Name: Whole Cell Patch Clamp para investigar los mecanismos de la Estimulación Neural infrarrojos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Aprende a usar el método de patch clamp de célula completa para investigar la estimulación neural infrarroja en neuronas auditivas primarias. Esta técnica permite analizar las respuestas eléctricas y avanzar en terapias del sistema auditivo.

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Este trabajo fue financiado por el Consejo Australiano de Investigación bajo Vinculación del proyecto de subvención LP120100264.

1. Cultura de las neuronas del ganglio espiral <ol><li> Esterilizar pequeñas y redondas (por ejemplo, 10 mm de diámetro) cubreobjetos de vidrio y pinzas curvas en un autoclave. Transfiera los portaobjetos esterilizados en pocillos individuales de una 4-anillo de 35 mm placa de Petri estéril o placa de 4 pocillos, utilizando las pinzas esterilizadas. Aplicar 150 l de poli-L-ornitina (500 mg / ml) y laminina de ratón (0,01 mg / ml) a la superficie superior del cubreobjetos y colocar en una incubadora (37 ° C) durante un máximo de 48 h. Asegúrese de que los cubreobjetos no flotan lejos de la parte inferior del pozo. </li><li> Preparar ml de medio Neurobasal estériles (NBM) 50 para cada cultivo neuronal: 47,5 ml neurobasal A, 0,5 ml de N 2 suplemento, 1 ml de suplemento B27, 0,5 ml de L-glutamina, y 0,5 ml de penicilina-estreptomicina. Nota: Los suplementos pueden ser congelados, almacenados a -20 ° C y se añaden a los medios de comunicación en el día requerido. </li><li> Disociar las neuronas del ganglio espiral de post-natales días 4-7 crías de rata como se describió previamente 20,21, nosción tanto enzimática (0,025% de tripsina y 0,001% de DNasa I) y las técnicas mecánicas. Consulte. Whitlon et al 22 y Vieira et al. 23 para los procedimientos detallados de la cultura ganglio espiral neurona, o Parker et al. 24 para una demostración de aislamiento modiolus. </li><li> Aspirar cualquier solución poly-L-ornithine/laminin restante de los cubreobjetos y se lava brevemente con NBM. </li><li> Añadir 150-200 l de la suspensión de las neuronas del ganglio espiral disociado a los cubreobjetos y colocar en una incubadora (37 ° C, 10% de CO 2). Nota: hasta 20 cubreobjetos se pueden preparar a partir de una camada media de 8 crías de rata. </li><li> Cuatro horas después de las neuronas de chapado, aspirar la solución para eliminar restos de células y reemplazar con 150-200 l calentada NBM fresco. Nota: Los medios pueden requerir la reposición diaria para evitar la deshidratación. </li><li> Cubreobjetos Volver a la incubadora hasta que sea necesario para los registros electrofisiológicos. Nota: Espiral disociadocultivos de neuronas ganglionares se pueden utilizar para los experimentos electrofisiológicos cuatro horas después de la disociación y de hasta dos días a partir de entonces. Tiempo in vitro se debe tomar en cuenta durante el análisis de los resultados. Reponer NBM cada 24 a 48 horas. </li></ol> 2. Preparación para el Patch clamp grabaciones <ol><li> Preparar soluciones <ol><li> Intracelular (micropipeta) solución: 115 mM de K-gluconato, 7 mM de KCl, 10 mM de HEPES, 0,05 mM de EGTA, 2 mM de Na 2 ATP, 2 mM de MgATP, 0.5 mM de Na 2 GTP (ajustar el pH a 7,3 con KOH; ajustar a 295 mOsmol / kg con sacarosa). Pasar la solución a través de un filtro estéril (0,2 micras) y se dividen en 200 ml de alícuotas a ser almacenado a -20 ° C hasta el día de la grabación. </li><li> Extracelular (baño) solución: 137 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM de HEPES, 10 mM de glucosa (ajustar a pH 7,4 con NaOH; ajustar a 300-310 mOsm / kg con sacarosa) . Esta solución se hizo en el día de la grabación. </li></ol></li><li> Preparar grabación micropipetas con una resistencia de 2-6 mW. Utilizamos un láser de CO2 extractor (P-2000, Instrumentos de Sutter) y vidrio de borosilicato (diámetro exterior de 1,0 mm, 0,58 mm de diámetro interior, 75 mm de longitud). </li><li> Preparar el láser. Este protocolo está diseñado para su uso con un láser de fibra de acoplamiento, tales como la 1870 nm infrarrojo estimulador del nervio de Optotech P / L. La fibra óptica se utiliza para la entrega de la luz en nuestros experimentos es una fibra de sílice diámetro del núcleo / revestimiento de 200/220 micras con una apertura numérica de 0.22 y conectores FC-PC en ambos extremos (AFW Tecnologías MM1-FC2-200/220-5-C -0.22). Los cables de conexión se cortaron por la mitad para producir dos trenzas de fibra (es decir, conectorizado en un extremo y se escindió en el otro). Los efectos de diámetro de núcleo de la fibra y la apertura numérica de los cambios de temperatura inducidas por láser se han discutido en detalle por Thompson et al. 25 <ol><li> Cleave la punta de la fibra de distribución de luz usando técnicas estándary asegúrese de que la punta resultante es de alta calidad mediante la observación con un microscopio óptico (es decir, la punta debe ser perpendicular al eje de la fibra plana y aparecerá la inspección visual). Conecte el suministro de luz de fibra a la producción de fibra de acoplamiento del láser estimulación mediante un apropiado a través del conector (por ejemplo Thorlabs ADAFC2). </li><li> Medir la potencia del láser de salida de la punta escindido de la fibra de suministro de luz usando un instrumento apropiado (por ejemplo FieldMate coherente con LM-3 cabezal detector). Se recomienda comprobar la potencia del láser cada vez que la fibra de distribución de luz se corta o se hace un ajuste significativo al láser (por ejemplo, el transporte de un laboratorio a otro). </li><li> Inserte la fibra de suministro de luz en una tirada de fibra o dispositivo equivalente y colocar el plato a la microposicionador apropiado. Es importante ser capaz de determinar con precisión el ángulo θ que la fibra óptica hace con el cubreobjetos. Esta espe se puede medir tomando una fotografía de la disposición experimental y el uso de