Name: Preparación de la proteína de recombinación Mgm101 por Estrategia de etiquetas MBP basado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Aprende a preparar la proteína Mgm101 de levadura mediante una estrategia de etiquetado con proteína de unión a maltosa y cromatografía de intercambio catiónico. Este método produce anillos oligoméricos homogéneos para estudios bioquímicos.

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Damos las gracias a Stephan Wilkens para la ayuda en la microscopía electrónica de transmisión. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de la concesión R01AG023731 Salud.

Estudios previos han demostrado que los primeros amino-terminal de 22 residuos de Mgm101 se escinden después de la importación en mitocondrias 19. Para la expresión en Escherichia coli, el marco de lectura abierto MGM101 carece de los primeros 22 codones se amplifica por PCR y se coloca aguas abajo de la secuencia de malE que codifica la proteína de unión a maltosa (MBP) en una versión modificada del vector de expresión pMAL-c2E. Esto genera la fusión MBP-Mgm101 con un enlazador que contiene un sitio de escisión para la proteasa PreScission (Figura 3). El plásmido se construyó por primera vez por la selección de E. transformantes de E. coli sin IPTG y selección azul / blanco Xgal. El plásmido pMAL-c2E-MGM101 resultante se introduce luego en la E. coli cepa BL21-CodonPlus (DE3)-RIL mediante la selección de colonias resistentes a la ampicilina y cloranfenicol. 1. Expresión, Inducción, lisis celular y DNasa I tratamiento <ol><li> INOCular transformantes frescos en 10 ml de medio LB (1% de Bacto triptona, extracto de levadura al 0,5%, 1% de NaCl) suplementado con glucosa (0,2%), ampicilina (100 mg / ml) y cloranfenicol (50 mg / ml). Incubar a 37 ° CO / N con agitación a 200 rpm. </li><li> Inocular el precultivo 10 ml en 2 litros del medio LB suplementado como anteriormente. Cultivar las células a 37 ° C con agitación hasta una DO600 alcanza 0,5. </li><li> Inducir la expresión de la proteína de fusión MBP-Mgm101 mediante la adición de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 0,3 mM. Cultivar las células con agitación a 30 ° C durante 5 h. </li><li> Recoger las células por centrifugación usando un JA-10 rotor Beckman (5500 xg, 4 ° C, 10 min). Después de desechar el sobrenadante, resuspender el sedimento celular en 30 ml de tampón de lisis (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4 y EDTA 1 mM, pH 7,4) que contiene inhibidores de la proteasa (leupeptina 25 mM, pepstatina A 1 mM y PMSF 1 mM). </li><li> Someter a ultrasonidos suspensión de células en hielo durante 20seg usando un procesador ultrasónico (Heat Systems, Modelo W-385) en el ciclo de trabajo del 50%, se deja enfriar en hielo durante 30 seg, y repetir 2x. </li><li> Añadir 1 ml de DNAsa 1 stock a 2 mg / ml. Oscilar el lisado de células a 4 ° C durante 2 horas. </li><li> Ajuste de NaCl a una concentración final de 500 mM. </li><li> Eliminar los restos celulares por centrifugación a 10.000 xg a 4 ° C durante 30 min. </li></ol> 2. La purificación con cromatografía de afinidad de amilosa <ol><li> Equilibrar 1,5 ml de resina de amilosa (50% suspensión) en el tampón de lisis. Añadir la resina de amilosa equilibrada para el lisado de células. Agite suavemente a 4 º CO / N. </li><li> Cargar la mezcla de lisado-resina en una columna de cromatografía de columna Econo-instalado en una habitación fría. Permita que las proteínas no unidas a pasar la columna por gravedad. </li><li> Lavar la resina de amilosa con 300 ml del tampón de lavado I (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4; 400 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, pH 7,4, y 0,2 mM PMSF). </li><li> Repetir el lavado con 150 ml de tampón de lavado II (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4; NaCl 200 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4, y 0,2 mM PMSF). </li><li> Añadir 5 ml de tampón de elución (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, pH 7,4, y 0,2 mM de PMSF, 10 mM de maltosa) a la columna, incubar a 4 ° C durante 10 min, recoger el efluente y repita para más veces. </li><li> Combinar los eluatos, determinar el rendimiento y la pureza de MBP-Mgm101 mediante la carga de una parte alícuota del eluido en un gel de SDS-PAGE seguido de tinción con Coomassie (Figura 4). </li></ol> 3. PreScission escisión de la proteasa y Cromatografía de intercambio catiónico <ol><li> Añadir 50 unidades de proteasa PreScission al eluato MBP-Mgm101. Realizar la escisión en 4 ° CO / N y permitir que continúe durante la diálisis contra el tampón de diálisis (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM de NaCl; DTT 2 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4, y 0,2 mM PMSF) </li><li> Controlar la eficacia de la escisión en un gel de SDS-PAGE (Figura 5A). </li><li> Cargue el troceados MBP-Mgm101 por múltiples inyectariones en un cartucho Mini Macro-Prep High S Bio-Escala conectados a un sistema de FPLC de doble paso biológica Bio-Rad. </li><li> Iniciar la cromatografía de intercambio catiónico mediante la aplicación de un gradiente de paso de sal de 5 mM, 300 mM, 500 mM, 750 mM y 1,000 mM de NaCl que se crea mediante la mezcla de tampón A (5 mM de NaCl, 10 mM de fosfato de Na, pH 7,2; 1 mM PMSF) y Tampón B (NaCl 1 M, 10 mM de fosfato de Na, pH 7,2; 1 mM de PMSF). Establecer la velocidad de flujo a 0,5 ml / min. Recoger la fracción Mgm101 y comprobar la pureza de la proteína en un gel de SDS-PAGE (Figura 5B). </li></ol> 4. Cromatografía de Exclusión de Tamaño <ol><li> Combinar las fracciones de proteínas de cromatografía de intercambio catiónico. Dializar la proteína en el tampón de equilibrado GF (MOPS 20 mM, pH 7,0; NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4; 5 mM 2-mercaptoetanol 0,2 mM PMSF). </li><li> Se concentra la proteína con columna de centrifugación de ultrafiltración Vivaspin 15R para reducir el volumen a ~ 1 ml por centrifugación a 3000 xg a 4 ° C. </li><li> Cargar Mgm101 ona calibrado Superose 6 prep columna grado equilibrada con el tampón de cromatografía (20 mM MOPS, pH 7,0, 150 mM NaCl, 5 mM de β-mercaptoetanol, 1 mM EDTA, pH 7,4; 0,2 mM PMSF). </li><li> Iniciar la exclusión por tamaño con el tampón de cromatografía se ejecute a una velocidad de flujo de 0,5 ml / min. </li><li> Reunir las fracciones de los purificados Mgm101 picos. Cargar alícuotas de las fracciones en un 12% SDS-PAGE para comprobar la calidad final de la proteína. </li><li> Concentrado de la proteína con Vivaspin 6, a continuación, congelar rápidamente las muestras en N2 líquido y se almacena a -80 ° C. </li><li> Usa los Mgm101 muestras dentro de 6-12 meses para el ensayo de unión al ADNmc (Figura 8) y para la visualización estructural por microscopía electrónica de transmisión (Figura 9). </li></ol>

