Name: RNAi mediada Doble derribo Gene y medición percepción gustativa de las abejas ( Apis mellifera) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-25T08:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Aprende a realizar el doble derribo génico en abejas melíferas y medir la percepción gustativa mediante el ensayo PER. Este método permite estudiar la función génica en redes regulatorias del comportamiento.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Los autores desean agradecer a Erin Fennern para ayudar experimento. Este trabajo fue financiado por el Consejo de Investigación de Noruega (180.504, 185.306 y 191.699), PEW Charitable Trust y el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (NIA P01 AG22500).

Parte 1: RNAi mediada desmontables de dos genes 1. dsRNA síntesis <ol><li> Diseño de cebadores dsRNAs dirigidos vg, USP y una proteína de control del gen que codifica la fluorescencia verde (GFP), que no está en la miel de abeja genoma: primers fueron diseñados utilizando software libre en línea Primer3 ( <a href="http://frodo.wi.mit.edu/" target="_blank">http://frodo.wi.mit.edu/</a> ) . </li><li> síntesis de dsRNA para VG, USP y GFP: uso RiboMax T7 sistema de producción de ARN de Promega para la transcripción in vitro. </li><li> dsRNA purificación: <ol><li> Desnaturalización y renaturalización: el calor del dsRNA a 85 ° C durante 5 minutos y dejar enfriar a temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Tratamiento con DNasa I: añadir 1 l de DNasa I en cada reacción de dsRNA y mezclarlas con un movimiento rápido de los tubos. Incubar durante 15 min a 37 ° C. </li><li> Añadir 150 l de agua libre de nucleasa y 750 l TRizol - LS en cada reacción y mezclar suavemente les invErting el tubo. Se incuban las muestras durante 5 min a 30 ° C. </li><li> Añadir 200 l de cloroformo a cada muestra. Mezclar enérgicamente durante 20 segundos. Centrifugar las muestras durante 15 min a 12.000 xg a 4 ° C. </li><li> Transferir la fase sobrenadante de cada tubo nuevo y añadir 500 l de alcohol isopropílico en cada tubo. Mezclar invirtiendo el tubo. Incubar la mezcla durante 20 min a -20 ° C. Centrifugar durante 10 minutos a 12.000 xga 4 º C. </li><li> Eliminar el sobrenadante y el uso de 1,000 l de etanol 75% para lavar el sedimento. Después de centrifugar el tubo durante 5 min a 7500 xg a 4 ° C, el aire seco del dsRNA de pellets, y el uso de agua libre de nucleasa para disolver el precipitado. Con el fin de garantizar la eficacia del gen de la regulación a la baja, la concentración de ARN de doble cadena debe estar alrededor de 9 -10 g / l. </li></ol></li></ol> 2. dsRNA inyección abdominal Por gen desmontables doble, hay dos estrategias: 1) una sola inyección: dsRNA mezcla de dos genes y Inject la mezcla; 2) de dos días de inyección: inyectar la primera orientación dsRNA un gen en el primer día, e inyectar el segundo ARN de doble cadena en las mismas abejas en el segundo día. <ol><li> Chill recientemente surgió abejas en un refrigerador 4 ° C durante 1-2 min. Cuando se inmovilizan las abejas, las abejas 3-4 montar en paralelo en placas de Petri llenas de cera sólida con alfileres de insectos cruzadas entre el abdomen y thoraces. </li><li> Enfríe las abejas de nuevo en un ° C refrigerador 4. Asegúrese de que las abejas son completamente inmóvil. Se tarda unos 1-2 min. Las abejas deben buscar suelto. Si las abejas se vuelven arrugadas o retorcida, significa que se enfrían demasiado tiempo que deben evitarse. Tiempo libre demasiado provoca una alta mortalidad, pero inmovilización completa es importante ya que cualquier movimiento aumenta el tamaño de la herida y la mortalidad. </li><li> Coloque una aguja desechable 30G (BD) en un micro jeringa Hamilton. Tome 3 l dsRNA y asegúrese de que no hay burbujas de aire en la jeringa. La aguja se introduce a un lado del abdomen para evitar la damaging órganos internos. Presione el émbolo de la jeringa lentamente para