Whole Cell Patch Clamp para investigar los mecanismos de la Estimulación Neural infrarrojos

El objetivo general del siguiente experimento es producir un sistema modelo para estudiar los efectos de la iluminación láser infrarroja en las neuronas auditivas in vitro. Esto se logra mediante la fijación de parches, cultivando neuronas auditivas en toda la configuración celular para explorar sus características eléctricas. Posteriormente, la exposición de las neuronas a la irradiación láser puede provocar respuestas eléctricas en la célula expuesta, que se pueden medir con una configuración de pinza de parche.

A continuación, se pueden variar los parámetros de iluminación y las variables ambientales para observar sus efectos en las respuestas eléctricas inducidas por el láser. Las neuronas auditivas expuestas a la luz láser exhibirán una actividad eléctrica repetible en respuesta a cada pulso láser para su posterior análisis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre los mecanismos que subyacen a la estimulación infrarroja de las neuronas ganglionares espirales.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la estimulación infrarroja de las células ganglionares espirales específicamente, también se puede extender a otros tipos de células o modelos simplificados como las bicapas lipídicas para dilucidar aún más los procesos físicos involucrados. La demostración visual de este método es importante para garantizar un posicionamiento preciso de la fibra óptica de entrega de luz, ya que la exposición a la radiación resultante es un parámetro crítico. Se pueden extraer de vidrio de silicato prestado con un extractor láser de CO2.

Prepare el láser acoplado a fibra. Una amplia gama de fibra óptica funcionará. El corte de una fibra en una configuración de cable de conexión con conectores FCPC por la mitad produce dos enlaces de fibra con un conector en un extremo y fibra expuesta en el otro extremo.

Estas son las coletas. Prepare la punta del oso de una coleta quitando la cubierta de fibra, limpiando con etanol y cortando con una herramienta adecuada bajo un microscopio. Compruebe que la punta esté perpendicular al eje de la fibra y que parezca plana.

Conecte el otro extremo del cable flexible de fibra a la salida del láser de estimulación mediante un conector pasante adecuado si es necesario. En este punto, asegúrese siempre de medir la potencia del láser de salida de la fibra. Hazlo también después de cualquier otra manipulación de la propina.

Ahora inserte la fibra en un mandril y fije el mandril al microposicionador apropiado. A continuación, determine el ángulo que forma la fibra óptica con un cubreobjetos. Tome una fotografía de la disposición y calcule el ángulo usando la imagen J.Ahora, asegure las conexiones que sincronizan el láser con el sistema de adquisición de datos de la abrazadera de parche.

La salida digital del sistema de adquisición de datos de la pinza de parche debe conectarse al láser a través de un generador de funciones externo, lo que permite especificar los parámetros del pulso láser independientemente del sistema de adquisición de datos, la señal utilizada para activar el láser debe conectarse nuevamente a una entrada del sistema de adquisición de datos para garantizar que la temporización y la duración de los impulsos láser se puedan registrar simultáneamente con la señal electrofisiológica, Ajuste el caudal del sistema de perfusión entre uno y dos mililitros por minuto. Un sistema alimentado por gravedad con un calentador en línea para un calentamiento rápido de la solución y una bomba peristáltica para eliminar la solución gastada por succión funcionará. Pozo. Coloque un cubreobjetos con células cultivadas en la cámara de registro de un microscopio vertical utilizando un objetivo de inmersión en agua de alto aumento y contraste de fase, localice una neurona ganglionar espiral.

Una neurona ganglionar espiral típica tiene fases, es brillante, redonda y tiene aproximadamente 15 micras de diámetro con un núcleo prominente. Una vez que se haya localizado una neurona adecuada, cambie a un objetivo de aumento más bajo y localice la neurona objetivo. A continuación, utilice el microposicionador para mover la fibra óptica hasta que la punta esté cerca de la neurona objetivo tanto en el plano horizontal como en el vertical.

Vuelva al objetivo de gran aumento y coloque la punta de la fibra óptica en su posición prevista junto a la neurona. Al ajustar la posición vertical de la fibra, es importante que el borde inferior de la fibra descanse sobre el labio de la cubierta. Para minimizar la incertidumbre en la ubicación de la fibra, el punto de contacto se puede identificar a partir de señales visuales en la imagen del microscopio.

