Name: La Caenorhabditis elegans Sistema Modelo para el Estudio Amylopathy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Aprende a evaluar la toxicidad de la amiloide beta en neuronas ASER de Caenorhabditis elegus mediante ensayos de quimiotaxis y cultivos primarios. Este método permite estudiar mecanismos de neurodegeneración y probar agentes farmacológicos protectores in vivo.

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<p class="jove_content"&gt; Agradecemos al Dr. Liu Shuang para la lectura crítica del manuscrito. El PCL12 construcción fue un regalo formulario Dr. Christopher D. Link. Este trabajo recibió el apoyo de dos becas de la Fundación Nacional para la Ciencia (0842708 y 1026958) y una subvención AHA (09GRNT2250529) para FS.</p

1. Construcción de gusanos transgénicos <ol><li> Transformación. <ol><li> Preparar almohadillas de inyección. Coloque una gota de caliente, 2% de agarosa disuelta en agua, sobre un cubreobjetos de vidrio. Colocar rápidamente un segundo cubreobjetos sobre la gota y golpee suavemente ella. Después de la agarosa se ha solidificado, cubreobjetos diapositivas aparte, y hornear el cubre-pad en un horno de vacío a 80 º CO / N. </li><li> Tire de pipetas. Utilizamos un P-97 Extractor Sutter tirar 1/0.5 mm OD / ID capilares de borosilicato con filamento. Las pipetas se forjan con punta cerrada que se rompe abierto en una etapa posterior. </li><li> Prepare la mezcla de inyección. Hacer la mezcla de inyección que contiene el ADN de interés (20 ng / l por construcción) más ADN de plásmido vacío a una concentración final de 150 ng / l. Centrifugar la mezcla de inyección para eliminar cualquier contaminante. Este paso es crucial, ya que los contaminantes reducen la eficiencia de transformación. Transferir el 5 l superior (escombros y otros contaminantes se acumulan en la parte inferior) a un tubo nuevo de be utilizada en la inyección. </li><li> Cargar la mezcla de inyección por capilaridad. La parte inferior de la pipeta se sumerge en la mezcla de inyección. Típicamente 0,5 l son suficientes para inyectar 100 gusanos. </li><li> Cargar pipeta de inyección. Inserte la pipeta en el soporte del micromanipulador y lo rompiera abierto por el roce de la punta contra el borde de una hoja de cubierta montada en un portaobjetos de vidrio o alternativamente contra los desechos en la plataforma de agarosa. Este es un paso crucial como consejos muy grande el daño del gusano y demasiado pequeños consejos se obstruyen fácilmente. La calidad de la punta rota puede ser juzgado por la forma y lo más importante por la tasa de flujo. La velocidad de flujo se puede evaluar por el tamaño de las burbujas que fluyen desde la punta abierta inmerso en una gota de aceite de halocarbono 700 en respuesta a una presión de inyección. </li><li> Traslado gusanos para rellenar inyección. Ponga una gota de aceite de hidrocarburo halogenado 700 en una plataforma de inyección y transferir varios (1 o 2 para principiantes) gusanos para el aceite. Utilice un gusano recoger a empujar los gusanos hacia abajo sobre la almohadilla hasta que lay se adhieren a la agarosa. Los gusanos deben estar orientadas en filas con lados ventrales en la misma dirección. Evite tocar la cabeza del gusano. Si después de varios intentos de los gusanos no se adhieren a la almohadilla, reemplazar con una almohadilla fresca o aumentar agarosa espesor y / o concentración. </li><li> Inserte la pipeta en el gusano. Al mover la etapa, colocar el gusano debajo de la pipeta. Coloque la pipeta en el núcleo central de la gónada porque su citoplasma es compartida por muchos núcleos de células germinales. Esto aumenta la probabilidad de entregar ADN inyectado a muchos progenie. La