permitir que el ARN de doble cadena para ser absorbido. Desde dsRNA es muy viscoso, que se necesita 2-3 seg para ser completamente expulsado de la jeringa. Tras completamente empujando hacia abajo el émbolo, deje la aguja en la herida durante 4-5 segundos. Observar las abejas para 3-5 segundos después de las inyecciones. Si un hemolinfa fugas gotita de la herida, desechar la abeja. </li><li> Usar diferentes colores para marcar sus Thoraces correspondientes a diferentes tratamientos. En este punto, si se utiliza la estrategia de inyección única, las abejas pueden colocarse de nuevo en una colonia después de 1 hora de observación. Sin embargo, si se utiliza la estrategia de inyección de dos días, después de haber sido inyectados con la primera dsRNA, las abejas deben ser colocados en una jaula de malla de cilindro con miel suministrado en el lado y se mantuvieron en una incubadora a 34 ° C y 80% de humedad . </li><li> En el segundo día, siga los pasos 2.2 y 2.3 para relajarse de las abejas en las jaulas de malla y montarlos en placas de cera. Realizar inyecciones con la segunda dsRNA como es descricama en el paso 2.4. </li><li> Que las abejas se recuperan a temperatura ambiente durante 1 hora y los introducen en una colonia. </li></ol> Nota: efectos Desmontables pueden ser detectados por RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR) y el Western Blot. En general, la eficacia de abatimiento varía y depende de muchos factores. En nuestro estudio, la caída de dos genes puede ser detectada 7 días después de las inyecciones individuales y las inyecciones de dos días. Parte 2: Ensayo de respuesta de extensión probóscide (PER) 1. Recopilación de las abejas de la colmena El día 6 después de las inyecciones, recoger las abejas tratadas de la colonia sin el uso de un fumador. Recoge las abejas en las jaulas de los cilindros de malla metálica. 3 Mantenga las abejas en cada jaula. 2. Abejas de montaje para PER Enfríe las abejas a 4 ° C hasta que estén completamente inmovilizados. Monte cada abeja verticalmente en un tubo de plástico especialmente diseñada para PER. Mantenga el abdomen dentro del tubo por using dos pequeños trozos de cinta, y mantener la cabeza que sobresale del tubo. Colocar los tubos en un bastidor con dos filas de pequeñas columnas de plástico, y asignar a cada tubo (abeja) con un número de identificación. Luego ponga las abejas tratadas en los bastidores en una incubadora (34 ° C y 80% de humedad) y mantenerlos en la incubadora durante 2 horas. 3. Preparar una serie de sacarosa Water Solutions Preparar 0%, 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% y 30% de sacarosa soluciones de agua y la carga de las soluciones en jeringas con agujas G 15-20. 4. Por ensayo Toque antena de la abeja con una gotita de solución de 0% (agua), seguido de 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% y 30% de agua soluciones de sacarosa. Pruebe todas las abejas con agua primero y deje por lo menos dos minutos, ya que el intervalo entre cada solución se utiliza. Por lo tanto, solemos tener al menos 20 abejas de cada ensayo. Si una abeja se extiende plenamente sus probóscide, se cuenta una respuesta positiva. 5.Gestión de datos Sume el total de respuestas positivas para cada individuo de la puntuación respuesta gustativa (GRS). Realizar un análisis estadístico adecuado de los datos. Parte 3. Validación derribo Gene Cuerpos gordos son disecados de otro conjunto de 7-días abejas tratados antiguos. Un procedimiento TRizol estándar se utiliza para la extracción de ARN, que es seguido por tratamiento con DNasa I 24. Vg y la expresión génica USP es analizada por un paso de dos QRT-PCR. Actina se usa como un gen de referencia, ya que tiene expresiones estables en diferentes tejidos de las abejas melíferas. Publicado cebadores de PCR en tiempo real para VG y usp gen se utilizan en el experimento 24. Los datos se analizaron mediante el uso de Delta-Delta método CT 25.