software de procesamiento de imágenes (por ejemplo, ImageJ) para obtener el ángulo. El ángulo θ (o gama de posibles ángulos) está limitada principalmente por las limitaciones espaciales de la disposición experimental - en particular, el microscopio. Los valores típicos de θ en nuestros experimentos (sobre la base de un microscopio vertical) son alrededor de 36 °, sin embargo, el ángulo óptimo puede diferir significativamente de las configuraciones alternativas (por ejemplo, los que utilizan un microscopio invertido). </li><li> Haga las conexiones entre el láser y el sistema de adquisición de datos de patch clamp (por ejemplo Digidata 1440A, Molecular Devices) como se muestra en la Figura 2. La salida digital del sistema de adquisición de datos de patch clamp se debe conectar al láser a través de un generador de función externa, por lo que es posible especificar los parámetros del pulso láser independientes del sistema de adquisición de datos. Alternativamente, esta salida se puede conectar directamente ael controlador de láser (que requiere la longitud del impulso y la tasa de repetición para ser fijados por el software de adquisición de datos). En cualquier caso, la señal utilizada para disparar el láser debe ser conectado de nuevo a una entrada del sistema de adquisición de datos para asegurar que el momento y la duración de los pulsos de láser se pueden grabar simultáneamente con la señal electrofisiológica. </li></ol></li></ol> 3. Patch clamp grabaciones para la Investigación de los INS <ol><li> Llenar el recipiente apropiado del sistema de perfusión con solución extracelular y ajustar la velocidad de flujo para proporcionar la perfusión del baño a una velocidad de 1-2 ml / min. Nosotros utilizamos un sistema de alimentación por gravedad (botella del aspirador, válvula de pinza, y el tubo de PE) con un calentador en línea para permitir el rápido calentamiento de la solución, y una bomba peristáltica para eliminar la solución pasó por succión. </li><li> Coloque un cubreobjetos con las células cultivadas en la cámara de grabación (baño) de un microscopio vertical. Con un objetivo de inmersión en agua de gran aumento (e. G. 40X) y de contraste de fase (por ejemplo contraste diferencial de interferencia o contraste gradiente Dodt), localizar visualmente las neuronas del ganglio espiral dentro de la cultura. Una neurona típica ganglio espiral es fase-brillante, redondo y aproximadamente 15 micras de diámetro con un núcleo prominente, como se muestra en la Figura 1a. </li><li> Una vez que una neurona ha sido localizado, cambiar a un objetivo de aumento menor (por ejemplo, 10 veces) y localizar la neurona diana dentro del campo visual. </li><li> Mueva el suministro de luz de fibra óptica en su posición mediante el siguiente procedimiento (o equivalente): <ol><li> Utilice el microposicionador para mover la fibra de salida hasta que la punta está cerca de la neurona diana en los planos horizontal y vertical. La posición vertical de la punta de la fibra puede ser verificada mediante mover el objetivo arriba y hacia abajo (el enfoque de exploración). </li><li> Cambie de nuevo con el objetivo de gran aumento y la posición de la punta de la fibra óptica en su posición prevista al lado de tque las neuronas (véase la Figura 2 recuadro). Al ajustar la posición vertical de la fibra, es importante que el borde inferior de la fibra está en reposo en (es decir, sólo tocar) el cubreobjetos, para minimizar la incertidumbre en la ubicación de la fibra. La alineación óptima en el plano horizontal dependerá del ángulo θ que la fibra hace con el cubreobjetos y el radio r de la fibra. Con el fin de posicionar la fibra de modo que el centro de la neurona diana se encuentra a lo largo del eje de la fibra, la distancia horizontal entre el borde superior de la fibra y la célula diana debe ser Δ target = r (cosec θ - 2 sen θ), donde los valores negativos indicarían que los voladizos de fibra óptica de la célula. Cuando la alineación de la fibra, una distancia de objetivo Δ entre el borde superior de la fibra y el centro de la neurona se puede lograr aproximadamente por inspección visual. Sin embargo Δ objetivo está diseñado parasólo sirven como una guía aproximada. Colocación de la fibra de tal manera que la distancia real de Δ entre el borde superior de la fibra y el centro de la neurona difiere considerablemente de Δ objetivo (como en la figura 1) puede proporcionar información sobre el efecto de tanto desplazamiento radial (es decir, desde el centro de la haz) y el desplazamiento axial (es decir, a lo largo del eje de la fibra) de la viga con relación a la neurona diana. Por ejemplo, el establecimiento de Δ se esperaría ≈ 0 para aumentar la temperatura local en las proximidades de la célula - es decir, desde el perfil del haz de fibras multimodo típicos se aproxima bien por una distribución de sombrero de copa 26, la disminución de la energía absorbida a nivel local (temperatura) debido al desplazamiento del centro del haz es mínima en comparación con el aumento de la energía absorbida de mover la cara de extremo de la fibra más cerca de la célula. Si bien se debe tener cuidado para posicionar la fibra con la mayor precisión y repetidamente como possible usando señales visuales, la medición precisa de la ubicación de la fibra respecto al objetivo de neurona (por ejemplo, Δ) es de mayor importancia que posicionándolo a una distancia predeterminada. Δ se puede determinar (estimando una incertidumbre máxima de ± 3 m) por análisis de imagen como se describe en el paso 3.8.2 del protocolo. En algunos experimentos 5,8, fuentes de luz blanca se han acoplado a través de la fibra con el fin de apuntar a la celda deseada. Se encontró que este enfoque a ser ineficaz en la configuración de microscopio vertical, como la intensidad de la luz dispersada desde la región diana fue relativamente baja en estos ángulos poco profundas (θ). </li><li> Una vez que la fibra está en la posición, moverlo a cabo por