RNAi mediada Doble derribo Gene y medición percepción gustativa de las abejas ( Apis mellifera)

Este protocolo de video muestra técnicas novedosas para derribar simultáneamente dos genes en abejas melíferas adultas y luego realizar una respuesta de extensión de probos o ensayo PER para medir el efecto de la eliminación de genes dobles. Sobre la percepción gustativa de las abejas melíferas. Esto se logra sintetizando primero ARN bicatenarios, dirigiéndose a los genes de tres proteínas, vitelli, genina, ultras, esférica y proteína de fluorescencia verde.

Dado que el gen que codifica GFP no se encuentra en el genoma de la abeja, el ARN bicatenario GFP sirve como control negativo. El segundo paso es inyectar ARN bicatenario en las abejas melíferas utilizando cuatro estrategias de tratamiento. Inyección con ARN bicatenario GFP solo, una inyección única con una bicatenaria VG y USP, inyección de mezcla de ARN con ARN bicatenario vg el primer día, seguida de una inyección con ARN bicatenario USP el segundo día, e inyección con ARN bicatenario USP el primer día, seguida de una inyección con ARN bicatenario VG el segundo día después de que las inyecciones marcaron a las abejas con puntos de pintura codificados por colores correspondientes a los tratamientos y los devolvieron a una colmena.

Seis días después, la eliminación de los genes VG y USP en las abejas tratadas se valida mediante PCR en tiempo real y el efecto de la doble eliminación de VG y USP en la percepción gustativa se determina mediante el ensayo PER. En última instancia, se ha demostrado que las abejas de doble derribo tienen reducciones significativas en la expresión de los genes VG y USP y aumentos significativos en la percepción gustativa de la sacarosa. Nuestra interferencia es una herramienta poderosa que podemos usar para revelar las funciones de los genes.

Por lo general, se usa para atacar un solo gen. Sin embargo, los genes forman parte de una compleja red reguladora. Una forma de comprender mejor cualquier proceso biológico es aprender cómo interactúan los genes con la red de genes.

Para ello, tenemos que manipular varios genes al mismo tiempo. Hasta ahora, solo hemos podido sorprender un gen a la vez en insectos aquí por primera vez, queremos mostrarte cómo derribar dos G en abejas melíferas en lugar de una. El reflejo de extensión de las SCU o PER es una técnica muy útil para medir la percepción gustativa, que es un predictor conductual del comportamiento social de las abejas melíferas.

Por ejemplo, las abejas nido con alta percepción gustativa, maduran rápidamente según el comportamiento, forjan temprano en la vida y prefieren recolectar polen. Para comenzar este procedimiento, diseñe cebadores de ARN bicatenario dirigidos a los genes para su eliminación utilizando el cebador de software libre. Tres. En este experimento, los dos genes objetivo para el knockdown son vitelli, genin o VG y ultras spherical o USP.

Además del diseño VG y USP, los cebadores de ARN bicatenario se dirigen a un gen de control que codifica la proteína de fluorescencia verde, o GFP, que no está en el genoma de la abeja melífera. Posteriormente de doble cadena. La síntesis de ARN para VG USP y GFP se realiza mediante transcripción in vitro utilizando el sistema de producción de ARN rib max T seven de Promega.

Después de purificar los ARN bicatenarios utilizando procedimientos estándar, disolver cada gránulo de ARN bicatenario en agua libre de nucleasas para garantizar la eficacia de la regulación negativa de genes, la concentración de ARN bicatenario debe ser de alrededor de nueve a 10 microgramos por microlitro. Para preparar las abejas para la inyección, enfríe, las abejas recién emergidas en un refrigerador de cuatro grados centígrados durante uno o dos minutos. Una vez que las abejas estén inmovilizadas, monte de tres a cuatro abejas en paralelo en placas de Petri llenas de cera sólida con alfileres de insectos cruzados entre su abdomen y tórax.

Enfríe las abejas nuevamente en un refrigerador de cuatro grados centígrados durante aproximadamente uno o dos minutos. Asegúrate de que las abejas estén completamente inmóviles. Las abejas deben verse sueltas, no enroscadas ni retorcidas.

La inmovilización completa es importante, ya que cualquier movimiento podría aumentar el tamaño de la herida y la mortalidad. Las abejas que están enroscadas o contorsionadas se han enfriado durante demasiado tiempo y no deben usarse debido a la alta mortalidad. Coloque una aguja desechable de calibre 30 en una microjeringa Hamilton.

Llene la jeringa con tres microlitros de ARN bicatenario y asegúrese de que no haya burbujas de aire en la jeringa. Si se utiliza una estrategia de inyección única, la jeringa se llena con una mezcla de los ARN bicatenarios de los dos genes. Si se utiliza una estrategia de inyección de dos días, la jeringa se llena con uno de los dos ARN bicatenario.

Inserte la aguja en un lado del abdomen. Para evitar dañar los órganos internos, presione lentamente el émbolo de la jeringa para permitir que se absorba el ARN bicatenario. Dado que el ARN bicatenario es muy viscoso, se tarda de dos a tres segundos en expulsarlo completamente de la jeringa.

Después de empujar completamente el émbolo, deje la aguja en la herida durante cuatro o cinco segundos. Observe a las abejas durante tres a cinco segundos después de las inyecciones. Si una gota de hemo linfa se escapa de la herida, deseche la abeja, marque el tórax de las abejas con diferentes colores correspondientes a diferentes tratamientos.

