La Caenorhabditis elegans Sistema Modelo para el Estudio Amylopathy

El objetivo general de este procedimiento es evaluar los efectos de la toxicidad de la beta amiloide sobre la función neuronal y la supervivencia. Esto se logra mediante la construcción de gusanos transgénicos C elegance que expresan un péptido beta amiloide con un indicador GFP en una neurona sensorial SE. A continuación, se evalúan las consecuencias conductuales de la expresión de beta amiloide en una neurona SE mediante un ensayo de quimiotaxis.

El tercer paso es obtener cultivos primarios de neuronas SE y luego tratar las neuronas cultivadas con agentes farmacológicos como Q-V-D-O-P-H para suprimir el efecto tóxico de la beta amiloide. En última instancia, los resultados pueden mostrar los efectos de la toxicidad de la beta amiloide en la función y la supervivencia de las neuronas SE a través de ensayos conductuales y farmacológicos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la neurodegeneración, como dilucidar mecanismos celulares y moleculares específicos.

Efectos neurotóxicos subyacentes de los oligómeros de beta amiloide. Para la transformación, se requieren almohadillas de inyección de 2%agros para demostrar los procedimientos. Coloque una gota de aros calientes disueltos en agua en un cubreobjetos de vidrio, y coloque rápidamente un segundo cubreobjetos en la gota y golpéelo ligeramente.

Al hacer la mezcla de inyección, asegúrese de centri fut y transferir los cinco microlitros superiores, libres de residuos y otros contaminantes a un tubo nuevo para la carga de inyección, la mezcla de inyección y el plásmido vacío a una pipeta de inyección por capilaridad. Medio microlitro suele ser suficiente para inyectar 100 gusanos para ensanchar la abertura de la pipeta de inyección, frote su punta contra el borde de un cubreobjetos montado en un portaobjetos de vidrio Aceite Halo carbono 700. La calidad de la apertura es fundamental.

Se juzga por la forma de la punta y, lo que es más importante, por el caudal, evaluado por el caudal y por el tamaño de las burbujas que se forman en la punta de la pipeta en respuesta a la presión de inyección. Ahora coloque una gota de aceite de carbono de 700 hectáreas en una almohadilla de inyección y transfiera varios gusanos a la almohadilla. Use un palillo de gusanos para empujar los gusanos hacia abajo sobre la almohadilla hasta que se adhieran a los aros.

Los gusanos deben estar orientados en filas con sus lados ventrales alineados. Evite tocarles la cabeza. Si después de varios intentos los gusanos no se adhieren a la almohadilla, pruebe con una almohadilla nueva o aumente el grosor o la concentración de la almohadilla.

Ahora inserte la pipeta en el gusano. En primer lugar, mueva la platina para colocar el tornillo sin fin debajo de la pipeta. Coloque la pipeta junto al núcleo central de la gónada.

Debido a que su citoplasma es compartido por muchos núcleos de células germinales, esto mejora la probabilidad de que el ADN inyectado pase a la progenie. La pipeta debe quedar casi paralela al gusano. En tercer lugar, mueva la punta verticalmente hacia el cuerpo hasta que la piel esté deprimida.

Por último, golpee suavemente el manipulador para inducir la inserción de las puntas. Ahora inyecte la solución de ADN. Aplique presión a la pipeta hasta que la gónada se hinche.

A continuación, detenga el flujo y retire el gusano de la pipeta. Pruebe el flujo de las agujas y luego inyecte las otras gónadas antes de pasar al siguiente gusano. Después de las inyecciones, agregue unos 10 microlitros de tampón de recuperación a los gusanos y espere a que comiencen a nadar.

Una vez nadando, agregue un volumen igual de M nueve amortiguadores. Cuando los gusanos vuelvan a nadar, continúe agregando M nueve hasta que la solución sea principalmente M nueve. Ahora transfiera cada gusano a un plato sentado.

Recoge gusanos GR en un mililitro de tampón M nine en un tubo de halcón de 50 mililitros. Luego, usando el tampón M nine, lave los gusanos mediante centrifugación repetida y reemplazo de la solución hasta que el M nine esté claro después del lavado. A continuación, agregue 10 volúmenes de solución básica de hipoclorito a los piojos.

Los gusanos peletizados incuban los gusanos a temperatura ambiente hasta que aproximadamente cuatro quintas partes de ellos se rompen, lo que generalmente toma 10 minutos. Controle la reacción tomando alícuotas para verlas con un microscopio. Detenga la reacción agregando un volumen igual de tampón de huevo estéril.