<ol><li>Okamura, K., Ishizuka, A., Siomi, H., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+Argonaute+proteins+in+small+RNA-directed+RNA+cleavage+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways.</a> Genes Dev. 18, 1655-1666 (2004).</li>
<li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+RNAi+for+the+masses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Mammalian RNAi for the masses.</a> Trends Genet. 19, 9-12 (2003).</li>
<li>Huvenne, H., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+dsRNA+uptake+in+insects+and+potential+of+RNAi+for+pest+control%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review.</a> J. Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).</li>
<li>Beye, M., Hartel, S., Hagen, A., Hasselmann, M., Omholt, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+developmental+gene+silencing+in+the+honey+bee+using+a+homeobox+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific developmental gene silencing in the honey bee using a homeobox motif.</a> Insect Mol. Biol. 11, 527-532 (2002).</li>
<li>Amdam, G. V., Simoes, Z. L., Guidugli, K. R., Norberg, K., Omholt, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+vitellogenin+gene+function+in+adult+honeybees+by+intra-abdominal+injection+of+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Disruption of vitellogenin gene function in adult honeybees by intra-abdominal injection of double-stranded RNA.</a> BMC Biotechnol. 3, 1(2003).</li>
<li>Patel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+making+of+a+queen%3A+TOR+pathway+governs+diphenic+caste+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The making of a queen: TOR pathway governs diphenic caste development.</a> PLoS ONE. 6, e509(2007).</li>
<li>Amdam, G. V., Norberg, K., Page, R. E., Erber, J., Scheiner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+vitellogenin+gene+activity+increases+the+gustatory+responsiveness+of+honey+bee+workers+%28Apis+mellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Downregulation of vitellogenin gene activity increases the gustatory responsiveness of honey bee workers (Apis mellifera).</a> Behav. Brain Res. 169, 201-205 (2006).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+honey+bee+IRS+gene+biases+behavior+toward+food+rich+in+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of honey bee IRS gene biases behavior toward food rich in protein.</a> PLoS Genet. 6, e1000896(2010).</li>
<li>Wang, Y., Brent, C. S., Fennern, E., Amdam, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gustatory+perception+and+fat+body+energy+metabolism+are+jointly+affected+by+vitellogenin+and+juvenile+hormone+in+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Gustatory perception and fat body energy metabolism are jointly affected by vitellogenin and juvenile hormone in honey bees.</a> PLoS Genet. 8, e1002779(2012).</li>
<li>Luna, B. M., Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+dsRNA+into+Female+A.+aegypti+Mosquitos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos.</a> J. Vis. Exp. (5), e215(2007).</li>
<li>Mussig, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+disruption+of+the+NMDA+receptor+subunit+NR1+in+the+honeybee+brain+selectively+impairs+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation.</a> J. Neurosci. 30, 7817-7825 (2010).</li>
<li>Stove, V., Smits, K., Naessens, E., Plum, J., Verhasselt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+gene+knock-down+by+a+single+lentiviral+vector+expressing+an+array+of+short+hairpin+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Electron+J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiple gene knock-down by a single lentiviral vector expressing an array of short hairpin RNAs.</a> Electron J. Biotechnol. 19, 13(2006).</li>
<li>Sun, D., Melegari, M., Sridhar, S., Rogler, C. E., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-miRNA+hairpin+method+that+improves+gene+knockdown+efficiency+and+provides+linked+multi-gene+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech%22%5BJournal%5D)">Multi-miRNA hairpin method that improves gene knockdown efficiency and provides linked multi-gene knockdown.</a> Biotech. 41, 59-63 (2006).</li>
<li>Ament, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+ultraspiracle+influences+honey+bee+social+behavior+and+behavior-related+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The transcription factor ultraspiracle influences honey bee social behavior and behavior-related gene expression.</a> PLoS Genet. 8, e1002596(2012).</li>
<li>Amdam, G. V., Omholt, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hive+bee+to+forager+transition+in+honeybee+colonies%3A+the+double+repressor+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">The hive bee to forager transition in honeybee colonies: the double repressor hypothesis.</a> J. Theor. Biol. 223, 451-464 (2003).</li>
<li>Pankiw, T., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+thresholds+to+sucrose+predict+foraging+division+of+labor+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Ecol.+Sociobiol%22%5BJournal%5D)">Response thresholds to sucrose predict foraging division of labor in honeybees.</a> Behav. Ecol. Sociobiol. 47, 265-267 (2000).</li>
<li>Pankiw, T., Nelson, M., Page, R. E., Fondrk, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+communal+crop%3A+modulation+of+sucrose+response+thresholds+of+pre-foraging+honey+bees+with+incoming+nectar+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Ecol.+Sociobiol%22%5BJournal%5D)">The communal crop: modulation of sucrose response thresholds of pre-foraging honey bees with incoming nectar quality.</a> Behav. Ecol. Sociobiol. 55, 286-292 (2004).</li>
<li>Jaycox, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+Changes+in+Worker+Honey+Bees+%28Apis+mellifera+L.%29+after+Injection+with+Synthetic+Juvenile+Hormone+%28Hymenoptera%3A+Apidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Kan.+Entomol.+Soc%22%5BJournal%5D)">Behavioral Changes in Worker Honey Bees (Apis mellifera L.) after Injection with Synthetic Juvenile Hormone (Hymenoptera: Apidae).</a> J. Kan. Entomol. Soc. 49, 165-170 (1976).</li>