<ol><li>San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+eukaryotic+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of eukaryotic homologous recombination.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).</li>
<li>Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMC1%3A+a+meiosis-specific+yeast+homolog+of+E.+coli+recA+required+for+recombination%2C+synaptonemal+complex+formation%2C+and+cell+cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression.</a> Cell. 69, 439-456 (1992).</li>
<li>Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad51+protein+involved+in+repair+and+recombination+in+S.+cerevisiae+is+a+RecA-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein.</a> Cell. 69, 457-470 (1992).</li>
<li>Passy, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Dmc1+protein+binds+DNA+as+an+octameric+ring%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).</li>
<li>Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+E.+coli+recA+protein+monomer+and+polymer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer.</a> Nature. 355, 318-325 (1992).</li>
<li>Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+structure+and+dynamics+in+the+helical+filaments+formed+by+RecA+and+Rad51+on+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).</li>
<li>Conway, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+Rad51+filament%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a Rad51 filament.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).</li>
<li>Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+allele+of+RAD52+that+causes+severe+DNA+repair+and+recombination+deficiencies+only+in+the+absence+of+RAD51+or+RAD59%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59.</a> Genetics. 153, 1117-1130 (1999).</li>
<li>Bai, Y., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rad52+homolog+is+required+for+RAD51-independent+mitotic+recombination+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).</li>
<li>Paques, F., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathways+of+recombination+induced+by+double-strand+breaks+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).</li>
<li>Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+novel+recombinases+in+bacteriophage+genomes+unveils+Rad52%2C+Rad51+and+Gp2.5+remote+homologs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs.</a> Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).</li>
<li>Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+structure+and+quaternary+organization+of+the+bacteriophage+P22+Erf+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein.</a> J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).</li>
<li>Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rings+and+filaments+of+beta+protein+from+bacteriophage+lambda+suggest+a+superfamily+of+recombination+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).</li>
<li>Ploquin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+basis+for+a+bacteriophage+homolog+of+human+RAD52%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52.</a> Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).</li>
<li>Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MGM101%2C+a+nuclear+gene+involved+in+maintenance+of+the+mitochondrial+genome+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).</li>
<li>Meeusen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mgm101p+is+a+novel+component+of+the+mitochondrial+nucleoid+that+binds+DNA+and+is+required+for+the+repair+of+oxidatively+damaged+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA.</a> J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).</li>
<li>Mbantenkhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mgm101+is+a+Rad52-related+protein+required+for+mitochondrial+DNA+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination.</a> J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).</li>
<li>Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+properly+configured+ring+structure+is+critical+for+the+function+of+the+mitochondrial+DNA+recombination+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mgm101.+J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein.</a> Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).</li>
<li>Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+core+of+the+mitochondrial+genome+maintenance+protein+Mgm101p+in+Saccharomyces+cerevisiae+determined+with+a+temperature-conditional+allele%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele.</a> FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).</li>
<li>Itoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+packaging+proteins+Glom+and+Glom2+coordinately+organize+the+mitochondrial+nucleoid+of+Physarum+polycephalum%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum.</a> Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).</li>
<li>Janicka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+RAD52-like+single-stranded+DNA+binding+protein+affects+mitochondrial+DNA+repair+by+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination.</a> Plant J. 72, 423-435 (2012).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Ha sido un reto para producir una proteína estable, nativo recombinante Mgm101 de E. coli posiblemente debido a su insolubilidad en células bacterianas. En este informe, muestran que la estrategia de fusión MBP permite que la proteína que se expresa en un nivel razonablemente alto. Mediante el uso de tinción negativa microscopía electrónica de transmisión y cromatografía de exclusión por tamaño, hemos demostrado previamente que la proteína de fusión MBP forma oligómeros uniformes in vitro 18.</sup...