pipeta debe estar casi en paralelo al tornillo sin fin (~ 15 ° -25 ° de ángulo). Empuje verticalmente la punta de la pipeta hacia abajo el cuerpo del gusano hasta que se presiona la piel. A continuación, toque suavemente en el manipulador para inducir la inserción de la punta. Para obtener los mejores resultados inyectar ambas gónadas. </li><li> Se inyecta la solución de ADN. Aplique presión sobre la pipeta hasta que las olas gónadas. Detener el flujo y tire el gusano de la pipeta. Prueba de la aguja para el flujo y luego pasara la siguiente gusano y etapas de inyección de repetición. </li><li> Recuperar los gusanos: Añadir una gota (~ 10 l) de tampón de recuperación en los gusanos y se incuba hasta que los gusanos comienzan a nadar. Añadir un volumen igual de M9, espere hasta que los gusanos reanudar natación y repetir varias veces hasta que la solución es principalmente M9. Transferir individualmente gusanos de placas sembradas. </li></ol></li><li> Integración. <ol><li> Coloque 40 sanos, bien alimentados, L4 gusanos en un plato fresco </li><li> Irradiar con γ-ray con 4.000 rads de 40 min. Traslado gusanos irradiados (P0), en placas sembradas OP50 frescas (4 gusanos / placa). Los gusanos, alternativamente, pueden ser irradiados con una dosis de 300 J / m 2 UVs. </li><li> Traslado 10-20 transformantes F1 de cada placa para placas individuales, etiquetar las placas con el correspondiente origen P0. </li><li> Individual a cabo 2-4 transformantes F2 para cada F1 para placas separadas. Comprobar la progenie F3 para la transmisión de 100% del marcador de transformación. Por lo general, el 1-3% de la progenie de un wil gusano irradiadoTengo un evento de integración. </li><li> Hacer existencias de tres o más líneas transformantes independientes. </li></ol></li></ol> 2. Los ensayos de comportamiento <ol><li> Edad-sincronización. <ol><li> Crecer gusanos en estándar 10 cm placas NGM + OP50 E. coli hasta una gran población de adultos grávidas se alcanza (3-5 días). </li><li> Recoja los gusanos en tubos Falcon de 50 ml de suspensión en 1 ml de tampón M9. </li><li> Añadir 5 ml de tampón M9 y se centrifuga a 450 g durante 3 min. Desechar el sobrenadante. Repita 3-4x. </li><li> Al final de la última centrifugación, eliminar el sobrenadante y añadir 10 volúmenes de solución de hipoclorito básica (NaOH 0,5 M, 1% de hipoclorito recién mezclado) a los gusanos sedimentadas. Incubar a temperatura ambiente durante ~ 10 min. La reacción de lisis se puede controlar mediante la colocación de una gota de la reacción de lisis en un cubreobjetos y el examen de los gusanos bajo un microscopio. Cuando más o menos 80% de los gusanos están rotos la reacción debe ser detenido. </li><li> Detenga la reacción de lisis por complementog el mismo volumen de tampón de huevo estéril. </li><li> Recoger los huevos (y canales) por centrifugación a 450 xg durante 5 min. </li><li> Lavar los huevos con tampón estéril huevo 2-3x. </li><li> Incubar los huevos O / N en tampón M9 y sembrarlos en placas NGM estándar. </li></ol></li><li> Ensayo de quimiotaxis. <ol><li> Prepare varias piezas de agar aproximadamente 0.5x0.5x0.5 cm. Depositamos el agar en una placa de 10 cm y cortamos los trozos de agar a partir de ahí. </li><li> Remojar el trozo de agar en una solución que contiene el atrayente deseada (en concentraciones saturantes, cerca-saturantes) durante 2 horas. Atrayentes típicos son lisina (0,5 M), biotina (0,2 M). </li><li> Depositar un trozo de agar en una placa de ensayo de 10 cm en la que se han marcado la ubicación de un punto de prueba y un punto de control (Figura 1A). Permitir equilibración y la formación de un gradiente de O / N (Figura 1B). Preparar 5 placas para un solo