<li>Jaycox, E. R., Skowronek, W., Guynn, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+changes+in+worker+honey+bees+%28Apis+mellifera%29+induced+by+injections+of+a+juvenile+hormone+mimic%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Entomol.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Behavioral changes in worker honey bees (Apis mellifera) induced by injections of a juvenile hormone mimic.</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 67, 529-534 (1974).</li>
<li>Scheiner, R., Pluckhahn, S., Oney, B., Blenau, W., Erber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+pharmacology+of+octopamine%2C+tyramine+and+dopamine+in+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioural pharmacology of octopamine, tyramine and dopamine in honey bees.</a> Behav. Brain Res. 136, 545-553 (2002).</li>
<li>Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+juvenile+hormone+analogue+on+honey+bee+foraging+behaviour+and+alarm+pheromone+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of a juvenile hormone analogue on honey bee foraging behaviour and alarm pheromone production.</a> J. Insect. Physiol. , 277-282 (1985).</li>
<li>Giurfa, M., Malun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associative+mechanosensory+conditioning+of+the+proboscis+extension+reflex+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Lear+Memory%22%5BJournal%5D)">Associative mechanosensory conditioning of the proboscis extension reflex in honeybees.</a> Lear Memory. 11, 294-302 (2004).</li>
<li>Scheiner, R., Page, R. E., Erber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+genotype%2C+foraging+role%2C+and+sucrose+responsiveness+on+the+tactile+learning+performance+of+honey+bees+%28Apis+mellifera+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">The effects of genotype, foraging role, and sucrose responsiveness on the tactile learning performance of honey bees (Apis mellifera L.).</a> Neurobiol. Learn Mem. 76, 138-150 (2001).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDK1+and+HR46+gene+homologs+tie+social+behavior+to+ovary+signals%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">PDK1 and HR46 gene homologs tie social behavior to ovary signals.</a> PLoS ONE. 4, e4899(2009).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+behaviorally+associated+gene+networks+in+worker+honey+bee+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honey bee ovaries.</a> J. Exp. Biology. 215, 124-134 (2012).</li>
<li>Amdam, G. V., Csondes, A., Fondrk, M. K., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+social+behaviour+derived+from+maternal+reproductive+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complex social behaviour derived from maternal reproductive traits.</a> Nature. 439, 76-78 (2006).</li>
<li>Amdam, G. V., Ihle, K. E., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmdam%2C+GV+%22Hormones%2C+Brain+and+Behavio%22">Hormones, Brain and Behavio</a>. Pfaff, D., et al. , Elsevier Academic Press. (2009).</li>
<li>Guidugli, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitellogenin+regulates+hormonal+dynamics+in+the+worker+caste+of+a+eusocial+insect%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect.</a> FEBS Letters. 579, 4961-4965 (2005).</li>
<li>Corona, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((juvenile+hormone%2C+insulin+signaling%2C+and+queen+honey+bee+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">juvenile hormone, insulin signaling, and queen honey bee longevity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7128-7133 (2007).</li>
<li>Sinha, S., Ling, X., Whitfield, C. W., Zhai, C., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+scan+for+cis-regulatory+DNA+motifs+associated+with+social+behavior+in+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genome scan for cis-regulatory DNA motifs associated with social behavior in honey bees.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 16352-16357 (2006).</li>
<li>Amdam, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+control+of+the+yolk+precursor+vitellogenin+regulates+immune+function+and+longevity+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Hormonal control of the yolk precursor vitellogenin regulates immune function and longevity in honeybees.</a> Exp. Gerontol. 39, 767-773 (2004).</li>
<li>Wang, Q. C., Nie, Q. H., Feng, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference%3A+antiviral+weapon+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">RNA interference: antiviral weapon and beyond.</a> World J. Gastroenterol. 9, 1657-1661 (2003).</li>
<li>Carmell, M. A., Xuan, Z., Zhang, M. Q., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Argonaute+family%3A+tentacles+that+reach+into+RNAi%2C+developmental+control%2C+stem+cell+maintenance%2C+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis.</a> Genes Dev. 16, 2733-2742 (2002).</li>
<li>Hunt, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+genomics+of+honeybee+foraging+and+nest+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Behavioral genomics of honeybee foraging and nest defense.</a> Naturwissenschaften. 94, 247-267 (2007).</li>
<li>Pankiw, T., Waddington, K. D., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+sucrose+response+thresholds+in+honey+bees+%28Apis+mellifera+L.%29%3A+influence+of+genotype%2C+feeding%2C+and+foraging+experience%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Modulation of sucrose response thresholds in honey bees (Apis mellifera L.): influence of genotype, feeding, and foraging experience.</a> J. Comp. Physiol. A. 187, 293-301 (2001).</li>
<li>Pankiw, T., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pheromones%2C+hormones%2C+and+handling+on+sucrose+response+thresholds+of+honey+bees+%28Apis+mellifera+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A.+Neuroethol.+Sens.+Neural.+Behav.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.).</a> J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 189, 675-684 (2003).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