La recombinación homóloga es importante para la reparación de doble filamento se rompe (DSBs) y enlaces cruzados, y para la reiniciación de la replicación del ADN a partir de horquillas de replicación se derrumbó 1. En la recombinación homóloga convencional, el centro de reacción es catalizada por las recombinasas dependientes de ATP incluyendo RecA en procariotas, y Rad51 y Dmc1 en eucariotas 1-3. Estas recombinaciones forman nucleoprotein filamentos en ssDNA, que son esenciales para iniciar la búsqueda de homología y el capítulo invasión dentro de moldes de ADN dúplex (Figura 1, panel izquierdo) 4-7. Además del esquema convencional, la recombinación homóloga también puede tener lugar de una manera RecA/Rad51-independent (Figura 1, panel derecho). Por ejemplo, las proteínas de levadura Rad52 y Rad59 pueden catalizar directamente la hibridación de cadenas de ADNmc complementarias que están expuestos por resección de roturas de ADN de doble cadena. Este proceso de recombinación, conocido como cantarle línea de recocido, por lo general no implica homóloga de emparejamiento con las plantillas de ADN de doble cadena. Después del recocido, colas heterólogas se eliminan por exonucleasas y mellas se ligan para restaurar la continuidad del genoma 8-10. Reparación por el mismo mecanismo de recocido capítulo suele ir acompañada de las supresiones de secuencias genómicas entre las regiones directamente repetidas. Rad52 pertenece a un grupo diverso de proteínas de recombinación que son muy extendida entre bacteriófagos 11. Estas proteínas también se conocen como proteínas individuales de recocido Strand (SSAP), sobre la base de su actividad en la promoción de la hibridación de moléculas de ADN homólogas de cadena sencilla. Los mejores SSAP bacteriófagos son caracterizados Redβ y Erf del bacteriófagos λ y P22, RecT del profago rac y la proteína Sak del fago lactococcal UL36. Los SSAP se caracterizan estructuralmente por un típico pliegue β-β-β-α, aunque similitud es prácticamente indetectablepoder en sus secuencias primarias. Todos ellos forman grandes anillos homo-oligómeros de 10-14 simetría veces in vitro 12-14. Las consecuencias funcionales de la organización estructural de orden superior característica no se entiende bien. Estamos interesados ​​en la comprensión del mecanismo de la recombinación homóloga en el genoma mitocondrial. Anteriormente hemos identificado el gen MGM101 que es esencial para el mantenimiento de ADNmt en Saccharomyces cerevisiae 15. MGM101 posteriormente se encontró que se asocia con nucleoides mitocondriales y es necesario para la tolerancia de ADNmt a los agentes que dañan el ADN 16. Sin embargo, el estudio de Mgm101 ha sido muy limitado en la última década por la dificultad para producir Mgm101 recombinante. Hemos tenido éxito recientemente en la producción de Mgm101 soluble en grandes cantidades a partir de E. coli mediante la estrategia de fusión MBP. Esto nos ha permitido demostrar que Mgm101 accionessimilitudes bioquímicas y estructurales con la Rad52-familia de proteínas 17,18. En este informe, se describe un procedimiento de purificación de tres etapas, que produce los análisis bioquímicos y estructurales Mgm101for homogéneos (Figura 2).