una cantidad conocida para permitir el posicionamiento directo de la micropipeta. La fibra puede entonces ser devuelto a la posición original cuando se consigue una grabación neuronal. </li></ol></li><li> Llene la micropipeta con solución intracelular y en forma segura en su lugar en la cabezataje del amplificador (por ejemplo MultiClamp 700B, Molecular Devices). Uso de tubo conectado a un lado del soporte de microelectrodo, aplicar una pequeña cantidad de presión positiva para evitar la obstrucción de la micropipeta. </li><li> El uso de un micromanipulador, mueva la micropipeta en posición justo por encima de la neurona diana. </li><li> Protocolo para las grabaciones de células enteras: <ol><li> Aplicar a 10 ms, 10 mV impulso rectangular (por ejemplo, prueba de Seal) en el modo de fijación de voltaje del amplificador y ajuste el potencial micropipeta (pipeta de desplazamiento) de la señal de referencia a 0 nA. El ensayo de sellado también se debe utilizar para determinar si la resistencia del microelectrodo es dentro del intervalo deseado (por ejemplo, 2 - 6 mW). </li><li> Mientras que el control de la resistencia, utilizar ajustes finos de la micromanipulador para posicionar suavemente la micropipeta sobre la superficie de la neurona diana. Cuando la micropipeta está en contacto con la neurona, la resistencia aumentará (por ~ 0,5 a 1 mW). Yommediately tras el aumento de la resistencia, eliminar la presión del fluido positivo y aplicar una pequeña presión negativa. Una vez que la resistencia ha pasado 10 a 20 mW, fijar el potencial de membrana a un nivel de mantenimiento (por ejemplo, alrededor de -60 mV). </li><li> La resistencia del electrodo debería seguir aumentando hasta que excede 1 GΩ, lo que significa que un sello efectivo (denominado &#39;gigaseal&#39;) se ha formado entre la membrana celular y la micropipeta. En este punto, eliminar toda la presión de fluido de la micropipeta. </li><li> Una vez se ha formado la gigaseal, usar pulsos cortos de corriente (25 a 100 microsegundos; 1 V) o breves pulsos de presión de fluido negativa a la ruptura de la membrana celular y lograr la configuración de células enteras. </li><li> Registre la capacitancia de la membrana, la resistencia en serie y la resistencia de entrada como se determina a partir de la curva exponencial ajustada a la corriente durante el pulso de ensayo de sellado. Minimizar los transitorios de capacidad mediante el ajuste de los controles CpFast y CpSlow en el amplificador, entonces switcse observa h el amplificador en el modo de célula completa, y compensar la capacitancia y la resistencia hasta que una corriente plana durante el ensayo de sellado. Aplicar compensación de resistencia en serie (corrección ~ 70%; 70% de predicción), ajustar los controles de la capacitancia y la resistencia para mantener un sello de prueba de respuesta plana. </li><li> Cambie al modo de corriente-clamp en el amplificador. Tomar nota del potencial de membrana en reposo (en ausencia de inyección de corriente). Establecer una corriente de retención para estabilizar el potencial de la membrana en el nivel deseado (por ejemplo, -60 mV). Neutralizar la capacitancia pipeta y ajustar el balance de puente para equilibrar la caída de tensión. </li><li> Compruebe las propiedades de disparo de la neurona mediante la estimulación con corriente despolarizante (10 a 200 pA pA en 10 pasos, 300 ms de duración). </li></ol></li><li><ol><li> Mueva la fibra óptica de nuevo en su posición al lado de la neurona. Usando software de imágenes acoplado a una cámara CCD, la captura de imágenes de la posición de la fibra con respecto a la neuro objetivon, centrándose en el plano de la neurona inicialmente, y luego en el borde superior de la fibra óptica (véase la Figura 1). </li><li> Por el posterior análisis de las imágenes resultantes (por ejemplo, Figuras 1b y 1c) es posible determinar con precisión Δ (la posición del borde superior de la fibra óptica con respecto al centro de la neurona diana). Una vez Δ se conoce, parámetros tales como la distancia desde la cara de extremo de la fibra a la neurona diana (a lo largo del eje de la fibra) z y el desplazamiento radial de la neurona desde el centro de la viga δ r se pueden calcular utilizando las relaciones trigonométricas simples: z = r sen 2θ + Δ cos θ δ = r ((r cos 2θ - Δ pecado θ) 2 + Dy 2) 1/2, donde Dy es la distancia entre el eje de la fibra y el centro de la neurona como se ve desde arriba (por ejemplo, SEe Figura 1). El análisis debe tener en cuenta las variaciones de posición de celda en celda, como un conocimiento preciso de estos parámetros de ubicación puede ser requerida para resolver las posibles diferencias entre los procesos de estimulación 25. </li></ol></li></ol> 4. Experimentos INS <ol><li> Durante la grabación de los datos electrofisiológicos en cualquiera de pinza de corriente o configuraciones de fijación de voltaje, ejecute el láser de estimulación a los parámetros deseados (por ejemplo, la energía, la duración del pulso, frecuencia de repetición, etc.) Con nuestro láser, la potencia óptica se controla a través de una entrada directa para el controlador de láser y se especifica manualmente antes de cada grabación. Duración de impulso y frecuencia de repetición pueden ser controladas por cualquiera de un generador de señal externa o el software de adquisición de datos (como se describe en el paso 2.3.4). Asegúrese de que los datos se graban tanto el canal de patch clamp y el canal de disparo láser. </li></ol> Pulsos láser con longitudes que vandesde alrededor de 500 microsegundos a 15 ms y las energías de ~ 0,25 a 5 J por impulso normalmente producir respuestas eléctricas mensurables. Ajuste de la frecuencia de repetición de pulsos de láser a ser de 1 Hz o menos puede ser útil para los experimentos iniciales, ya que reducirá al mínimo los efectos de este parámetro. Los resultados típicos que muestran el cambio en la señal grabada se presentan en la siguiente sección.