experimento. </li><li> Antes del experimento añadir 10 l de 20 mM NaN 3 (anesthetic) para cada punto. </li><li> Coloque 20 gusanos edad sincronizados en el centro de la placa. Colocar la placa en la incubadora a 20 ° C. </li><li> Después de 1 hora, contar los animales en los puntos de prueba / control y calcular el índice de quimiotaxis (CI) de la siguiente manera: <img alt="Ecuación 1" fo:content-width=".863in" fo:src="/files/ftp_upload/50435/50435eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50435/50435eq1.jpg" /> donde N, test N y N Cnt., indican que el número total de animales, el número de animales en el área de análisis y el número de animales en el punto de control. </li></ol></li></ol> 3. Primaria embrionarias de cultivo celular <ol><li> Lyse gusanos como se describe en la edad de sincronización. </li><li> Detener la reacción mediante la adición de lisis el mismo volumen de tampón de huevo estéril y se centrifuga a 450 xg durante 5 min. Deseche con cuidado el sobrenadante, teniendo cuidado de no perder los huevos sedimentadas. Repita 2 a 3 veces o hasta que sobrenadante quede claro. </li><li> Resuspender pellet (huevos y cadáveres) En 2 ml de tampón de huevo estéril y añadir 2 ml de sacarosa al 60% estéril en tampón de huevo. Mezclar esta solución hasta que los huevos se resuspendieron completamente (ya que tienden a formar grumos bajo centrifugación) a mano o por agitación. </li><li> Centrifugar a 450 xg durante 15 min. </li><li> Transferir cuidadosamente el sobrenadante (que contiene los huevos) a un tubo estéril. Descartar sedimento que contiene canales y otras sub-productos de la lisis. </li><li> Retire sacarosa residual mediante resuspensión en tampón de los huevos de huevo y centrifugación a 450 xg durante 5 min. Recoger con cuidado y desechar el sobrenadante. Repita 3 veces. </li><li> Bajo una campana laminar resuspender huevos sedimentadas en tampón de huevo estéril que contiene 1 U / ml quitinasa a temperatura ambiente para digerir las cáscaras de huevo. Después de 30 min empieza a controlar la reacción (bajo un microscopio de cultivo de células invertida). Cada lote de quitinasa tiene una actividad ligeramente diferente. Típicamente, la digestión se completó en 1 hr. </li><li> Cuando aproximadamente 70-80% cáscaras de huevo son digeridos por quitinasa complemento CM-15 (L-15 de cultivo celular medio que contiene 10% de suero bovino fetal, 50 U / ml de penicilina, y 50 mg / ml de estreptomicina). Disociar las células utilizando una jeringa con un calibre de 27. Se filtra la suspensión de células con un filtro de 5,0 micras para eliminar embriones intactos, grupos de células y larvas. </li><li> Pellet la suspensión de células disociadas por centrifugación a 450 xg durante 15 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 15-CM medio de cultivo celular. </li><li> Células disociadas Plate sobre cubreobjetos de vidrio previamente revestidas con lectina de cacahuete (0,1 mg / ml) disuelto en agua Nota:. Células deben adherirse al sustrato con el fin de diferenciar. </li><li> Las células se pueden mantener a temperatura ambiente (16-20 ° C) en aire durante más de 2 semanas. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Aquí se describe un enfoque combinado, para estudiar los aspectos celulares y moleculares de amylopathies utilizando C. elegans. Las ventajas de este enfoque incluyen:. 1) bajo costo C.elegans se mantiene en la placa de Petri normal de sembrado con bacterias, a temperatura ambiente. 2) genética potentes. Los animales transgénicos pueden obtenerse en pocos meses y una amplia gama de secuencias de promotor está disponible para conducir la expresión del gen deseado en las neuronas específicas. 3), bien ca...

