La reconstitución de un canal Kv en las membranas lipídicas de Estudios estructurales y funcionales

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar una descripción detallada de las técnicas para el estudio funcional y estructural del efecto de los lípidos sobre las proteínas de membrana. Esto se logra primero mediante la expresión y purificación del canal de potasio activado por voltaje. El segundo paso consiste en la reconstrucción del canal iónico.

A continuación, se realiza la grabación eléctrica de los canales iónicos en bicapas lipídicas para el estudio funcional de los canales iónicos. El paso final consiste en la cristalización de los canales iónicos en la membrana para la determinación de su estructura. En definitiva, se utilizan ensayos bioquímicos, el método electrofisiológico y el estudio de cristalografía electrónica para investigar los efectos de los lípidos sobre el movimiento del sensor de voltaje de los canales iónicos.

Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a los muchos detalles técnicos en la reconstitución de proteínas y las grabaciones biológicas. Esperamos que este video les ayude a seguir todo el procedimiento y tener éxito. La demostración de todo el proceso será realizada por el Dr. Hui Jim de mi laboratorio.

Antes de la preparación de lípidos, se dispuso de un tubo de ensayo de vidrio desechable de 14 mililitros, un tubo de vidrio con tapón roscado y una jeringa de vidrio de 250 microlitros con cloroformo. A continuación, transfiera 10 mililitros de cloroformo al tubo de ensayo. Para preparar liposomas de POPE y POPG, transfiera 3,75 miligramos de POPE y 1,25 miligramos de POPG en cloroformo al tubo de vidrio con tapón roscado.

Seque las lípidos bajo un flujo continuo de gas argón cuando ya no quede cloroformo visible. Siga secando las lípidos bajo vacío ambiente durante una hora. A continuación, agregue 440 microlitros de tampón de bajo contenido salino o agua al vórtice de lípidos secos.

El tubo para hidratar los lípidos. La suspensión de lípidos debe tener un aspecto blanquecino y turbio. A continuación, sonicar la suspensión de lípidos en un baño de hielo hasta que la solución de vesículas se vuelva traslúcida.

Luego, añada 50 microlitros de cloruro de potasio tres molar y 10 microlitros de DM 0,5 molar a la mezcla, de modo que la suspensión lipídica final contenga cloruro de potasio 300 milimolar y DM 10 milimolar. Incube la solución en un rotador durante dos horas a temperatura ambiente para permitir la formación de micelas mixtas de lípidos y detergente. Tras la incubación, la suspensión debe volverse ligeramente turbia debido a la fusión inducida por el detergente de las pequeñas vesículas de ELLA. Cuando la proteína esté concentrada a más de dos miligramos por mililitro, añada los componentes indicados, la mezcla de lípidos y detergente, para obtener un volumen final de un mililitro.

Luego, incube la mezcla de proteína, lípido y detergente en el tubo de vidrio en un rotador durante otras dos horas. La preparación del KVAP en mezcla con el DTaP solubilizado con detergente o DOGS es similar a la preparación de lípidos para el vesículo P-O-P-E-P-O-P-G. Sin embargo, la sonicación de los lípidos hidratados en vesículos unilamelares pequeños toma más tiempo que en el caso de los lípidos P-O-P-E-P-O-P-G; los vesículos de DOGS pueden fusionarse lentamente entre sí y formar pequeñas gotas oleosas para solubilizar completamente el dote o el DOGS.

Las vesículas sonicadas se mezclan con DM 10 milimolar y beta og 40 milimolar. La mezcla de lípidos y detergente se incuba durante la noche a temperatura ambiente y la mezcla debe quedar bastante clara, sin partículas ni gotas pequeñas. A continuación, mezcle la proteína KVAP con el DTaP o DOGS solubilizado en detergente en una proporción proteína a lípido que sea menor o igual a uno a 10.

Se deja que la mezcla de proteína, detergente y lípido incube a temperatura ambiente durante dos o tres horas con rotación orbital continua. Para demostrar la eliminación lenta de los detergentes que tienen una CMC relativamente alta, como DM y Beta og, primero prepare dos litros de tampón de diálisis por cada mililitro de mezcla.

Luego, corte un trozo de longitud adecuada de tubo de diálisis y lávelo con agua desionizada para verificar y asegurarse de que no haya fugas en el tubo. A continuación, cargue la mezcla de proteína, lípido y detergente en el tubo de diálisis. Sujete ambos extremos del tubo con el mínimo espacio posible por encima de la solución.

Coloque el tubo cargado sobre una placa agitadora en el tampón de diálisis para que el tubo gire lentamente en la solución. Cambie el tampón de diálisis una vez cada ocho horas. Ahora prepare las perlas de poliestireno para la eliminación de detergentes con bajo CMC, primero pesando 0.5 gramos de perlas secas.