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<li>Snyder, A. W., Love, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSnyder%2C+AW+%22Optical+Waveguide+Theory%22">Optical Waveguide Theory</a>. , Chapman and Hall. (1983).</li>
<li>Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+the+temporal+effects+of+heating+during+infrared+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation.</a> J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).</li>
<li>Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+temperature+jump+by+infrared+diode+laser+irradiation+for+patch-clamp+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies.</a> Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Usando los protocolos descritos en este documento, es posible extraer y cultura neuronas del ganglio espiral y para investigar laser-evocó actividad eléctrica mediante la realización de experimentos de patch clamp de células enteras. Cuando se usa in vitro, la técnica de patch clamp proporciona un nivel de control sobre los parámetros experimentales que no es alcanzable in vivo. Parámetros de estimulación láser, tales como longitud de onda, energía de pulso, duración del pulso, forma del pulso, y las s...

Los campos de la neurofisiología y médica biónica dependen en gran medida en las técnicas que permiten la estimulación controlable de respuestas eléctricas en el tejido neural. Mientras que la estimulación eléctrica sigue siendo el estándar de oro en la excitación neuronal, que adolece de una serie de inconvenientes tales como la presencia de artefactos de estimulación cuando se graban las respuestas neurales, y la falta de especificidad de la estimulación debido a la propagación de la corriente en el tejido circundante 1. Las últimas dos décadas han visto el desarrollo de técnicas de estimulación mediada ópticamente 2. Varias de estas técnicas requieren la modificación del tejido diana, ya sea a través de la adición de una molécula en particular (por ejemplo, moléculas de jaula) 3 o alguna forma de manipulación genética (por ejemplo, la optogenética) 4, ninguno de los cuales son fáciles de aplicar fuera de un contexto de investigación. De particular interés, por tanto, la estimulación neural infrarrojos (INS), whereby tejido nervioso se excita con luz láser infrarroja pulsada. INS tiene el potencial de superar muchas de las deficiencias de la estimulación eléctrica, permitiendo altamente específica, la estimulación sin contacto de tejido neural 2. Sin embargo, mientras que el INS se ha demostrado con éxito en una variedad de ajustes in vivo, el mecanismo preciso de la excitación sigue siendo incierto. Algunas publicaciones recientes han mostrado un progreso hacia el descubrimiento del mecanismo detrás de INS 5-7. Calentamiento rápido debido a la absorción de la luz láser por el agua parece jugar un papel clave. Sin embargo, más allá de este consenso aún no se ha alcanzado. Shapiro et al. 7 proponen un mecanismo muy general según el cual el calentamiento rápido hace que una perturbación en la distribución de partículas cargadas adyacentes a la membrana celular, que conduce a un cambio en la capacitancia de la membrana celular y la posterior despolarización. Además, Albert et al. 5 afirman que lasecalefacción inducida r activa una clase específica de temperatura canales iónicos sensibles (receptor de potencial transitorio canales vaniloide), permitiendo que los iones pasen a través de la membrana celular. En esta etapa no está claro cómo se combinan estos mecanismos, o incluso si hay otros factores que aún no se han identificado. Aunque un pequeño número de publicaciones (referencias 5,7-9) han investigado INS in vitro, la gran mayoría de los trabajos publicados en este campo se ha llevado a cabo in vivo (por ejemplo, referencias 1,6,10-18). Estimulación de las neuronas auditivas infrarrojos ha sido un área de particular interés, debido a las potenciales aplicaciones en implantes cocleares 10,14-18. Mientras que en experimentos in vivo son importantes para verificar la eficacia de la técnica en diversos entornos, el aumento del nivel de control proporcionado por los estudios in vitro se espera que conduzca a una comprensión más detallada del mecanismonismo responsable de INS. Este informe describe la preparación de cultivos de neuronas del ganglio espiral para las investigaciones de patch clamp, ya que estos pueden ser utilizados para estudiar los mecanismos fundamentales mientras que también une a la gran cantidad de datos existentes en el sistema auditivo. La técnica de patch clamp es una excelente herramienta para la investigación de los fenómenos electrofisiológicos, proporcionando un medio de registro de la actividad eléctrica en las células individuales y el estudio de la contribución de las corrientes subyacentes individuales 19. Cuando esta técnica se aplica a un establo en la preparación in vitro de neuronas primarias, como las neuronas del ganglio espiral cultivadas, ofrece la oportunidad de estudiar en profundidad los mecanismos por los que la actividad neuronal es controlada y manipulada. Los protocolos especificados en este trabajo se resumen los métodos para investigar el efecto de la estimulación con láser en las propiedades eléctricas de las neuronas del ganglio espiral a través de patch clampgrabaciones. El enfoque se basa en un láser de fibra de acoplamiento en lugar de un láser en el espacio libre, que permite un funcionamiento más seguro, así como más fácil y más repetible alineación sin la necesidad de modificar la configuración de microscopio estándar. Sobre la base de estos protocolos, debería ser posible llevar a cabo una amplia gama de experimentos con el fin de determinar más claramente el mecanismo o los mecanismos detrás de INS.