RNAi mediada Doble derribo Gene y medición percepción gustativa de las abejas (

Este protocolo en video demuestra técnicas novedosas para silenciar simultáneamente dos genes en abejas melíferas adultas y luego realizar un ensayo de respuesta de extensión del probóscide o PER para medir el efecto del silenciamiento doble de genes sobre la percepción gustativa de las abejas. Esto se logra primero mediante la síntesis de ARN bicatenarios, dirigidos contra los genes que codifican tres proteínas: vitelina, genina, ultras, esférica y la proteína verde fluorescente.

Dado que el gen que codifica la GFP no se encuentra en el genoma de la abeja melífera, el ARN bicatenario de GFP sirve como control negativo. El segundo paso consiste en inyectar ARN bicatenario en abejas melíferas utilizando cuatro estrategias de tratamiento. Inyección con ARN bicatenario de GFP, solo ARN, una inyección única con una mezcla de ARN bicatenario de VG y USP, inyección con ARN bicatenario de vg el primer día, seguida de inyección con ARN bicatenario de USP el segundo día, e inyección con ARN bicatenario de USP el primer día, seguida de inyección con ARN bicatenario doble de VG el segundo día. Después de las inyecciones, se marcaron las abejas con puntos de pintura codificados por colores correspondientes a los tratamientos y se devolvieron a una colmena.

Seis días después, la inhibición génica de VG y USP en las abejas tratadas se valida mediante PCR en tiempo real y el efecto de la doble inhibición de VG y USP sobre la percepción gustativa se determina mediante el ensayo de PER. En última instancia, se demuestra que las abejas con doble inhibición presentan reducciones significativas en la expresión de los genes VG y USP, así como aumentos significativos en la percepción gustativa frente a la sacarosa. Nuestra interferencia constituye una herramienta potente que podemos utilizar para revelar funciones génicas.

Por lo general, se utiliza para dirigirse a un solo gen. Sin embargo, los genes forman parte de una red reguladora compleja. Una forma de comprender mejor cualquier proceso biológico es aprender cómo los genes interactúan con la red génica.

Para hacer esto, debemos manipular múltiples genes al mismo tiempo. Hasta ahora, solo habíamos podido silenciar un gen a la vez en insectos; aquí, por primera vez, queremos mostrarles cómo silenciar dos genes en abejas melíferas en lugar de uno. El reflejo de extensión del cogullo (REC) es una técnica muy útil para medir la percepción gustativa, que es un indicador conductual del comportamiento social de las abejas melíferas.

Por ejemplo, las abejas nido con alta percepción gustativa maduran rápidamente desde el punto de vista conductual, comienzan a forrajear temprano en la vida y prefieren recolectar polen. Para iniciar este procedimiento, diseñe cebadores de ARN bicatenarios que dirijan los genes para su silenciamiento utilizando el software gratuito primer.Three. En este experimento, los dos genes objetivo para el silenciamiento son vitelli, genin o VG y ultras esférico o USP.

Además del diseño de cebadores para VG y USP, se utilizan cebadores de ARN bicatenario que dirigen un gen control que codifica la proteína verde fluorescente, o GFP, la cual no se encuentra en el genoma de la abeja melífera. Posteriormente, la síntesis de ARN bicatenario para VG, USP y GFP se lleva a cabo mediante transcripción in vitro utilizando el sistema de producción de ARN T siete rib max de Promega.

Después de purificar los ARN bicatenarios utilizando procedimientos estándar, disuelva cada precipitado de ARN bicatenario en agua libre de nucleasas para asegurar la eficacia de la inhibición génica; la concentración de ARN bicatenario debe estar alrededor de nueve a 10 microgramos por microlitro. Para preparar las abejas para la inyección, enfríe las abejas recién emergidas en un refrigerador a cuatro grados Celsius durante uno o dos minutos. Una vez que las abejas estén inmovilizadas, sujete tres o cuatro abejas en paralelo sobre placas de Petri llenas de cera sólida con alfileres entomológicos cruzados entre sus abdomens y tórax.

Enfríe las abejas nuevamente en un refrigerador de cuatro grados Celsius durante aproximadamente uno a dos minutos. Asegúrese de que las abejas estén completamente inmóviles. Las abejas deben verse relajadas, sin estar encogidas ni retorcidas.

La inmovilización completa es importante, ya que cualquier movimiento podría aumentar el tamaño de la herida y la mortalidad. Las abejas que están encogidas o contorsionadas han sido enfriadas durante demasiado tiempo y no deben usarse debido a la alta mortalidad. Coloque una aguja desechable de calibre 30 en una jeringa microsiringa Hamilton.

Llene la jeringa con tres microlitros de ARN bicatenario y asegúrese de que no haya burbujas de aire en la jeringa. Si se utiliza una estrategia de inyección única, la jeringa se llena con una mezcla de los ARN bicatenarios de los dos genes. Si se utiliza una estrategia de inyección en dos días, la jeringa se llena con uno de los dos ARN bicatenarios.

Introduzca la aguja en un lateral del abdomen. Para evitar dañar órganos internos, presione lentamente el émbolo de la jeringa para permitir que el ARN bicatenario sea absorbido. Dado que el ARN bicatenario es muy viscoso, se necesitan de dos a tres segundos para expulsarlo completamente de la jeringa.

Después de presionar completamente el émbolo, deje la aguja en la herida durante cuatro a cinco segundos. Observe las abejas durante tres a cinco segundos después de las inyecciones. Si una gota de hemolinfa sale por la herida, deseche la abeja y marque el tórax de las abejas con diferentes colores que correspondan a los distintos tratamientos.