Luego colóquelos en un tubo Corning de 50 mililitros y agregue 20 mililitros de metanol; someta la solución a ultrasonido en un baño durante cinco minutos para eliminar las burbujas atrapadas y centrifugue las perlas a 5.000 rpm durante cinco minutos. Posteriormente, deseche completamente el metanol y repita la lavada con etanol y agua Milli-Q. A continuación, almacene las perlas lavadas en etanol al 20 % a cuatro grados Celsius y cámbielas a un tampón libre de detergentes antes de su uso. Estime la cantidad de detergentes en la mezcla de proteína, lípido y detergente que se va a tratar y calcule la cantidad de perlas necesarias para eliminar los detergentes.

Pese las perlas húmedas sin exceso de agua y añádalas directamente a la mezcla de proteína y espere al menos de 15 a 20 minutos para que las perlas sean completamente efectivas. Para eliminar 8,7 miligramos de DDM en un mililitro de solución, un total de 87 miligramos de perlas de poliestireno, como las bio perlas SM dos, se divide en cinco porciones iguales. Mezcle la mezcla de proteína, lípido y detergente con cada fracción durante 20 a 30 minutos con rotación constante de extremo a extremo a temperatura ambiente.

Centrifugar las perlas, luego transferir el sobrenadante a la siguiente fracción de perlas y repetir hasta el final. En este paso, comenzar limpiando un tubo de ensayo de vidrio y un vial ámbar con tapón roscado con superficie de teflón y un conjunto de jeringas de vidrio con cloroformo. Luego, secar el vial ámbar bajo una corriente de gas argón.

A continuación, transfiera 0,75 miligramos de POPE y 0,25 miligramos de POPG en cloroformo al vial y evapore el cloroformo con gas argón. Después, agregue 0,2 mililitros de pentano al vial para disolver los lípidos secos y seque completamente para eliminar el cloroformo residual. A continuación, agregue 50 microlitros de decano al vial para disolver el lípido seco.

Ahora, pinte el orificio redondo en la superficie cilíndrica del vaso de bicapa con los lípidos sin introducir ninguna solución lipídica en el orificio. Espere de uno a dos minutos para que el disolvente se evapore completamente antes de realizar grabaciones eléctricas de los canales KVAP en bicapas lipídicas. Inserte el vaso en la cámara de grabación, coloque los puentes salinos y conecte los electrodos a ambos lados del vaso de grabación.

Agregue la solución de CYS a los orificios del electrodo y la solución de CYS y trans a las cámaras interna y externa. Luego, ajuste el desfase de potencial entre ambos lados de la cámara a menos de dos milivoltios, y a continuación aplique lípidos sobre el orificio en la tapa. Espere hasta que la membrana se adelgace y se vuelva relativamente estable.

En cuanto la membrana se estabilice, introduzca de 0,5 a un microlitro del canal que contiene vesículas colocando el extremo fino de la punta de la pipeta P2 justo encima del orificio. Las vesículas caen a través del orificio hasta el fondo del recipiente.

Para probar los canales KVAP en la bicapa. Se aplica un breve impulso de 80 milivoltios desde el potencial de reposo de menos 80 milivoltios debido a la inactivación rápida y recuperación lenta tras la activación; se establece un intervalo largo, de aproximadamente 120 segundos para los canales en membranas de PEPG, entre dos impulsos. Una vez que la corriente parece adecuada en magnitud, equilibre las concentraciones iónicas en las soluciones de ambos lados de la membrana mediante la adición de sales iónicas adicionales al lado de baja concentración.

Aquí se muestra una imagen de un cristal en 2D teñido negativamente, correspondiente a una etapa intermedia de la optimización de cristales. Los cristales fueron teñidos con molibdato de amonio al 6 %, pH 6,4, más 0,5 % de triosa debido al azúcar, ya que a veces se acumulaban unos sobre otros. El cuadro cuadrado negro indica una zona que da lugar al patrón de difracción con manchas de difracción.

Al acercarse hasta aproximadamente 20 angstroms, se observa una imagen de microscopía electrónica criogénica (cryo EM) de un cristal 2D a partir de una muestra similar a la mostrada anteriormente. El espécimen se mezcló con 3% TLOs y se congeló mediante inmersión directa, luego se obtuvo la imagen en un microscopio electrónico criogénico a 50.000 aumentos. Es evidente que existían defectos locales en el empaquetamiento cristalino.

Aquí hay otra imagen de microscopía electrónica criogénica de un cristal aún más optimizado. La muestra fue embebida en 0,75 % de tanino y 10 % de tree hellos, y la imagen fue tomada a 50.000 x. Las líneas rectas en el empaquetamiento apretado sugieren que los canales estaban bien ordenados en este tipo de cristales, mientras que las dos flechas negras marcan los vectores cuadrados.

Después de ver este video, espero que obtengan una buena comprensión sobre cómo manipular adecuadamente los lípidos y las proteínas, y que este video los ayude a estudiar de manera más eficiente la interacción entre lípidos y proteínas en la membrana.