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materiales y equipos de cultivo celular</fuerte> </td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio</td><td>Lomb Scientific</td><td>CSC 10 1 GP</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular de 4 anillos </td><td>VWR International</td><td>82050-542</td><td></td></tr><tr><td>Solución de poli-L-ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Curvo pinza</td><td>WPI</td><td>14101</td><td>Pinzas Dumont #5 (punta de ángulo de 45&grados)</td></tr><tr><td>CO2 Incubadora</td><td>ThermoScientific</td><td>Heracell 150i</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Mesa 1. Materiales y equipos de cultivo celular.</td></tr><tr><td colspan="4">Medios neurobasales</td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>N-2 suplemento</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento sin suero</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td><solución intracelular fuerte></cloruro ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>D-gluconato de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>NaGTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio</td><td>LabServ</td><td>BSPPL738.500</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Solución extracelular</fuerte> </td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>310166</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>383147</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>LabServ</td><td>BSPSL740.500</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabla 2. Soluciones para cultivo celular y patch clamp.</fuerte> a) Medios neurobasales. b) Solución intracelular. c) Solución extracelular.</td></tr><tr><td>Microscopio vertical</td><td>Zeiss</td><td>AxioExaminerD1</td><td>Equipado con contraste Dodt </td></tr><tr><td>Objetivo de inmersión en agua</td><td>Zeiss</td><td>W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma y platina X-Y </td><td>ThorLabs</td><td>Burleigh Gibraltar</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de grabación</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td><td></td></tr><tr><td>Mesa de aislamiento de vibraciones</td><td>TMC</td><td>Micro-g 63-532</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos de diagnóstico</td> de <td>la cámara CCD</td><td>RT1200</td><td></td></tr><tr><td>Software de la cámara</td><td>Instrumentos de diagnóstico</td><td>SPOT</td> Básico <td></td></tr><tr><td>Calentador de solución en línea</td><td>Warner</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Warner</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de pinza de parche</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de parche sistema de adquisición de datos</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-325</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio de micropipeta</td><td>Sutter Instruments</td><td>GBF100-58-15</td><td>Vidrio de borosilicato con filamento</td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Sutter Instruments</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>Software de grabación</td><td>AxoGraph</td><td></td><td>Lab pack y herramientas de electrofisiología</td></tr><tr><td>Frasco aspirador</td><td>Sigma-Aldrich CLS12201L</td><td></td><td>1 L Botella aspiradora Pyrex, con salida para tubos</td></tr><tr><td>Tubo de PE</td><td>Bomba</td> peristáltica Harvard <td>PolyE #340</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-07554-85</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Table 3.Equipo de pinza de parche.diodo láser </td></tr><tr><td>1.870 nm</td><td>Optotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200/220 y mu; latiguillo de fibra óptica multimodo de diámetro m (FC/PC)</td><td>AFW Technologies</td><td>MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 Suministro de</td><td>luz fibra óptica, núcleo de sílice y revestimiento, 0,22 NA</td></tr><tr><td>Fibra óptica a través del conector (FC/PC)</td><td>Thorlabs</td><td>ADAFC2</td><td></td></tr><tr><td>Cortadora de fibra óptica</td><td>EREM</td><td>FO1</td><td></td></tr><tr><td>Herramienta de pelado de fibra óptica (0,25 - 0,6 mm) </td><td>Siemens</td> Para quitar la cubierta de <td></td><td>fibra óptica</td></tr><tr><td>Herramienta de pelado de fibra óptica (0,6 - 1,0 mm)</td><td>Siemens</td><td></td><td>Para quitar el revestimiento exterior del cable de conexión</td></tr><tr><td>Generador</td><td></td><td></td><td>de señales Cualquier generador de señales que pueda emitir las formas de pulso necesarias y que pueda ser activado externamente</td></tr><tr><td>Posicionador de fibra óptica Posicionador</td><td></td><td></td><td>hecho a medida. Podría sustituirse con el microposicionador estándar utilizado para experimentos de pinza de parche</td></tr><tr><td>Mandril de fibra óptica</td><td>Newport</td><td>FPH-DJ</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de potencia láser y cabezal detector</td><td>FieldMate coherente</td><td>(medidor de potencia) con LM-3 (cabezal detector)</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabla 4. Equipo láser.</fuerte></td></tr></tbody></table>