Beta amiloide (Aß) es un péptido de 36-43 aminoácidos que se forma después de la escisión secuencial de la proteína precursora de amiloide (APP) por β y γ secretasas 1. La secretasa γ procesa el extremo C-terminal del péptido Aß y es responsable de sus longitudes variables 5. Las formas más comunes de Aß son Aß 40 y Ap 42, siendo esta última más comúnmente asociado a condiciones patológicas tales como 5 AD. A altas concentraciones de Aß forma β-hojas que se agregan para formar fibrillas amiloides 6. Depósitos de fibrillas son el principal componente de las placas seniles que rodean las neuronas. Ambas placas y difusibles, oligómeros Aß no la placa, se cree que constituyen las formas patogénicas subyacentes de Aß. El estudio de laboratorio de amylopathies neuronales se complica por el hecho de que estas condiciones de progreso con el tiempo. Por lo tanto, es IMPORTANTESt para el desarrollo de animales genéticamente manejable modelos complementarios a los ratones-con vida corta. Estos modelos se pueden utilizar para elucidar aspectos específicos de amylopathies-típicamente celular y molecular y en virtud de su simplicidad, para ayudar a capturar la esencia del problema. El gusano Caenorhabditis elegans cataratas es esta categoría. Tiene una vida corta, ~ 20 días y, además, los procesos celulares básicos como la regulación de la expresión génica, el tráfico de proteínas, la conectividad neuronal, sinaptogénesis, la señalización celular y la muerte son similares a los mamíferos 7. Las características únicas del gusano incluyen la genética de gran alcance y la falta de un sistema de vasos, lo que permite estudiar el daño neuronal independientemente del daño vascular. Por otro lado, la falta de un cerebro limita el uso de C. elegans para estudiar muchos aspectos de la neurodegeneración. Además, la reproducción y la identificación de las distribuciones anatómicas de las lesiones no se pueden realizar en este organismo. Otro límiteciones incluyen la dificultad para evaluar tanto las diferencias en los perfiles de expresión génica y alteraciones de la conducta compleja y la función de la memoria. A continuación se describen los métodos para generar C. modelos elegans de amylopathies.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. NGM</fuerte></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>3 g</td></tr><tr><td>Agar bacteriológico</td><td>AMRESCO</td><td>J637</td><td>17 g</td></tr><tr><td>Bacto-peptona</td><td>AMRESCO</td><td>J636</td><td>2,5 g</td></tr><tr><td>Agua</td><td></td><td></td> destilada <td>Llevar a 975 ml</td></tr><tr><td colspan="4">Esterilizado en autoclave, luego agregar los siguientes elementos y mezclar bien</td></tr><tr><td>Sulfato</td> <td>de magnesioSigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td>1 ml de 1 M de caldo</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>1 ml de 1 M de caldo</td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3045</td><td>1 ml de 5 mg/ml de caldo ( en etanol)</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de fosfato <td>de potasio 25 ml de 1M de caldo</td></tr><tr><td colspan="4">2. Tampón de fosfato de potasio</fuerte></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>108,3 g</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td>35,6 g</td></tr><tr><td>Agua</td><td></td><td></td> destilada <td>Llevar a 1 L</td></tr><tr><td colspan="4">Esterilizado en autoclave</td></tr><tr><td colspan="4">3. Tampón M9</fuerte></td></tr><tr><td>Fosfato potásico monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>3 g</td></tr><tr><td>Fosfato sódico dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td>6 g</td></tr><tr><td>Cloruro sódico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td>1 ml de 1 M de caldo</td></tr><tr><td>Agua</td><td></td><td></td> destilada <td>Llevar a 1 L</td></tr><tr><td colspan="4">Esterilizado en autoclave</td></tr><tr><td