualizar mediante microscopía de fluorescencia a la población y de los niveles de células individuales. Aplicación del ensayo enzimático en un lector de placas multimodo semi-automatizado junto con microscopía automatizada permite la evaluación simultánea sin precedentes de la cinética y el rendimiento de replegamiento reacciones. Además, la genética molecular fáciles del modelo eucariota Saccharomyces cerevisiae permite tanto la manipulación precisa de la red de control de calidad de la proteína y la oportunidad para que los enfoques basados ​​en descubrimientos para identificar nuevos jugadores que contribuyen a la respuesta al estrés celular y proteostasis. En este estudio, las cepas de tipo salvaje (WT) y HSP104 eliminación expresan FFL-GFP están sujetos a la desnaturalización de proteínas de choque térmico. FFL-GFP replegamiento se controla a través tanto de un ensayo enzimático y microscopía como una lectura de proxy para la reparación del proteoma expresado sobre un curso de tiempo de recuperación. En comparación con las células WT, mostramos ªsupresión cepa e Hsp104 es de ~ 60% menos eficientes en el replegamiento FFL-GFP, el apoyo a los hallazgos previos establecen un rol para Hsp104 en la reactivación de desnaturalizado OFF 2.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Synergy MX Lector de microplacas</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81-ZDC Microscopio confocal invertido</td><td>Olympus, Tokio Japón</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lumitrac 200 placas blancas de 96 pocillos</td><td>EE. UU. Software</td> de microscopía digital Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>SlideBook 5.0</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Acetato</td> de <td></td>Litio Sigma <td>L6883</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>PEG (polietilenglicol)</td><td>Fisher</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Malinckrodt</td><td>4948</td><td></td></tr><tr><td>SC</td><td>Sunrise</td><td>1300-030</td><td></td></tr><tr><td>SC-URA</td><td>Sunrise</td><td>1306-030</td><td></td></tr><tr><td>cicloheximida</td><td>Acros Organics</td><td>357420050</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferina</td><td>Sigma</td><td>L9504</td><td></td></tr><tr><td>agarosa de bajo punto de fusión</td><td>NuSieve</td><td>50082</td><td></td></tr><tr><td>aceite de inmersión</td><td>Cargille</td><td>16484</td><td></td></tr></tbody></table>

los ensayos acoplados para monitoreo replegamiento de proteínas en<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, definida como los procesos combinados de plegamiento de proteínas / biogénesis, replegado / reparación, y la degradación, es un delicado equilibrio celular que se debe mantener para evitar consecuencias perjudiciales 1. Factores externos o internos que perturban este equilibrio puede conducir a la agregación de la proteína, la toxicidad y la muerte celular. En los seres humanos esto es un factor importante que contribuye a los síntomas asociados con los trastornos neurodegenerativos tales como la enfermedad de Huntington, Parkinson, y las enfermedades de Alzheimer 10. Por lo tanto, es esencial que las proteínas implicadas en el mantenimiento de proteostasis ser identificados con el fin de desarrollar los tratamientos para estas enfermedades debilitantes. Este artículo describe las técnicas para el seguimiento en el plegamiento de proteínas in vivo a una resolución de tiempo casi real utilizando el modelo de proteína luciferasa de luciérnaga fusionado a la proteína fluorescente verde (FFL-GFP). FFL-GFP es una proteína quimérica modelo único como resto de FFL es extremadamente sensible a la tensión inducida por misfolding y la agregación, que inactiva la enzima 12. La actividad de luciferasa se controló usando un ensayo enzimático, y el resto de GFP proporciona un método de visualización de FFL soluble o agregada mediante microscopía automatizada. Estos métodos acoplados incorporan dos enfoques paralelos y técnicamente independiente para analizar tanto replegamiento y la reactivación funcional de una enzima después de estrés. Recuperación de la actividad se puede correlacionar directamente con la cinética de desagregación y de re-solubilización para comprender mejor cómo los factores de control de calidad de proteínas, tales como chaperones de la proteína colaboran para llevar a cabo estas funciones. Además, las supresiones de genes o mutaciones se pueden usar para probar las contribuciones de proteínas específicas o subunidades de proteínas a este proceso. En este artículo se reflexiona sobre las aportaciones de la proteína disaggregase Hsp104 13, conocido por colaborar con el factor de cambio Hsp40/70/nucleotide (NEF) Sistema 5 replegado, con el replegamiento de proteínas para validar este enfoque.

La levadura es dependiente de la disaggregase, Hsp104 se repliegue de manera eficiente las proteínas desnaturalizadas por el calor. La actividad de FFL-GFP se controló después de un choque 25 min calor, utilizando un ensayo de luminiscencia flash de la Figura 1. Los resultados de este ensayo automatizado se muestra en la Figura 2 revelaron un aumento gradual en la actividad de más de 90 min que finalmente condujo a una recuperación&gt; 80% en las células WT. La cepa hsp104Δ rec...

Este artículo describe el uso de una proteína de fusión luciferasa de luciérnaga-GFP para investigar<em&gt; In vivo</em&gt; Plegamiento de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. El uso de este reactivo, el replegamiento de un modelo de proteína desnaturalizada con calor puede ser controlada simultáneamente por microscopía de fluorescencia y un ensayo enzimático para investigar las funciones de los componentes de la red Proteostasis en el control de calidad de la proteína.