whole cell patch clamp para investigar los mecanismos de la estimulación neural infrarrojos

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Se ha demostrado en los últimos años que la luz láser pulsado, infrarrojos puede ser utilizado para provocar respuestas eléctricas en el tejido neural, independiente de cualquier modificación adicional del tejido diana. Estimulación neural de infrarrojos ha sido reportado en una variedad de tejido neural periférica y sensorial in vivo, con particular interés se muestra en la estimulación de las neuronas en el nervio auditivo. Sin embargo, mientras que el INS se ha demostrado que funciona en esta configuración, el mecanismo (o mecanismos) por el cual la luz infrarroja provoca excitación neuronal está actualmente no se entiende bien. El protocolo presentado aquí describe un método de patch clamp de célula completa diseñada para facilitar la investigación de la estimulación neural de infrarrojos en las neuronas auditivas primarias cultivadas. Al caracterizar a fondo la respuesta de estas células a la iluminación láser infrarrojo in vitro bajo condiciones controladas, puede ser posible obtener una mejor comprensión de la Physica fundamentall y procesos bioquímicos subyacentes estimulación neural infrarrojos.

Las neuronas del ganglio espiral responden a la iluminación con láser de formas de onda en tanto repetible de fijación de voltaje y configuraciones de grabación actual-clamp. Figura 3a muestra los cambios típicos en el flujo de corriente a través de una membrana celular en respuesta a un 2,5 mseg, 0,8 mJ láser de pulso (respuesta promedio de 6 pulsos de láser, que se repite en intervalos de 1 seg) con el potencial de membrana se celebró en -70 mV, -60 mV y -50 mV. Corrientes de entrada netos se evocan c...

La estimulación del nervio infrarrojos ha sido propuesta como una alternativa a la estimulación eléctrica en una gama de tipos de nervios, incluyendo los asociados con el sistema auditivo. Este protocolo describe un método de patch clamp para estudiar el mecanismo de estimulación nerviosa de infrarrojos en un cultivo de neuronas auditivas primarias.