colspan="4">4. Tampón de huevo (pH 7,3, 340 mOsm)</fuerte></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>118 mM</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>48 mM</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4880</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td>25 mM</td></tr><tr><td>Agua</td><td></td><td></td> destilada <td>Llevar a 1 L</td></tr><tr><td colspan="4">Esterilizado en autoclave</td></tr><tr><td colspan="4">5. CM-15</fuerte></td></tr><tr><td>L-15 medio de cultivo</td><td>Gibco</td><td>11415</td><td>450 ml</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>50 unidades/ml</td></tr><tr><td>Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>50 g/ml</td></tr><tr><td colspan="4">Ajustar a 340 mOsm con sacarosa y luego filtrar estéril en botellas esterilizadas en autoclave y almacenar a 4 & grados; C</td></tr><tr><td colspan="4">6. Otros reactivos</fuerte></td></tr><tr><td>Aceite Halocarbon 700</td><td>Productos de Halocarbono</td><td>9002-83-9</td><td></td></tr><tr><td>5 &mu; m Filtro de jeringa Acrodisc PALL</td><td>Co.</td><td>4199</td><td></td></tr><tr><td>Quitinasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6137-5UN</td><td></td></tr><tr><td>Lectina (cacahuete)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0881-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S320</td><td></td></tr><tr><td>Lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Solución</td> <td>de hipoclorito de sodioSigma-Aldrich</td><td>425044</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr></tbody></table>

la<em&gt; caenorhabditis elegans</em&gt; sistema modelo para el estudio amylopathy

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy es un término que describe la síntesis y la acumulación anormal de la proteína beta amiloide (Aß) en los tejidos con el tiempo. Aß es un sello distintivo de la enfermedad de Alzheimer (EA) y se encuentra en la demencia con cuerpos de Lewy, la miositis de cuerpos de inclusión y la angiopatía amiloide cerebral 1-4. Amylopathies desarrollan progresivamente con el tiempo. Por esta razón organismos simples con periodos de vida cortos pueden ayudar a dilucidar los aspectos moleculares de estas condiciones. A continuación, se describen los protocolos experimentales para el estudio de la neurodegeneración mediada por Aß usando el gusano Caenorhabditis elegans. Así, construimos gusanos transgénicos mediante la inyección de ADN que codifica Aß humano 42 en las gónadas sincitial de adultos hermafroditas. Líneas transformantes se estabilizan mediante una integración mutagénesis inducida. Los nematodos son la edad sincronizado mediante la recolección y la siembra de sus huevos. La función de las neuronas que expresan Aß 42 se prueba en ensayos de comportamiento oportunos (ensayo de quimiotaxiss). Cultivos neuronales primarios obtenidos a partir de embriones se utilizan para complementar los datos de comportamiento y para probar los efectos neuroprotectores de los compuestos anti-apoptóticas.

Con nuestros protocolos se estudian los efectos de los humanos Aß 42 oligómero en la función neuronal 8. Un fragmento que codifica Aß humano 42 y la secuencia de codificación del péptido señal artificial de fuego vector de pPD50.52 se amplificó a partir constructo PCL12 9 usando cebadores que introdujeron un Sma 1 sitio de endonucleasa de restricción en los extremos. El fragmento se inserta en un constructo que contiene un FLP-6 secuencia del promotor de 2481 pb en el...

Se describen métodos para estudiar los aspectos de la amylopathies en el gusano<em&gt; C. elegans</em&gt;. Mostramos cómo construir gusanos expresan Aß humano<sub&gt; 42</sub&gt; En las neuronas y la forma de poner a prueba su función en ensayos de comportamiento. Además, muestran cómo obtener cultivos neuronales primarios que pueden ser utilizados para las pruebas farmacológicas.