Nuestro estudio es el primer intento de tumbar al mismo tiempo dos genes en los insectos adultos. Nuestros resultados muestran que las dos estrategias de dsRNA inyecciones (inyección única y de inyección de dos días) son eficaces para la supresión génica doble, simultánea y silenciamiento de los genes de VG y la USP pueden ser probados 6 días después de las inyecciones de dsRNA en abejas 8,9. Sin embargo, el gen de la eficacia caída varía en las diferentes especies de insectos según el nivel...

Interferencia de ARN (ARNi) es basado en post-transcripcional silenciamiento génico de ARN, que se produce en una amplia variedad de organismos eucariotas. El proceso de ARNi se desencadena por precursores de ARN de doble cadena endógenos o exógenos (dsRNA). El ARN de doble cadena activa la proteína Dicer ribonucleasa que se une y corta el dsRNA a pequeños fragmentos (20-25 pb). A continuación, los pequeños fragmentos de la guía de dsRNA un reconocimiento y la escisión de los ARNm complementarios por las proteínas Argonaute, un componente de catalizador de complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) 1. En los mamíferos, ARN de doble cadena de más de 30 nt, activan una respuesta antiviral (respuesta de interferón, IFN) que conduce a la degradación no específica de transcripciones de ARN 2. Sin embargo, ARN de doble cadena larga han demostrado ser eficaces y específicos en los insectos ya que existe una falta de este IFN 3. DsRNAs han sido utilizados para la regulación a la baja de los genes diana de diferentes especies de insectos. Las abejas son uno de los pionorganismos de insectos eer en el que las funciones de muchos genes importantes en el desarrollo y el comportamiento se han puesto de manifiesto mediante el uso de ARN de doble cadena 4,5. Varios métodos de entrega dsRNA se han realizado en las abejas melíferas: dsRNA alimentación regula a la baja de manera eficiente expresión del gen diana en la miel larvas de abeja 6, mientras que la inyección de dsRNA es un método eficaz para la caída de genes en embriones de abejas 4 y abejas adultas 7,8. Efectos de derribo Gene exhibidos por la aplicación de dsRNA a los insectos son transitorios y localizados. Los estudios han demostrado que ambas inyecciones dsRNA abdominales y torácicos inyecciones dsRNA suprimen eficazmente la expresión de genes diana en las células abdominales de grasa corporal de los insectos 9,10. DsRNA se inyecta en las cavidades abdominales y torácicas y las células de grasa corporal son capaces de asumir el dsRNA de la hemolinfa donde las células están bañadas 10. Sin embargo, los genes en otros órganos, como los ovarios y el cerebro, no pueden ser dirigidos por cualquierainyecciones abdominales o torácicas. Con el fin de orientar los genes en la miel de abeja cerebro, también se ha realizado la inyección de dsRNA cerebro, lo que influye efectivamente expresión del gen diana en las zonas locales del cerebro 11. Aquí, sólo documentamos dsRNA inyección abdominal que es más comúnmente utilizado en las abejas adultas. ARNi ha sido utilizado principalmente para llegar a un solo gen y ha sido una herramienta poderosa para revelar la función del gen. Sin embargo, cualquier gen no está aislado de los demás, es en redes reguladoras complejas. Una clave para entender un proceso biológico es