Los ensayos acoplados para Monitoreo replegamiento de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

El objetivo general de este procedimiento es monitorear in vivo la resolubilización y el plegamiento de proteínas en tiempo casi real mediante microscopía de fluorescencia y ensayos enzimáticos. Esto se logra primero transformando células con un plásmido que contiene luciferasa de luciérnaga fusionada a la proteína verde fluorescente o F-F-L-G-F-P. El segundo paso consiste en inducir la expresión de la proteína F-F-L-G-F-P, seguido del tratamiento con cicloheximida para detener la producción de la proteína.A continuación, mida la actividad de la luciferasa antes y durante un período de tiempo después de la desnaturalización térmica. El paso final consiste en visualizar las células para determinar la solubilidad de la proteína F-F-L-G-F-P. Finalmente, se utilizan microscopía de fluorescencia y ensayos enzimáticos para cuantificar la eficiencia de reactivación de una enzima modelo desdoblada en múltiples cepas.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el análisis en punto final es que permite correlacionar la actividad de la proteína con su estado de agregación a lo largo del tiempo. Para determinar la relación entre estos dos fenómenos, este método puede

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aquí se describe una nueva técnica de proteómica cuantitativa para la identificación de complejos de proteínas en Saccharomyces cerevisiae. En este estudio, hemos utilizado el método de SILAC junto con la purificación de afinidad seguida de espectrometría de masas para identificar con una alta especificidad de la unión de compañeros de una proteína del RE, Scs2p.

Identificación de los complejos de proteínas con la proteómica cuantitativa en S. cerevisiae

En este protocolo un método para medir el replegamiento de proteínas intracelulares tras el choque térmico se describe. Este método puede ser usado para estudiar foldases como chaperones moleculares y sus co-factores o componentes capaces de influir en su actividad. La actividad luciferasa de luciérnaga se utiliza como reportero para medir la actividad de las chaperonas replegado.

Ensayo Replegado intracelular

Este video describe un ensayo de degradación para proteínas mal plegadas utilizando el tratamiento con cicloheximida junto con el fraccionamiento de detergente. Este método ayuda a estudiar la dinámica de las proteínas mal plegadas y a descubrir en profundidad los mecanismos del recambio de proteínas.

Ensayo de degradación de proteínas propensas a plegamientos incorrectos: una técnica para monitorear la degradación de proteínas mal plegadas mediante tratamiento con cicloheximida y fraccionamiento de detergentes

Para estudiar la relación entre la homeostasis de las proteínas, el estrés y el envejecimiento, monitoreamos los cambios en el plegamiento de las proteínas siguiendo la disfunción de las proteínas, la localización de las proteínas en la célula y la estabilidad de las proteínas a nivel de organismo, celular y proteína, utilizando el metazoo genéticamente tratable Caenorhabditis elegans como sistema modelo.

Uso de Caenorhabditis elegans como sistema modelo para estudiar la homeostasis de proteínas en un organismo multicelular

Este artículo describe un ensayo basado en el crecimiento de levaduras para la determinación de los requisitos genéticos para la degradación de proteínas. También demuestra un método para la extracción rápida de proteínas de levadura, adecuado para la transferencia de Western para confirmar bioquímicamente los requisitos de degradación. Estas técnicas se pueden adaptar para monitorear la degradación de una variedad de proteínas.

Determinación basada en el crecimiento y en la confirmación bioquímica de Requisitos Genéticos para la degradación de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Presentamos un protocolo detallado para construir y cribar bibliotecas de mutantes para campañas de evolución dirigida en Saccharomyces cerevisiae.

Dirigida Método Evolución en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Biblioteca Creación y Proyección

interacciones de proteínas están en el corazón de la función de la célula. técnicas calorimétricas y espectroscópicas son comúnmente utilizados para caracterizarlos. Aquí describimos anisotropía de fluorescencia como una herramienta para estudiar la interacción entre la proteína mutada en el síndrome de Shwachman-Diamond (SBDS) y el factor de elongación 1 similar GTPasa (EFL1).

La anisotropía de fluorescencia como una herramienta para estudiar las interacciones proteína-proteína

Este artículo describe un protocolo de citometría de flujo basado en FRET para cuantificar el autoensamblaje de proteínas en células De. cerevisiae y HEK293T.

Detección y caracterización de autoensamblaje de proteínas en Vivo por citometría de flujo

Aquí, presentamos un protocolo para el uso de sustratos de levadura mostrados en la superficie para ensayos de modificación enzimática. La plataforma se demostró utilizando el análisis de la actividad de desfosforilación de la tirosina fosfatasa SHP-2 frente a uno de sus sustratos como ensayo representativo de modificación enzimática.

Modificación enzimática y evaluación por citometría de flujo de proteínas mostradas en la superficie de la levadura

Aquí describimos un protocolo detallado para la reasociación in vitro de subunidades ribosomales eucariotas purificadas y lavadas con sal para el análisis de la formación de partículas 80S. Este método se ilustra analizando subunidades ribosómicas aisladas de una cepa salvaje de Saccharomyces cerevisiae y una cepa mutante deficiente en la proteína ribosómica eL24.

In Vitro Ensayo de reasociación para medir la formación de partículas ribosómicas 80S utilizando subunidades ribosómicas lavadas con sal

Aprende a monitorear el replegamiento de proteínas in vivo en Saccharomyces cerevisiae mediante microscopía de fluorescencia y ensayos enzimáticos. Este método permite cuantificar la eficiencia de reactivación de enzimas desplegadas en tiempo real.

Los ensayos acoplados para Monitoreo replegamiento de proteínas en

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