Name: La reconstitución de un canal Kv en las membranas lipídicas de Estudios estructurales y funcionales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Aprenda a reconstituir canales de potasio en membranas lipídicas para estudios estructurales y funcionales. Este método permite análisis bioquímicos, registros eléctricos y cristalografía electrónica de proteínas de membrana.

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Los estudios sobre KvAP en el laboratorio de Jiang han obtenido una ayuda importante desde el laboratorio del Dr. Roderick MacKinnon, de la Universidad Rockefeller. Un agradecimiento especial al Dr. Kathlynn Brown y Michael McQuire por sus consejos y ayuda en nuestros experimentos de pantalla fago. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH (GM088745 GM093271 y de Q-XJ) y la AHA (12IRG9400019 a Q-XJ).

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Los autores no tienen nada que revelar.

La reconstitución de los canales KvAP en diferentes membranas se ha utilizado en varios estudios 8-10. Siguiendo la idea de asegurar la distribución de los lípidos entre detergentes / lípidos micelas mixtas y las micelas mixtas proteína / detergente / lípidos, que son capaces de llegar a la reconstitución casi completa del KvAP en las membranas hechas de muy diferentes lípidos. Cada canal KvAP tetrameric necesita ~ 100 moléculas de lípidos para cubrir totalmente su dominio transmembrana. El requisito esencial...

Células materiales de intercambio e información con su entorno a través de las funciones de las proteínas de membrana específicos 1. Las proteínas de membrana en membranas celulares funcionan como bombas, canales, receptores, enzimas intramembrane, enlazadores y simpatizantes estructurales a través de membranas. Las mutaciones que afectan a las proteínas de la membrana se han relacionado con muchas enfermedades humanas. De hecho, muchas proteínas de membrana han sido los principales objetivos de drogas porque son importantes y de fácil acceso en las membranas celulares. Por lo tanto, es muy importante para comprender la estructura y la función de varias proteínas de membrana en membranas, y que sea posible diseñar nuevos métodos para aliviar los efectos perjudiciales de las proteínas mutantes en las enfermedades humanas. Los lípidos rodean todas las proteínas de membrana integradas en bicapas 2, 3. En las membranas eucariotas, son conocidos los diversos tipos diferentes de lípidos a ser organizado en microdominios 4, 5.Muchas proteínas de la membrana se muestran para ser distribuidos entre estos microdominios, así como la fase fluida voluminosos de las membranas 3, 6. El mecanismo subyacente a la organización de los microdominios y la entrega de proteínas de membrana en ellos y la importancia fisiológica de dichas distribuciones son claramente importantes, pero siguen siendo poco conocidos. Una importante dificultad técnica en el estudio de los efectos sobre los lípidos de las proteínas de membrana es la reconstitución fiable purificada bioquímicamente las proteínas de membrana en las membranas de la composición lipídica bien controlados por lo que casi todas las proteínas reconstituidos son funcionales 7. En los últimos años, hemos desarrollado métodos para reconstituir el canal de potasio dependiente de voltaje prototipo de A. pernix (KvAP) en varios sistemas de membrana para estudios estructurales y funcionales 8-10. Los datos de otros y juntos mostraron que los lípidos son probablemente un factor determinante en los cambios conformacionales de la detección de voltajedominios de un canal de iones y de voltaje pueden dar forma a las estructuras de algunos de estos canales 11. En el siguiente, vamos a proporcionar una descripción detallada de los métodos y ofreceremos consejos técnicos críticos que probablemente aseguren el éxito de la reproducción de los resultados, así como la extensión de los métodos para los estudios de otras proteínas de membrana.

<table><tbody><tr><td>Triptona</td><td>RPI Corp.</td><td>T60060</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>RPI Corp.</td><td>Y20020</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>RPI Corp.</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecil-&#946;-D-Maltoside</td><td>Affymetrix</td><td>D322S</td><td></td></tr><tr><td>n-Octyl-&#946;-D-Glucósido </td><td>Affymetrix</td><td>O311</td><td>Aprotinina de grado anaico</td></tr><tr><td></td><td>RPI Corp.</td><td>A20550-0.05</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>RPI Corp.</td><td>L22035-0.025</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatina A</td><td>RPI Corp.</td><td>P30100-0.025</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>13407000</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Bead SM-2</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>RPI Corp.</td><td>H75030</td><td></td></tr><tr><td>POPE</td><td>Avanti Lípidos Polares</td><td>850757C</td><td></td></tr><tr><td>POPG</td><td>Avanti Lípidos Polares</td><td>840457C</td><td></td></tr><tr><td>PERROS</td><td>Avanti Lípidos Polares</td><td>870314C</td><td></td></tr><tr><td>DMPC </td><td>Avanti Lípidos Polares</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-DOPE </td><td>Avanti Lípidos Polares</td><td>870282C</td><td></td></tr><tr><td>DOTAP</td><td>Avanti Lípidos Polares</td><td>890890C</td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin perlas de agarosa </td><td>Piercenet</td><td>29200</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de diálisis</td><td>Spectrum Laboratories, Inc</td><td>132-570</td><td></td></tr><tr><td>Pentano</td><td>Fisher</td><td>R399-1</td><td></td></tr><tr><td>Decane</td><td>TCI America</td><td>D0011</td><td></td></tr><tr><td>MTS-PEG5000</td><td>Toronto Research Cemicals</td><td>M266501</td><td></td></tr></tbody></table>