diseccionar cómo los genes interactúan entre sí, lo que requiere manipulaciones simultáneas de múltiples genes en lugar de un único gen desmontables. En líneas celulares de mamíferos, los científicos han logrado inhibir simultáneamente dos o tres genes mediante el uso de sistemas de suministro de 12 o multi-microRNA (miRNA) diseños horquilla 13. Pero en los insectos, múltiples caídas de genes todavía no probado. En este sentido, Presenestrategias de inyección diferentes t que puede alcanzar una caída de dos genes. Nos dirigimos a dos genes: vitelogenina (VG) que codifica un precursor de proteína de yema de huevo, y ultraspiracle (USP) que codifica un receptor putativo de la hormona juvenil (JH) y puede servir como un factor de transcripción mediación de las respuestas a JH 14 en las abejas de miel. Vg y JH regulan entre sí en un circuito de retroalimentación 15 y están involucrados en la miel de abeja comportamiento regla 9. Con el derribo de dos genes, nos perturban tanto Vg y las vías de JH, y descubrir cómo afectan conjuntamente comportamiento de las abejas de miel y la fisiología y cómo vg, USP y JH interactúan 9. Percepción gustativa es un predictor del comportamiento de la miel de abeja comportamiento social 16. En términos de desarrollo de comportamiento, las abejas nido con alta percepción gustativa conducta madura rápido, y por lo general forraje temprano en la vida y prefieren recoger el polen 16,17. Aunque m reglamentarioechanisms subyacen a la percepción gustativa aún no están claros, los estudios han demostrado que la percepción gustativa está relacionada con metabolismos energéticos internos 9, la secreción hormonal 18,19 y biogenética amina dirigen a las vías 20. Tanto Vg y JH son importantes reguladores hormonales modulación de la percepción gustativa 7,21. En el laboratorio, una variación de la percepción gustativa en las abejas de miel puede ser evaluada probando la respuesta de extensión proboscis (PER) a diferentes soluciones de sacarosa. Cada abeja se prueba tocando tanto sus antenas con una gotita de agua, seguido por una serie ascendente concentración de 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% de sacarosa. Una respuesta positiva se observó si una abeja se extiende completamente sus trompa cuando una gota de agua o sacarosa se toca para cada antena. Basado en el número de respuestas positivas a las soluciones, el nivel de la percepción gustativa de cada individuo se puede determinar 16. Sin embargo, la aplicación del POR no está limitada a la medición de gpercepción ustatory. El PER es también un método eficaz para poner a prueba el estado metabólico de las abejas, tales como el hambre saciedad vs. Las abejas con una mayor respuesta a la sacarosa tienen más hambre en general (Wang y Amdam, datos no publicados). Por otra parte, el paradigma POR también se puede utilizar en el aprendizaje y la memoria asociativa en las abejas de miel. En este caso las abejas serán entrenados para asociar la presencia de agua de sacarosa con un olor. Cuando las abejas aprenden la asociación, sólo la presencia del olor puede evocar una respuesta positiva trompa sin recompensar con la sacarosa 22,23. En este vídeo, se muestra cómo realizar PER para evaluar la percepción gustativa que se ha conectado con vg y usp doble caída en un estudio anterior 9.