La<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema Modelo para el Estudio Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar los efectos de la toxicidad de beta amiloide sobre la función y supervivencia neuronales. Esto se logra primero mediante la construcción de gusanos transgénicos de C elegans que expresan un péptido beta amiloide con un reportero GFP en neuronas sensoriales SE. A continuación, se evalúa la consecuencia conductual de la expresión de beta amiloide en neuronas SE mediante un ensayo de quimiotaxis.El tercer paso consiste en obtener cultivos primarios de neuronas a SE y luego tratar las neuronas cultivadas con agentes farmacológicos como Q-V-D-O-P-H para suprimir el efecto tóxico del beta amiloide. En última instancia, los resultados pueden mostrar los efectos de la toxicidad del beta amiloide sobre la función y supervivencia de las neuronas a SE mediante ensayos conductuales y farmacológicos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la neurodegeneración, como elucidar los mecanismos celulares y moleculares específicos.Efectos neurotóxicos subyacentes de los oligómeros de beta amiloide. El Dr. Zing Dwan, un posdoctorado de mi laboratorio, demostrará los procedimientos. Para la transformación, se requieren placas de inyección de agar al 2%. Coloque una gota de agar caliente disuelto en agua sobre un cubreobjetos de vidrio y coloque rápidamente un segundo cubreobjetos sobre la gota, dándole ligeros golpecitos.Al preparar la mezcla de inyección, asegúrese de centrifugar y transferir los cinco microlitros superiores, libres de residuos y otros contaminantes, a un tubo nuevo para la carga de inyección. Introduzca la mezcla de inyección y el plásmido vacío en una pipeta de inyección por acción capilar. Medio microlitro suele ser suficiente para inyectar a 100 gusanos. Para agrandar la abertura de la pipeta de inyección, frote su punta contra el borde de una cubreobjetos montada sobre un portaobjetos en aceite de halo carbono 700. La calidad de la abertura es fundamental.Se evalúa por la forma de la punta, y lo más importante, por la velocidad de flujo, determinada por el flujo y por el tamaño de las burbujas que se forman en la punta de la pipeta en respuesta a la presión de inyección. Coloque ahora una gota de aceite de carbono hueco 700 sobre una almohadilla de inyección y transfiera varios gusanos a la almohadilla. Utilice un punzón para gusanos para empujarlos hacia abajo sobre la almohadilla hasta que se adhieran a los aros.Los gusanos deben orientarse en filas con sus lados ventrales alineados. Evite tocar sus cabezas. Si después de varios intentos los gusanos no se adhieren al pad, pruebe con un pad nuevo o aumente el grosor o la concentración del pad.Ahora inserte la pipeta en el gusano. Primero, mueva la platina para colocar el gusano debajo de la pipeta. Posicione la pipeta junto al núcleo central del gonad.Dado que su citoplasma es compartido por muchos núcleos de células germinales, esto aumenta la probabilidad de que el ADN inyectado se transmita a la descendencia. La pipeta debe colocarse casi paralela al gusano. En tercer lugar, mueva la punta verticalmente hacia el cuerpo hasta que la piel se hunda.Por último, golpee suavemente el manipulador para inducir la inserción de las puntas. Ahora inyecte la solución de ADN. Aplique presión a la pipeta hasta que el gonad se hinche.Luego detenga el flujo y retire el gusano de la pipeta. Pruebe el flujo de la aguja y, a continuación, inyecte los otros gonadas antes de pasar al siguiente gusano. Después de las inyecciones, agregue aproximadamente 10 microlitros de tampón de recuperación a los gusanos y espere a que comiencen a nadar.Una vez que estén nadando, añada un volumen igual de tampón M nueve. Cuando los gusanos reanuden la natación, siga añadiendo tampón M nueve hasta que la solución sea principalmente M nueve. Ahora transfiera cada gusano a una placa con asiento.Recolecte gusanos GR en un mililitro de tampón M nueve en un tubo cónico de 50 mililitros. Luego, usando tampón M nueve, lave los gusanos mediante centrifugaciones repetidas y reemplazo de la solución hasta que el tampón M nueve quede claro tras el lavado. A continuación, agregue 10 volúmenes de solución básica de hipoclorito a los gusanos.Incubar los gusanos pelletizados a temperatura ambiente hasta que aproximadamente cuatro quintas partes de ellos se rompan, lo cual normalmente toma 10 minutos. Monitorear la reacción tomando alícuotas para observarlas con un microscopio. Detener la reacción añadiendo un volumen igual de tampón estéril para