<table><tbody><tr><td>Vector de expresión pMAL-c2E</td><td>New England Biolabs</td><td>#N8066S</td><td></td></tr><tr><td>PreScission Proteasa</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>#27-0843-01</td><td></td></tr><tr><td>BL21-CodonPlus(DE3)-RIL</td><td>cells Strategene</td><td>#230245</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Roche Ciencia Aplicada</td><td>#11034626001</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatina</td><td>Roche Ciencia Aplicada</td><td>#11359053001</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)</td><td>Roche Applied Science</td><td>#10837091001</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma</td><td>#DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &#946;-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)</td><td>Roche Applied Science</td><td>#11411446001</td><td></td></tr><tr><td>Resina de amilosa</td><td>New England Biolabs</td><td>#E8021L</td><td></td></tr><tr><td>Columna de cromatografía Econo-Column</td><td>BIO-RAD</td><td>#7372512</td><td></td></tr><tr><td>Cartucho Bio-Scale Mini Macro-Prep High S (1 ml)</td><td>BIO-RAD</td><td>#732-4130</td><td></td></tr><tr><td>VIVASPIN 15R Columna de centrifugación de ultrafiltración (10.000 MWCO)</td><td>Sartorius Stedium</td><td>#VS15RH02</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 columna de grado de preparación</td><td>Amersham Bioscirnces</td><td>#17-0489-01</td><td></td></tr><tr><td>VIVASPIN 6 Columna de centrifugación de ultrafiltración (5.000 MWCO)</td><td>Sartorius Stedium</td><td></td><td></td>#VS0611</tr></tbody></table>

preparación de la proteína de recombinación mgm101 por estrategia de etiquetas mbp basado