<table><tbody><tr><td>Bolas de PCR de GE Healthcare en placa de 96 pocillos</td><td>GE Healthcare</td><td>27-9557-01</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR kit de purificación</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>RiboMax T7 Sistema de producción de ARN</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td></td></tr><tr><td>Trizol LS</td><td>Invitrogen</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo:Alcohol isoamílico 24:1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>alcohol isopropílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Micro jeringa Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>80301</td><td></td></tr><tr><td>30G BD agujas desechables</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Jeringa</td><td>BD Biosciences</td><td>30960</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección estereoscópica</td><td>Leica Microsystems</td><td>S6D</td><td></td></tr><tr><td>Alfileres de insectos</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-25</td><td></td></tr><tr><td>Placa</td><td></td><td></td><td></td> de cera</tr></tbody></table>

rnai mediada doble derribo gene y medición percepción gustativa de las abejas (<em&gt; apis mellifera</em&gt;)

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

Este vídeo muestra novedosas técnicas de interferencia de ARN (RNAi), que regulan negativamente dos genes simultáneamente en las abejas que utilizan inyecciones de ARN de doble cadena (dsRNA). También se presenta un protocolo de respuesta de extensión proboscis (POR) de ensayo para la medición de la percepción gustativa. RNAi mediada desmontables gen es una técnica eficaz disminuyendo la expresión del gen diana. Esta técnica se utiliza generalmente para la sola manipulación genética, pero tiene limitaciones para detectar las interacciones y los efectos conjuntos entre genes. En la primera parte de este video, se presentan dos estrategias para tumbar al mismo tiempo dos genes (llamados genes desmontables dobles). Mostramos ambas estrategias son capaces de suprimir de forma eficaz dos genes, vitelogenina (VG) y ultraspiracle (USP), que están en un bucle de retroalimentación reguladora. Este enfoque caída doble gen se puede utilizar para diseccionar interrelaciones entre los genes y se puede aplicar fácilmente endiferentes especies de insectos. La segunda parte de este video es una muestra de ensayo de respuesta de extensión probóscide (PER) en las abejas de miel después de que el tratamiento de la caída de dos genes. El ensayo PER es una prueba estándar para medir la percepción gustativa de las abejas, que es un indicador clave de la rapidez con la maduración del comportamiento de una abeja es. Mayor percepción gustativa de las abejas nido indica el creciente desarrollo de la conducta que a menudo se asocia con una edad más temprana de inicio de la búsqueda de alimento y forraje especialización en el polen. Además, por ensayo se puede aplicar para identificar estados metabólicos de saciedad o hambre en las abejas de miel. Por último, por ensayo en combinación con el emparejamiento diferentes estímulos de olor para el acondicionamiento de las abejas también es ampliamente utilizado para el aprendizaje y la memoria en los estudios de las abejas de miel.

Tanto los dos días de la inyección estrategias de inyección única y redujeron significativamente vg (One-way ANOVA, p &lt;0.001) (Figura 2A) y USP (One-way ANOVA, p &lt;0.001) (Figura 2B), los niveles de transcripción en las abejas de miel seis días después de la dsRNA se inyectó. La supresión de la USP transcripción mediante el uso de la inyección única con la mezcla de ARN de doble cadena y la inyección de dos días con VG primera y segunda USP (...

En este protocolo, se describen dos estrategias que simultáneamente suprimen dos genes (genes desmontables doble) en las abejas de miel. A continuación te presentamos cómo utilizar la respuesta de extensión probóscide (PER) de ensayo para estudiar el efecto de la caída de dos genes de la miel de abeja percepción gustativa.

RNAi mediada Doble derribo Gene y medición percepción gustativa de las abejas (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

Este protocolo en video demuestra técnicas novedosas para silenciar simultáneamente dos genes en abejas melíferas adultas y luego realizar un ensayo de respuesta de extensión del probóscide o PER para medir el efecto del silenciamiento doble de genes sobre la percepción gustativa de las abejas. Esto se logra primero mediante la síntesis de ARN bicatenarios, dirigidos contra los genes que codifican tres proteínas: vitelina, genina, ultras, esférica y la proteína verde fluorescente.Dado que el gen que codifica la GFP no se encuentra en el genoma de la abeja melífera, el ARN bicatenario de GFP sirve como control negativo. El segundo paso consiste en inyectar ARN bicatenario en abejas melíferas utilizando cuatro estrategias de tratamiento. Inyección con ARN bicatenario de GFP, solo ARN, una inyección única con una mezcla de ARN bicatenario de VG y USP, inyección con ARN bicatenario de vg el primer día, seguida de inyección con ARN bicatenario de USP el segundo día, e inyección con ARN bicatenario de USP el primer día, seguida de inyección con ARN bicatenario doble de VG el segundo día. Después de las inyecciones, se marcaron las abejas con puntos de pintura codificados por colores corr

rnai-mediated-double-gene-knockdown-gustatory-perception-measurement

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Se demuestra cómo utilizar la técnica de alimentación RNAi para derribar los genes diana y el fenotipo puntuación en el tamaño del...

El uso de ARN de interferencia mediada estrategia de alimentación para la detección de genes implicados en la regulación del cuerpo Tamaño del nematodo<em&gt; C. elegans</em

ARN de interferencia (RNAi) basados ​​en técnicas de genes desmontables son el núcleo de la investigación Tribolium. Aquí, ofrecemos una visión general de nuestra técnica de RNAi larval en Tribolium castaneum. Larval RNAi es una técnica sencilla, pero de gran alcance que proporciona un acceso rápido a los fenotipos de pérdida de función, lo que permite a los investigadores estudiar las funciones de genes en diversos contextos.