En este punto, si se utiliza la estrategia de inyección única, observe a las abejas durante una hora en un recipiente con miel suministrada, luego colóquelas nuevamente en una colonia. Sin embargo, si se utiliza la estrategia de inyección de dos días y solo se ha inyectado el primer ARN bicatenario, coloque las abejas en una jaula de malla cilíndrica con miel suministrada en el lateral. Mantenga las abejas en una incubadora a 34 grados centígrados y 80% de humedad durante la noche del día siguiente.

Inyecte a las mismas abejas el segundo ARN bicatenario, utilizando el mismo procedimiento que para el primer ARN bicatenario. Deje que las abejas se recuperen a temperatura ambiente durante una hora en un recipiente con miel suministrada y luego introdúzcalas en una colonia. Seis días las inyecciones recogen las abejas tratadas de la colonia sin usar un ahumador para abrir la colmena.

No se utiliza humo porque podría afectar la percepción gustativa de las abejas, lo que se probará en este procedimiento. Recoja las abejas en jaulas cilíndricas de malla metálica con pinzas blandas con no más de tres abejas por jaula para montar a las abejas. Para el ensayo PER.

Enfríe las abejas a cuatro grados centígrados hasta que estén completamente inmovilizadas. Monta cada abeja verticalmente en un tubo de plástico, especialmente diseñado para PER. Usa cinta adhesiva para mantener el abdomen dentro del tubo y mantener la cabeza sobresaliendo del tubo.

Coloque los tubos en una rejilla con dos filas de pequeñas columnas de plástico. Una fila está numerada para que a las abejas montadas se les pueda asignar un número de identificación. Coloque los bastidores con las abejas tratadas en una incubadora a 34 grados centígrados y 80% de humedad durante dos horas mientras las abejas están incubando.

Prepara una serie de sacarosa. Soluciones de agua. Cargue las soluciones en jeringas con agujas de calibre 15 a 20 para el ensayo PER.

Las abejas se prueban en grupos. Primero toque la antena de cada abeja con una gota de 0%solución, que es agua, después de esa prueba con 0.1%0.3%1%3%10% y 30% sacarosa. Soluciones de agua, dejando al menos dos minutos para el intervalo entre cada solución.

Por lo general, se tarda alrededor de dos minutos en analizar 20 abejas con una concentración de sacarosa. Por lo tanto, siempre debe haber más de 20 abejas en cada grupo. Si una abeja extiende completamente su probos, se cuenta una respuesta positiva. Tiempo real.

El análisis de PCR confirmó que tanto la inyección única como las estrategias de inyección de dos días redujeron significativamente los niveles de transcripción de Fiji y USP en las abejas melíferas. Seis días después de que se inyectó el ARN bicatenario en estos gráficos, el RQ indica el nivel relativo de cuantificación de las transcripciones del gen objetivo y las diferentes letras sobre las barras denotan diferencias significativas entre los grupos de tratamiento. El análisis posterior a la charla reveló que la supresión de la transcripción de USP mediante el uso de la inyección única con mezcla de ARN bicatenario y la inyección de dos días con VG primero y USP segundo fue significativamente menor que la inyección de dos días con USP primero y VG después.

Esto indica que la VG puede ser un regulador primario en el bucle regulador de la VG y de las hormonas juveniles. Las puntuaciones de GUA a respuesta o GRS para las abejas tratadas se calcularon a partir de los resultados del ensayo de respuesta de extensión de probos o PER, como se muestra aquí. El GRS en las abejas que fueron inyectadas con VG y la mezcla de ARN bicatenario USP fue significativamente mayor que el GRS en las abejas de control GFP, lo que indica que las abejas de doble derribo eran más sensibles a la sacarosa.

Las diferentes letras sobre las barras denotan diferencias significativas entre los grupos de tratamiento. Aquí se muestra una posible red reguladora entre las ultras de vi genina, la hormona esférica y la hormona juvenil revelada mediante la supresión simultánea de los genes VG y USP. Mientras que un solo knockdown de USP no induce ningún cambio en la hormona juvenil, un doble knockdown de VG y USP causa un mayor aumento en la hormona juvenil que un knockdown único de VG.

Esto sugiere que vitelli no solo inhibe la producción de hormonas juveniles, sino que inhibe una respuesta de retroalimentación de la hormona juvenil a la eliminación de USP. En los knockdowns dobles, el aumento dramático de la producción de hormonas juveniles es el resultado de una inhibición reducida de VI genin causada por el knockdown de VG y una respuesta compensatoria a una transducción reducida de hormonas juveniles causada por el knockdown de USP. Un análisis más detallado de esta red reguladora se encuentra en el texto del protocolo adjunto.

Mediante el uso de un enfoque de eliminación de genes dobles, hemos revelado una relación detallada entre la hormona génica vital, ultras, esférica y juvenil, que no habríamos descubierto suprimiendo solo un gen. Ahora, mediante el uso de esta técnica, los investigadores pueden explorar la interrelación entre los genes dentro de las redes reguladoras. La PR es un método estándar utilizado para medir la percepción gustativa en las abejas melíferas, sin embargo, es muy sensible a la manipulación, por lo que se debe tener mucho cuidado al mantener las consistencias entre el entorno y el manejo de los animales.

Además, si el ensayo se va a realizar durante varios días, es una buena idea mantener una línea de tiempo corta y estar atento para asegurarse de que el clima y el entorno no cambien.