la reconstitución de un canal kv en las membranas lipídicas de estudios estructurales y funcionales

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

Para estudiar la interacción lípido-proteína en una manera reduccionista, es necesario incorporar las proteínas de membrana en membranas de composición de lípidos bien definido. Estamos estudiando los efectos de compuerta lípido-dependientes de un canal de potasio dependiente de voltaje prototipo (Kv), y se han elaborado procedimientos detallados para reconstituir los canales en diferentes sistemas de membranas. Nuestros procedimientos de reconstitución toman consideración de tanto la fusión inducida por detergente de las vesículas y la fusión de proteína / detergente con las micelas lípido / detergente micelas mixtas, así como la importancia de alcanzar un equilibrio de distribución de los lípidos entre la proteína / detergente / lípido y el detergente / lípidos micelas mixtas. Nuestros datos sugieren que la inserción de los canales en las vesículas lipídicas es relativamente aleatoria en orientaciones, y la eficacia de reconstitución es tan alta que no hay agregados de proteínas detectables se observaron en experimentos de fraccionamiento. Hemos utilizado el reconstituird canales para determinar los estados conformacionales de los canales en diferentes lípidos, registrar las actividades eléctricas de un pequeño número de canales incorporados en bicapas lipídicas planas, pantalla para ligandos específicos de conformación de una biblioteca de fagos, y apoyar el crecimiento de cristales 2D de los canales en las membranas. Los procedimientos de reconstitución descritos aquí se pueden adaptar para el estudio de otras proteínas de membrana en bicapas lipídicas, especialmente para la investigación de los efectos sobre los lípidos en los canales iónicos dependientes de voltaje eucariotas.

El flujo general de los experimentos para la purificación de la canal en KvAP homogeneidad bioquímica se describe en la Figura 1A. Las muestras típicas durante la expresión y purificación de la proteína se mostraron en el gel de SDS-PAGE en la Figura 1B. La proteína después de la purificación IMAC es relativamente puro. El rendimiento de la canal KvAP es de aproximadamente 1,0 mg / litro de cultivo. La solubilización de las vesículas lipídicas con detergente...

Se describen procedimientos para la reconstitución completa de un canal de potasio dependiente de voltaje prototipo en las membranas lipídicas. Los canales reconstituidas son adecuadas para los ensayos bioquímicos, grabaciones eléctricas, detección ligando y estudios de cristalografía de electrones. Estos métodos pueden tener aplicaciones generales a los estudios estructurales y funcionales de otras proteínas de membrana.

La reconstitución de un canal Kv en las membranas lipídicas de Estudios estructurales y funcionales

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar una descripción detallada de las técnicas para el estudio funcional y estructural del efecto de los lípidos sobre las proteínas de membrana. Esto se logra primero mediante la expresión y purificación del canal de potasio activado por voltaje. El segundo paso consiste en la reconstrucción del canal iónico.A continuación, se realiza la grabación eléctrica de los canales iónicos en bicapas lipídicas para el estudio funcional de los canales iónicos. El paso final consiste en la cristalización de los canales iónicos en la membrana para la determinación de su estructura. En definitiva, se utilizan ensayos bioquímicos, el método electrofisiológico y el estudio de cristalografía electrónica para investigar los efectos de los lípidos sobre el movimiento del sensor de voltaje de los canales iónicos.Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a los muchos detalles técnicos en la reconstitución de proteínas y las grabaciones biológicas. Esperamos que este video les ayude a seguir todo el procedimiento y tener éxito. La demostración de todo el proceso será realizada por el Dr. Hui Jim de mi laboratorio.An

reconstitution-kv-channel-into-lipid-membranes-for-structural

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Investigación

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Biology

Biología

La reconstitución de proteínas de membrana funcionales en los liposomas gigantes de composición definida es un enfoque poderoso cuando se combina con la electrofisiología de patch-clamp. Sin embargo, la producción convencional de liposomas gigante puede ser incompatible con la estabilidad de la proteína. Se describen protocolos para producir liposomas gigantes de lípidos puros o pequeños liposomas que contienen canales iónicos.