La interferencia de ARN de las larvas en la Red Escarabajo de Harina, Tribolium castaneum

El uso de dos métodos para estimar la expresión génica en las principales apéndices gustativas de Aedes aegypti, hemos identificado el conjunto de genes supuestamente subyacentes a las respuestas neuronales a compuestos amargos y repulsivas, como se determina por examen electrofisiológico.

Fisiológicos Grabaciones y RNA Secuenciación de los apéndices gustativas del mosquito de la fiebre amarilla Aedes aegypti

Aquí se describe un procedimiento para inhibir la función génica en los mosquitos vectores de enfermedades mediante el uso de quitosano / interferir nanopartículas de ARN que son ingeridas por las larvas.

El quitosano / ARN de interferencia mediada por nanopartículas silenciamiento génico en la enfermedad vectorial larvas de mosquitos

Aquí describimos nuestro protocolo detallado para la preparación de las colonias de abejas de un solo cohortes - una herramienta útil para analizar la fisiología trabajador función asociada. También describimos los protocolos detallados para el tratamiento de los trabajadores con la hormona juvenil y ecdisona para evaluar la participación de estas hormonas en la regulación del comportamiento de los trabajadores y / o fisiología.

Preparación de colonias individuales-cohortes y tratamiento con hormona del trabajador abejas para analizar la fisiología asociada con clases, y / o Sistema Endocrino

A continuación, presentamos los protocolos para la crianza de un escarabajo intermedia de gérmenes, Dermestes maculatus (D. maculatus) en el laboratorio. También compartimos protocolos para RNAi embrionario y de los padres y los métodos para el análisis de los fenotipos de embriones para estudiar la función de genes en esta especie.

La cría y el doble-stranded RNA mediada gen desmontables en el Hide Escarabajo, Dermestes maculatus

Este artículo muestra nuevas técnicas desarrolladas para la entrega oral de ARN bicatenario (dsRNA) a través de los tejidos vasculares de las plantas para ARN de interferencia (ARNi) en la savia del floema insectos.

Double-stranded RNA Oral entrega métodos para inducir la interferencia de ARN en floema e insectos Hemipteran alimentación planta de sap

Aquí se presenta un protocolo para utilizar el sistema CRISPR-Cas9 para reducir la producción de una proteína en el cerebro adulto de abeja sellos para probar la especificidad de anticuerpos.

Pruebas de anticuerpos anti-RDL y anti-mGlutR1 en secciones de cerebro de abeja con CRISPR-Cas9

La interferencia de ARN es una técnica ampliamente aplicable y poderosa para manipular la expresión génica en etapas específicas del desarrollo. Aquí, describimos los pasos necesarios para implementar esta técnica en el escarabajo de buceo acuático Thermonectus marmoratus,desde la adquisición de secuencias genéticas hasta el derribo de genes que afectan la estructura o el comportamiento.

Interferencia de ARN en los escarabajos acuáticos como una poderosa herramienta para manipular la expresión génica en puntos de tiempo de desarrollo específicos

Aquí, se describen los métodos para las inyecciones pupales y adultos eficientes en Nasonia vitripennis como alternativas accesibles a la microinyección embrionaria, lo que permite el análisis funcional de los genes de interés utilizando ya sea arn-silenciamiento a través de la interferencia de ARN (RNAi) o knockout gen a través de CRISPR / Cas9 edición del genoma.

Inyecciones pupales y para adultos para RNAi y edición de genes CRISPR en Nasonia vitripennis

Este protocolo fue desarrollado para mejorar la comprensión de cómo los agroquímicos afectan la reproducción de lasabejas melíferas (Apis mellifera)mediante el establecimiento de métodos para exponer a las reinas de las abejas melíferas y sus cuidadores trabajadores a los agroquímicos en un entorno controlado y de laboratorio y monitoreando cuidadosamente sus respuestas relevantes.

Evaluación del riesgo agroquímico para las reinas de abejas melíferas apareadas

Aprende a realizar el doble derribo génico en abejas melíferas y medir la percepción gustativa mediante el ensayo PER. Este método permite estudiar la función génica en redes regulatorias del comportamiento.

RNAi mediada Doble derribo Gene y medición percepción gustativa de las abejas (

Explorar más videos