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

El gen MGM101 se identificó hace 20 años por su papel en el mantenimiento de ADN mitocondrial. Los estudios de varios grupos han sugerido que la proteína Mgm101 está implicado en la reparación de recombinación de ADN mitocondrial. Recientes investigaciones han indicado que Mgm101 se relaciona con la familia de proteínas de recombinación de tipo Rad52. Estas proteínas forman grandes anillos de oligómeros y promueven la hibridación de moléculas de ADN homólogas de cadena sencilla. Sin embargo, la caracterización de Mgm101 se ha visto obstaculizada por la dificultad en la producción de la proteína recombinante. Aquí, se describe un procedimiento fiable para la preparación de Mgm101 recombinante. Proteína de unión a maltosa (MBP)-etiquetados Mgm101 se expresa primero en Escherichia coli. La proteína de fusión se purificó inicialmente por cromatografía de afinidad de amilosa. Después de ser liberado por escisión proteolítica, Mgm101 se separa de MBP por cromatografía de intercambio catiónico. Monodispersada Mgm101 se obtiene despuéspor cromatografía de exclusión por tamaño. Se obtiene un rendimiento de ~ 0,87 mg de Mgm101 por litro de cultivo bacteriano puede ser obtenido de forma rutinaria. El Mgm101 recombinante tiene un mínimo de contaminación de ADN. Las muestras preparadas se utilizan con éxito para el análisis de imágenes de partículas bioquímicas, estructurales e individuales de Mgm101. Este protocolo también se puede usar para la preparación de otras proteínas de unión al ADN oligoméricas grandes que pueden ser mal plegadas y tóxico para las células bacterianas.

Mgm101 es una proteína Rad52 recombinación relacionada en la mitocondria. Rad52 ha sido ampliamente estudiado por su papel en la recombinación del ADN mitocondrial (Figura 1). Mgm101 recombinante se puede preparar mediante un procedimiento de tres pasos (Figura 2). Esto se ve facilitado por el uso de la estrategia de MBP-etiquetado que permite Mgm101 a ser expresado en una forma soluble y posteriormente liberado de la etiqueta mediante escisión proteolítica (Figura 3). ...

La proteína nucleoide mitocondrial de levadura, Mgm101, es una proteína de recombinación de tipo Rad52 que forma grandes anillos de oligómeros. Un protocolo se describe la preparación Mgm101 recombinante soluble usando la proteína de unión a maltosa (MBP)-etiquetado estrategia junto con intercambio catiónico y cromatografía de exclusión por tamaño.

Preparación de la proteína de recombinación Mgm101 por Estrategia de etiquetas MBP basado

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar proteínas grandes oligoméricas que se unen al ADN, como MGM 1 0 1, utilizando la estrategia de etiquetado con la proteína fijadora de maltosa o etiqueta MVP. Esto se logra primero clonando el marco de lectura abierto de MGM 1 0 1 aguas abajo de MVP en el vector PMLC dos E para su expresión en e coli. Luego, la proteína de fusión M-V-P-M-G-M 1 0 1 se purifica a partir de e coli mediante cromatografía de afinidad AMLO.MGM 1 0 1 se libera de MVP mediante escisión proteolítica y se separa de MVP mediante cromatografía de intercambio catiónico. Finalmente, los anillos de MGM 1 0 1 se purifican hasta homogeneidad mediante cromatografía de exclusión por tamaño. En última instancia, aproximadamente 0,8 miligramos de MGM 1 0 1 soluble.De un litro de cultivo bacteriano se puede utilizar para la caracterización bioquímica y estructural de esta proteína, que es importante para la reparación del ADN en las mitocondrias. La principal ventaja de utilizar una versión marcada con una proteína de unión mortal de MGM 1 0 1 es que esta versión es menos tóxica, más soluble y más estable que la versión sin marca. Como resultado, podemos obtener una e

preparation-mgm101-recombination-protein-mbp-based-tagging

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video describe BiFC-PALM, una combinación de microscopía de localización fotoactivada y complementación de fluorescencia bimolecular, para evaluar las interacciones proteína-proteína. BiFC implica la fusión de dos fragmentos de proteínas fluorescentes con dos proteínas de interés que interactúan. Cuando las dos proteínas interactúan, los fragmentos se acercan, lo que permite que las dos partes se unan y reconstituyan una proteína fluorescente funcional. La fluorescencia de un solo...