Whole Cell Patch Clamp para investigar los mecanismos de la Estimulación Neural infrarrojos

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

El objetivo general del siguiente experimento es producir un sistema modelo para estudiar los efectos de la iluminación con láser infrarrojo sobre neuronas auditivas in vitro. Esto se logra mediante el registro con microelectrodo de parche en neuronas auditivas cultivadas en configuración de célula completa, con el fin de explorar sus características eléctricas. Posteriormente, exponer las neuronas a irradiación láser puede provocar respuestas eléctricas en la célula expuesta, las cuales pueden medirse mediante un montaje de registro con microelectrodo de parche.Los parámetros de iluminación y las variables ambientales pueden variarse entonces para observar sus efectos sobre las respuestas eléctricas inducidas por láser. Las neuronas auditivas expuestas a la luz láser exhibirán actividad eléctrica repetible en respuesta a cada pulso láser para su posterior análisis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre los mecanismos subyacentes a la estimulación infrarroja de las neuronas del ganglio espiral.Aunque este método puede proporcionar información sobre la estimulación infrarroja de células ganglionares espirales en particular, también puede extenderse a otros tipos celulares o modelos simplificados, como bicapas lipídicas, para elucidar aún más los procesos físicos que intervienen. La demostración visual de este método es importante para asegurar una colocación precisa de la fibra óptica de entrega de luz, ya que la exposición a la radiancia resultante es un parámetro crítico. Se han preparado micropipetas de registro con una resistencia de dos a seis megaohmios. Estas pueden obtenerse al tirar de vidrio silicato de boro con un extractor láser de CO2.Prepare el láser acoplado a fibra. Funcionará una amplia variedad de fibras ópticas. Cortar una fibra en configuración de cable de conexión con conectores FCPC por la mitad produce dos tramos de fibra, cada uno con un conector en un extremo y fibra expuesta en el otro extremo.Estos son los cordones. Prepare la punta del oso de un cordón retirando la chaqueta de fibra, limpiándola con etanol y cortándola con una herramienta adecuada bajo un microscopio. Verifique que la punta sea perpendicular al eje de la fibra y que parezca plana.Conecte el otro extremo del cable de fibra al salida del láser de estimulación utilizando un conector pasante adecuado, si es necesario. En este punto, asegúrese siempre de medir la potencia del láser de salida proveniente de la fibra. Haga esto también después de cualquier manipulación adicional de la punta.Ahora inserte la fibra en una mordaza y fije la mordaza al microposicionador adecuado. A continuación, determine el ángulo que forma la fibra óptica con una lámina de cubierta. Tome una fotografía del arreglo y calcule el ángulo utilizando ImageJ. Ahora, asegure las conexiones que sincronizan el láser con el sistema de adquisición de datos del parche soldado.La salida digital del sistema de adquisición de datos del parche debe conectarse al láser mediante un generador de funciones externo, lo que permite especificar los parámetros del pulso láser de forma independiente del sistema de adquisición de datos. La señal utilizada para activar el láser debe retroalimentarse a una entrada del sistema de adquisición de datos para asegurar que el momento y la duración de los pulsos láser puedan registrarse simultáneamente con la señal electrofisiológica. Establezca el caudal del sistema de perfusión entre uno y dos mililitros por minuto. Un sistema alimentado por gravedad con un calentador en línea para calentar rápidamente la solución y una bomba peristáltica para eliminar la solución gastada mediante succión funcionará bien. Coloque un cubreobjetos con células cultivadas en la cámara de registro de un microscopio invertido utilizando un objetivo de inmersión en agua de alta magnificación y contraste de fases, y localice una neurona del ganglio espiral.Un neurona típico del ganglio espiral presenta un aspecto brillante, redondeado y con una fase de aproximadamente 15 micrómetros de diámetro, con un núcleo prominente. Una vez localizado un neurona adecuado, cambie a un objetivo de menor aumento y localice el neurona objetivo. Luego, utilice el microposicionador para mover la fibra óptica hasta que la punta esté cerca del neurona objetivo tanto en el plano horizontal como en el vertical. Cambie de nuevo al objetivo de alta magnificación y coloque la punta de la fibra óptica en su posición prevista junto al neutrón. Al ajustar la posición vertical de la fibra, es importante que el borde inferior de la fibra descanse sobre el borde del cubreobjetos. Para minimizar la incertidumbre en la ubicación de la fibra, el punto de contacto puede identificarse a partir de señales visuales en la imagen del microscopio.Una vez que la fibra esté en posición, desplácela hacia afuera una cantidad conocida a lo largo de su eje longitudinal para no afectar la colocación de la micropipeta. La micropipeta debe llenarse con solución intracelular y fijarse firmemente en su lugar sobre la etapa del amplificador. Mediante un tubo conectado al lateral del porta-electrodos micropipeta, aplique una pequeña cantidad de presión positiva para evitar el obstrucción de la micropipeta.Utilizando un micromanipulador, coloque la micropipeta en posición justo por encima del neutrón objetivo y