Una vez que la fibra esté en posición, muévala hacia afuera en una cantidad conocida a lo largo de su eje longitudinal para no afectar el posicionamiento de la micropipeta. La micropipeta debe llenarse con solución intracelular y colocarse de forma segura en la etapa principal del amplificador. Usando un tubo conectado al costado del soporte de microelectrodos, aplique una pequeña cantidad de presión positiva para evitar la obstrucción de la micropipeta.

Con un manipulador de microm, mueva la micropipeta a su posición justo encima de la neurona objetivo y proceda a hacer un sello de giga ohmios. Realice un registro de la resistencia en serie de capacitancia de membrana y la resistencia de entrada determinada a partir de la curva exponencial ajustada a la corriente. Durante el pulso de prueba de sellado.

Minimice el transitorio de capacitancia ajustando los controles CP rápido y CP lento en el amplificador. A continuación, cambie el amplificador al modo de celda completa y modifique la capacitancia y la compensación de resistencia hasta que se observe una corriente plana durante la prueba SEAL. A continuación, aplique la compensación de resistencia en serie con aproximadamente 70% de corrección, 70% de predicción, ajustando los controles de capacitancia y compensación de resistencia para mantener una respuesta de sello de prueba plana.

A continuación, cambie el amplificador al modo de pinza amperimétrica. Tenga en cuenta el potencial de membrana en reposo en ausencia de inyección de corriente. Ahora configure una corriente de retención para estabilizar el potencial de membrana en el nivel deseado.

Neutralice la capacitancia de la pipeta y ajuste el equilibrio del puente para equilibrar la caída de voltaje. Compruebe las propiedades de disparo de la neurona estimulando con corriente despolarizante. En este punto, mueva la fibra óptica a su posición junto a la neurona utilizando un software de imágenes acoplado a una cámara CCD para capturar imágenes enfocadas en el plano de la neurona inicialmente y luego enfocadas en el borde superior de la fibra óptica.

Analice las imágenes para determinar el valor delta, que es la posición del borde superior de la fibra óptica en relación con el centro de la neurona objetivo. Es muy importante conocer con precisión la posición de la fibra óptica. Esto se debe a que la energía por unidad, área o exposición a la radiación entregada a la célula objetivo es un parámetro crítico para la estimulación neuronal infrarroja, y esto puede verse afectado significativamente por la posición de la fibra en relación con la célula.

La potencia óptica de este láser se controla por computadora a través de una entrada directa al láser y se puede especificar manualmente antes de cada grabación. La longitud del pulso y la tasa de repetición se pueden controlar a través del generador de funciones como se describió anteriormente, asegúrese de que los datos se registren tanto desde el canal de fijación de parche como desde el canal de disparo láser de medio a 15 milisegundos pulsos láser de 0.25 a cinco. Los milijulios suelen producir respuestas eléctricas medibles. Inicialmente.

Puede ser útil establecer la tasa de repetición de los pulsos láser en un hercio o menos para minimizar los efectos indeseables. Una vez que se hayan configurado todos los parámetros del láser. Proceda con la recopilación de datos.

Las neuronas ganglionares espirales responden a la iluminación láser con formas de onda repetibles tanto en configuraciones de grabación de pinza de voltaje como de pinza de corriente en respuesta a pulsos láser de 2,5 milisegundos y 0,8 milijulios. Una celda típica produce una corriente interna neta a varios potenciales de retención. Los registros de pinza amperimétrica muestran una despolarización constante de la membrana en el transcurso de estos pulsos láser, seguida de una disminución aproximadamente exponencial hacia el potencial de membrana en reposo después del pulso.

En algunos casos, también hay una pequeña despolarización adicional de la membrana después del pulso láser. La iluminación con energía excesiva o la exposición a grandes aumentos de temperatura pueden provocar daños celulares observados a través del deterioro de las propiedades eléctricas de la célula o la muerte celular instantánea. Siguiendo este procedimiento, se pueden variar una serie de parámetros ambientales, como la temperatura de la solución o los factores químicos, para probar el efecto de estos en la actividad eléctrica inducida por el láser.

No olvide que trabajar con láseres puede ser peligroso y se deben tomar precauciones de seguridad estándar. Estos incluyen el uso de gafas de seguridad láser, señales de advertencia y asegurarse de que el rayo no se cruce involuntariamente con ninguna superficie altamente reflectante.