Microscopía de localización fotoactivada acoplada a la complementación de fluorescencia bimolecular

Aquí se presenta un método para el uso de tipo I y tipo...

La manipulación genética en<em&gt; Δku80</em&gt; Las cepas de Análisis Genómico Funcional de<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Las metodologías de selección de genes se pueden utilizar para generar ratones transgénicos con alelos knockout, knock-in y marcados.  Aquí, describimos un método mejorado de recombinación en E. coli, que denominamos 'subclonación más inserción', que se puede utilizar para generar rápidamente vectores de orientación génica personalizados.

Subclonación Plus Inserción (SPI) - Un nuevo método recombinería para la rápida construcción de la orientación de genes Vectores

Las interacciones proteína-proteína se visualizan en células con resolución espacial nanométrica mediante la combinación de complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) con microscopía de localización fotoactivada (PALM). Aquí se describe el uso de BiFC-PALM para obtener imágenes de las interacciones Ras-Raf en células U2OS para visualizar la agrupación y difusión a nanoescala de complejos Ras-Raf individuales.

Fotoactivado Localización Microscopía con bimolecular fluorescencia Complementación (BiFC-PALM)

Este informe describe un método bioingeniería para diseñar y construir nuevos factores de empalme artificiales (ASFS) que modulan específicamente el empalme de genes diana en células de mamífero. Este método se puede ampliar para diseñar diversos factores artificiales para manipular otros aspectos del metabolismo del RNA.

Factores artificiales de ingeniería para manipular específicamente empalme alternativo en células humanas

Este estudio describe métodos para la co-expresión mediada por T7 de múltiples genes de un único plásmido en Escherichia coli usando el sistema de plásmido pMGX.

Inducible T7 RNA polimerasa mediada Multigene Expression System, pMGX

El cluster regularmente otro proteínas cortas repeticiones palindrómico/CRISPR asociado 9 (CRISPR/Cas9) sistema proporciona una herramienta prometedora para la ingeniería genética y abre la posibilidad de integración dirigida de los transgenes. Describimos una mediada por homología se terminan uniendo (HMEJ)-estrategia por turnos para ADN eficiente objetivo integración en vivo y dirigida terapias genéticas usando CRISPR/Cas9.

Integración dirigida CRISPR/Cas9-mediada In Vivo mediante una estrategia basada en unirse a final mediada por homología

Este artículo presenta el método de desarrollo, caracterización y seguimiento en tiempo real de la metástasis tumoral en el modelo de pez cebra del neuroblastoma, específicamente en la línea de pez cebra transgénico con sobreexpresión de MYCN y LMO1, que desarrolla metástasis espontáneamente.

Modelo de pez cebra de metástasis de neuroblastoma

La Biotinilación Mejorada por Iluminación Restringida por Localización específica (ALIBi) es un método novedoso activado optogenéticamente desarrollado para marcar y purificar afinidad poblaciones subcelulares de ribosomas para secuenciación posterior y análisis proteómico.

Aislamiento de subpoblaciones subcelulares de ribosomas basadas en biotinilación potenciada por iluminación restringida por etiquetas péptidas específicas de péptidos recombinantes

Charles Taylor y John Marshall explicar la utilidad de los modelos matemáticos para evaluar la eficacia de la estrategia de reemplazo de la población. Conocimiento se da en cómo los modelos computacionales pueden proporcionar información sobre la dinámica de la población de mosquitos y la propagación de elementos de transposición a través de A. gambiae subespecies. Las consideraciones éticas de la liberación de mosquitos modificados genéticamente en la naturaleza se discuten.

La predicción de la eficacia de la estrategia de reemplazo de la población Utilizando modelos matemáticos

Aprende a preparar la proteína Mgm101 de levadura mediante una estrategia de etiquetado con proteína de unión a maltosa y cromatografía de intercambio catiónico. Este método produce anillos oligoméricos homogéneos para estudios bioquímicos.

Preparación de la proteína de recombinación Mgm101 por Estrategia de etiquetas MBP basado

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