En este momento, si se utiliza la estrategia de inyección única, observe las abejas durante una hora en un recipiente con miel suministrada, luego devuélvalas a una colonia. Sin embargo, si se emplea la estrategia de inyección de dos días y solo se ha inyectado el primer ARN de doble cadena, coloque las abejas en una jaula de malla cilíndrica con miel suministrada en el lateral. Mantenga las abejas en un incubador a 34 grados Celsius y 80 % de humedad durante la noche y el día siguiente.

Inyecte las mismas abejas con el segundo ARN bicatenario, utilizando el mismo procedimiento que para el primer ARN bicatenario. Deje que las abejas se recuperen a temperatura ambiente durante una hora en un recipiente con miel disponible, y luego introdúzcalas en una colonia. Seis días después de las inyecciones, recolecte las abejas tratadas de la colonia sin usar ahumador para abrir la colmena.

No se utiliza humo porque podría afectar la percepción gustativa de las abejas, que será evaluada en este procedimiento. Recolecte abejas en jaulas cilíndricas de malla metálica utilizando pinzas suaves, con no más de tres abejas por jaula para montarlas. Para el ensayo de PER.

Enfríe las abejas a cuatro grados Celsius hasta que estén completamente inmovilizadas. Coloque cada abeja verticalmente dentro de un tubo de plástico, diseñado especialmente para PER. Utilice cinta adhesiva para mantener el abdomen dentro del tubo y dejar la cabeza sobresaliendo del tubo.

Coloque los tubos en un soporte con dos filas de columnas de plástico pequeñas. Una fila está numerada para que las abejas montadas puedan asignarse un número de identificación. Coloque los soportes con las abejas tratadas en un incubador a 34 grados Celsius y 80% de humedad durante dos horas mientras las abejas están incubando.

Prepare una serie de soluciones acuosas de sacarosa. Cargue las soluciones en jeringas con agujas de calibre 15 a 20 para el ensayo PER.

Las abejas se prueban en grupos. Primero, toque la antena de cada abeja con una gota de solución al 0%, que es agua, y después pruebe con sacarosa al 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% y 30%. Use soluciones acuosas, dejando al menos dos minutos de intervalo entre cada solución.

Por lo general, se tardan aproximadamente dos minutos en probar 20 abejas utilizando una concentración de sacarosa. Por lo tanto, siempre debe haber más de 20 abejas en cada grupo. Si una abeja extiende completamente su probóscide, se cuenta una respuesta positiva en tiempo real.

El análisis de PCR confirmó que tanto la estrategia de inyección única como la de inyección durante dos días redujeron significativamente los niveles de transcritos de Fiji y USP en abejas melíferas. Seis días después de la inyección de ARN bicatenario, en estos gráficos, el RQ indica el nivel de cuantificación relativa de los transcritos del gen diana y las diferentes letras sobre las barras denotan diferencias significativas entre los grupos de tratamiento. El análisis posterior reveló que la supresión del transcrito de USP mediante la inyección única con una mezcla de ARN bicatenario y la inyección durante dos días con VG primero y USP segundo fue significativamente menor que la inyección durante dos días con USP primero y VG segundo.

Esto indica que VG podría ser un regulador primario en el bucle regulador de VG y la hormona juvenil. Los puntajes de respuesta a GUA o GRS para las abejas tratadas se calcularon a partir de los resultados del ensayo de respuesta de extensión del probóscide o PER, como se muestra aquí. El GRS en las abejas que fueron inyectadas con una mezcla de ARN bicatenario de VG y USP fue significativamente mayor que el GRS en las abejas control GFP, lo que indica que las abejas con doble silenciamiento fueron más sensibles a la sacarosa.

Las diferentes letras sobre las barras indican diferencias significativas entre los grupos de tratamiento. Aquí se muestra una posible red reguladora entre vi genin ultras, esférico y la hormona juvenil revelada mediante la supresión simultánea de los genes VG y USP. Mientras que una inhibición individual de USP no induce ningún cambio en la hormona juvenil, una doble inhibición de VG y USP provoca un mayor aumento en la hormona juvenil que una inhibición individual de VG.

Esto sugiere que vitelli no solo inhibe la producción de la hormona juvenil, sino que también inhibe una respuesta de retroalimentación de la hormona juvenil al silenciamiento de USP. En los dobles silenciamientos, el aumento dramático de la producción de la hormona juvenil resulta de una inhibición reducida por parte de VI genin causada por el silenciamiento de VG y de una respuesta compensatoria ante una transducción reducida de la hormona juvenil provocada por el silenciamiento de USP. En el texto del protocolo adjunto se encuentra una discusión más detallada de esta red reguladora.

Mediante el uso de un enfoque de doble silenciamiento génico, hemos revelado una relación detallada entre los genes vitales genic, ultras, spherical y la hormona juvenil, que no habríamos descubierto mediante la supresión de solo un gen. Ahora, utilizando esta técnica, los investigadores pueden explorar la interrelación entre genes dentro de redes reguladoras. La PR es un método estándar empleado para medir la percepción gustativa en abejas melíferas; sin embargo, es muy sensible al manejo, por lo que se debe tener mucho cuidado para mantener la consistencia entre el entorno y el manejo de los animales.

Además, si el ensayo se va a realizar durante varios días, es recomendable mantener una línea de tiempo breve y estar atento para asegurarse de que el clima y el entorno no cambien.