Preparación de liposomas gigantes de la Imagen y Patch-Clamp Electrofisiología

La reconstitución de la proteína transmembrana, KvAP, en vesículas unilamelares gigantes (GUVs) se demostró por dos métodos de deshidratación-rehidratación - electroformation e inflamación gel asistida. En ambos métodos, pequeñas vesículas unilamelares que contienen la proteína se fusionan para formar GUVs que luego pueden ser estudiadas mediante microscopía de fluorescencia y la electrofisiología patch-clamp.

Reconstitución de una proteína transmembrana, el canal iónico dependiente de voltaje, KvAP, en Gigante vesículas unilamelares para Microscopía y Patch Clamp Estudios

Descrito aquí es un procedimiento rápido y eficaz para la reconstitución funcional de tipo silvestre purificado y proteína CFTR mutante que conserva la actividad de este canal de cloro, que es defectuoso en la fibrosis quística. Flujo de salida de yoduro de proteoliposomas reconstituidas mediadas por CFTR permite estudios de actividad de los canales y los efectos de las moléculas pequeñas.

Reconstitución funcional y la actividad del canal Las mediciones de Purificada Wildtype y mutante CFTR Proteína

Este artículo describe métodos específicos para obtener cantidades bioquímicas de detergente solubilizado TRPV1 para análisis espectroscópico. Los protocolos combinados proporcionan herramientas bioquímicas y biofísicas que se pueden adaptar para facilitar los estudios estructurales y funcionales de canales del ion mamíferos en un ambiente controlado por membrana.

Purificación y reconstitución de TRPV1 para análisis espectroscópico

Este protocolo describe las técnicas utilizadas para determinar las estructuras de canal de iones por microscopia del cryo-electrón, incluyendo un sistema de baculovirus para expresar eficientemente genes en células de mamíferos con el mínimo esfuerzo y toxicidad, extracción de proteínas, purificación, y comprobación de la calidad, preparación de la red muestra y proyección, así como recopilación de datos y procesamiento.

Expresión y purificación de los humanos sensibles a lípido catiónico canal TRPC3 para la determinación estructural por microscopia del Cryo-electrón de solo-partícula

En este manuscrito, demostramos las técnicas experimentales para encapsular el citoesqueleto de actina F en vesículas lipídicas unilamelares gigantes (también llamadas liposomas), y el método para formar una capa de actina F que imita la corteza en la valva interna de la membrana liposómica.

In vitro Reconstitución del citoesqueleto de actina dentro de vesículas unilamelares gigantes

La reconstitución libre de células ha sido una herramienta clave para comprender el ensamblaje del citoesqueleto, y el trabajo en la última década ha establecido enfoques para estudiar la dinámica de la septina en sistemas mínimos. Aquí se presentan tres métodos complementarios para observar el ensamblaje de la septina en diferentes contextos de membrana: bicapas planas, soportes esféricos y soportes de varilla.

Reconstitución del ensamblaje de septina en membranas para estudiar propiedades y funciones biofísicas

Aquí se describe el procedimiento aplicado en el Grupo de Biología de Membrana Caffrey estructurales y funcionales para establecer manualmente ensayos de cristalización de proteínas de la membrana lipídica en mesofases.

Cristalización de las proteínas de membrana para la Determinación de la estructura con mesofases lipídico

La evaluación de dos dimensiones (2D) ensayos de cristalización para la formación de matrices de orden de proteínas de membrana es una tarea muy difícil y crítica de la cristalografía de electrones. A continuación se describe el enfoque en la detección e identificación de cristales 2D de proteínas de la membrana en su mayoría pequeñas en el rango de 15 - 90kDa.

La evaluación de dos dimensiones ensayos de cristalización de proteínas de membrana pequeña de Estudios de Biología Estructural de Cristalografía de electrones

Vamos a demostrar la forma de estudiar el efecto de un único punto de mutación en la función de un canal iónico.

Mutagénesis y análisis funcional de los canales iónicos heteróloga se expresa en células de mamífero

Aprenda a reconstituir canales de potasio en membranas lipídicas para estudios estructurales y funcionales. Este método permite análisis bioquímicos, registros eléctricos y cristalografía electrónica de proteínas de membrana.

La reconstitución de un canal Kv en las membranas lipídicas de Estudios estructurales y funcionales

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