A continuación, recoja los huevos y las canales por centrifugación a 450 G durante cinco minutos. Retire suavemente el sobrenadante. Vuelva a añadir un volumen igual de tampón de huevo y vuelva a centrifugar el tubo a 450 g durante cinco minutos.

Repita el procedimiento hasta que el tampón esté limpio. Ahora incube los huevos durante la noche en un tampón M nine y, al día siguiente, siembre los huevos en placas NGM estándar. Prepara varios cubos de agar, de aproximadamente medio centímetro de lado.

Remoje los trozos de agar en una solución que contenga el atrayente deseado durante dos horas. Deposite un trozo de agar en una placa de prueba de 10 centímetros en la que se haya marcado la ubicación del punto de prueba y un punto de control. Prepara cinco de estos platos por experimento.

Permita que las placas formen un gradiente químico dejándolas toda la noche a 20 grados centígrados al día siguiente. Antes del experimento, agregue 10 microlitros de azida de sodio de 20 milimolares a cada punto de las placas. Esto actúa como un anestésico.

Comience el experimento colocando 20 gusanos sincronizados con la edad en el centro de la placa y luego coloque la placa en una incubadora de 20 grados centígrados durante una hora. Después de una hora, cuente los animales de la prueba sobre los puntos de control y calcule el índice de IC. Después de lisar los gusanos gr y limpiar los huevos y las canales como se describió anteriormente, vuelva a suspenderlos en dos mililitros de tampón de huevo estéril y agregue dos mililitros de sacarosa estéril al 60% en el tampón de huevo.

A continuación, mezcle el tubo a mano o por vórtice hasta que los huevos se resuspendan por completo. Centrifugar los huevos resuspendidos a 450 veces G durante 15 minutos. A continuación, recoja con cuidado el sobrenadante relleno de huevo y deseche el paladar para eliminar la sacarosa residual, vuelva a suspender los huevos en el tampón de huevo y centrifuérrelos a 450 g durante cinco minutos.

Recoja y deseche suavemente el sobrenadante y luego repita el proceso de limpieza tres veces en la campana. Utilice un tampón de huevo estéril que contenga una unidad por mililitro de quitinasa para resuspender los huevos peletizados. Deje que los huevos se digieran a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego comience a monitorear la reacción bajo un microscopio de cultivo celular invertido.

Cuando se hayan digerido entre el 70 y el 80% de las cáscaras de huevo, añadir cinco mililitros de medio de cultivo completo L 15 o CM 15. Para aislar las células, disocie las células para que no formen grupos haciéndolas pasar por una aguja de calibre 27 unas cuantas veces. Ahora pase la solución a través de una jeringa con un filtro de cinco micras.

Granular la suspensión celular disociada por centrifugación a 450 G durante 15 minutos. A continuación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células peletizadas en CM 15. Para asegurarse de que las células estén disociadas, revise la suspensión bajo un microscopio.

Por último, coloque las células disociadas en cubreobjetos de vidrio previamente recubiertos. Con la lectina de maní, las células se pueden mantener a temperatura ambiente con aire normal durante más de dos semanas. Utilizando las técnicas de transformación descritas, se construyó un gusano transgénico para expresar Beta 42 humano en las neuronas a SE, neuronas que detectan atrayentes solubles en agua como la biotina mediante el ensayo de quimiotaxis.

Se analizaron gusanos transgénicos de siete días de edad. Los controles no tuvieron problemas para encontrar biotina. Por el contrario, solo unos pocos gusanos que expresan un beta 42 pudieron encontrar el punto atrayente.

El índice de quimiotaxis para la biotina fue de 0,68 frente a 0,12 para los gusanos de control y experimento, respectivamente, a los tres o cuatro días. También hubo una pequeña pero detectable caída en el índice. Una neurona SER A cultivada a los cuatro días sigue expresando GFP a los nueve días de vida.

Sin embargo, la fluorescencia de GFP desapareció y se sospechó que la apoptosis probaba esta teoría. Las neuronas SER primarias A se prepararon como se describe y se complementaron con un inhibidor de caspasas de amplio espectro. Como se esperaba, el tratamiento detuvo la pérdida de fluorescencia, confirmando que la expresión de A beta 42 humana desencadena la apoptosis en las neuronas A SER.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir los elegantes gusanos transgénicos, estudiarlos en ensayos de comportamiento y cómo obtener el cultivo primario de Ambrose.