huevos.Luego, recoger los huevos y las carroñas mediante centrifugación a 450 G durante cinco minutos. Eliminar cuidadosamente el sobrenadante. Añadir de nuevo un volumen igual de tampón para huevos y centrifugar el tubo nuevamente a 450 G durante cinco minutos.Repita el procedimiento hasta que el tampón esté claro. Incube los huevos durante la noche en tampón M nueve y, al día siguiente, siémbrelos en placas NGM estándar. Prepare varios cubos de agar, aproximadamente de medio centímetro por lado.Remoje los trozos de agar en una solución que contenga el atrayente deseado durante dos horas. Coloque un trozo de agar en una placa de prueba de 10 centímetros en la que se hayan marcado la ubicación del punto de prueba y un punto de control. Prepare cinco placas de este tipo por experimento.Deje que las placas formen un gradiente químico dejándolas durante la noche a 20 grados Celsius al día siguiente. Antes del experimento, agregue 10 microlitros de azida sódica 20 milimolar a cada punto en las placas. Esto actúa como un anestésico.Inicie el experimento colocando 20 gusanos sincronizados por edad en el centro de la placa, y luego coloque la placa en un incubador a 20 grados Celsius durante una hora. Después de una hora, cuente los animales en las zonas de prueba respecto a las zonas de control y calcule el índice CI. Después de lisar los gusanos gr y limpiar los huevos y cadáveres como se describió anteriormente, resuspenda estos en dos mililitros de tampón estéril para huevos y agregue dos mililitros de sacarosa estéril al 60% en tampón para huevos.Luego, mezcle el tubo manualmente o mediante vortex hasta que los huevos se resuspendan completamente. Centrifugue los huevos resuspendidos a 450 veces G durante 15 minutos. A continuación, recoja cuidadosamente el sobrenadante cargado de huevos y deseche el sedimento para eliminar la sacarosa residual, resuspenda los huevos en tampón para huevos y centrifúgelos a 450 G durante cinco minutos.Recopile y deseche suavemente el sobrenadante y luego repita el proceso de limpieza tres veces en la campana. Utilice tampón estéril de huevo que contenga una unidad por mililitro de quitinasa para resuspender los huevos sedimentados. Deje digerir los huevos a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego comience a monitorear la reacción bajo un microscopio invertido para cultivo celular.Cuando se hayan digerido del 70 al 80 % de las cáscaras de huevo, agregue cinco mililitros de medio de cultivo L 15 completo o CM 15. Para aislar las células, disocie las células para que no formen agregados, pasándolas varias veces a través de una aguja de calibre 27. Ahora pase la solución a través de una jeringa con un filtro de cinco micrones.Centrifugar la suspensión celular disociada a 450 G durante 15 minutos para obtener el sedimento. Luego, eliminar el sobrenadante y resuspender las células sedimentadas en CM 15. Para asegurarse de que las células estén disociadas, examinar la suspensión bajo un microscopio.Finalmente, siembre las células disociadas sobre laminillas de vidrio previamente recubiertas. Con lectina de maní, las células pueden mantenerse a temperatura ambiente y en aire normal durante más de dos semanas. Mediante las técnicas de transformación descritas, se construyó un gusano transgénico para expresar la Beta humana 42 en las neuronas SE, neuronas que detectan atrayentes solubles en agua, como la biotina, utilizando el ensayo de quimiotaxis.Se probaron gusanos transgénicos de siete días de edad. Los controles no tuvieron dificultad para encontrar la biotina. En contraste, solo unos pocos gusanos que expresaban una beta 42 lograron encontrar el punto del atrayente.El índice de quimiotaxis para biotina fue de 0,68 frente a 0,12 para los gusanos control y experimentales, respectivamente, entre los tres y cuatro días. También hubo una pequeña pero detectable disminución en el índice. Una neurona A SER cultivada a los cuatro días aún expresaba GFP después de nueve días de vida.Sin embargo, la fluorescencia de GFP desapareció y se sospechó apoptosis para comprobar esta teoría. Se prepararon neuronas primarias A SER como se describió y se suplementaron con un inhibidor de caspasa de amplio espectro. Como se esperaba, el tratamiento detuvo la pérdida de fluorescencia, lo que confirmó que la expresión de A beta 42 humano induce apoptosis en neuronas A SER.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir gusanos transgénicos elegantes, estudiarlos en ensayos conductuales y cómo obtener cultivos primarios a partir de Ambrose.

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