continúe con la formación del sello gigaohmio. Registre la capacitancia de la membrana, la resistencia en serie y la resistencia de entrada determinadas a partir de la curva exponencial ajustada a la corriente durante el pulso de prueba del sello.Minimice el transitorio de capacitancia ajustando los controles CP rápido y CP lento en el amplificador. Luego, cambie el amplificador a modo de célula completa y modifique la compensación de capacitancia y resistencia hasta que se observe una corriente plana durante la prueba de SELLO. A continuación, aplique la compensación de resistencia en serie con una corrección del 70 % y una predicción del 70 %, ajustando los controles de compensación de capacitancia y resistencia para mantener una respuesta plana en la prueba de sello.Luego cambie el amplificador al modo de fijación de corriente. Observe el potencial de membrana en reposo en ausencia de inyección de corriente. Ahora establezca una corriente de mantenimiento para estabilizar el potencial de membrana al nivel deseado.Neutralice la capacitancia de la pipeta y ajuste el equilibrio del puente para compensar la caída de voltaje. Compruebe las propiedades de disparo del neutrón mediante estimulación con corriente despolarizante. En este momento, mueva la fibra óptica nuevamente a su posición junto al neutrón utilizando software de imagen, acoplado a una cámara CCD, para capturar imágenes enfocadas primero en el plano del neutrón y luego en el borde superior de la fibra óptica.Analice las imágenes para determinar el valor delta, que es la posición del borde superior de la fibra óptica en relación con el centro de la neurona objetivo. Es muy importante conocer con precisión la posición de la fibra óptica. Esto se debe a que la energía por unidad de área, o exposición de radiancia, entregada a la célula objetivo es un parámetro crítico para la estimulación neural por infrarrojos, y esto puede verse significativamente afectado por la posición de la fibra respecto a la célula.Este láser tiene su potencia óptica controlada por computadora mediante una entrada directa al láser y puede especificarse manualmente antes de cada registro. La duración del pulso y la frecuencia de repetición pueden controlarse mediante el generador de funciones como se describió anteriormente; asegúrese de que los datos se registren tanto del canal del parche como del canal de disparo del láser, con pulsos de láser de medio milisegundo a 15 milisegundos a entre 0,25 y cinco milijoules. Típicamente, esto produce respuestas eléctricas medibles. Inicialmente.Puede ser útil ajustar la frecuencia de repetición de los pulsos láser a un hercio o menos para minimizar efectos indeseables. Una vez que se hayan establecido todos los parámetros del láser, continúe con la recopilación de datos.Las neuronas del ganglio espiral responden a la iluminación láser con formas de onda repetibles tanto en configuraciones de registro con fijación de voltaje como con fijación de corriente, en respuesta a pulsos láser de 2,5 milisegundos y 0,8 milijulios. Una célula típica genera una corriente neta entrante a diversos potenciales de mantenimiento. Los registros con fijación de corriente muestran una despolarización sostenida de la membrana durante la duración de estos pulsos láser, seguida por una disminución aproximadamente exponencial hacia el potencial de membrana en reposo tras el pulso.En algunos casos, también hay una pequeña despolarización de la membrana adicional tras el pulso láser. Iluminar con energía excesiva o la exposición a aumentos significativos de temperatura puede provocar daño celular, observado mediante el deterioro de las propiedades eléctricas de la célula o la muerte celular instantánea. Siguiendo este procedimiento, se puede variar una serie de parámetros ambientales, como la temperatura de la solución o factores químicos, para evaluar el efecto de estos sobre la actividad eléctrica inducida por láser.No olvide que trabajar con láseres puede ser peligroso y deben establecerse precauciones de seguridad estándar. Estas incluyen el uso de gafas de seguridad para láser, señales de advertencia y asegurarse de que el haz no interseccione accidentalmente con superficies altamente reflectantes.

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Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este protocolo describe una técnica llamada electrofisiología de pinza de parche de célula completa, que es un método para estudiar las propiedades eléctricas de las neuronas de Mauthner y otras células reticuloespinales en embriones de pez cebra.

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Descrito aquí es un procedimiento para la obtención de largos tramos de grabación actual de un canal de iones con la técnica de patch-clamp de células-adjunto. Este método permite observar, en tiempo real, el modelo de open-close conformaciones de canales que son la base de la señal biológica. Estos datos informan acerca de las propiedades de los canales en las membranas biológicas inalteradas.

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Aprende a usar el método de patch clamp de célula completa para investigar la estimulación neural infrarroja en neuronas auditivas primarias. Esta técnica permite analizar las respuestas eléctricas y avanzar en terapias del sistema auditivo.

Whole Cell Patch Clamp para investigar los mecanismos de la Estimulación Neural infrarrojos

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