Preparación de la proteína de recombinación Mgm101 por Estrategia de etiquetas MBP basado

El objetivo general de este procedimiento es preparar proteínas grandes oligoméricas que se unen al ADN, como MGM 1 0 1, utilizando la estrategia de etiquetado con la proteína fijadora de maltosa o etiqueta MVP. Esto se logra primero clonando el marco de lectura abierto de MGM 1 0 1 aguas abajo de MVP en el vector PMLC dos E para su expresión en e coli. Luego, la proteína de fusión M-V-P-M-G-M 1 0 1 se purifica a partir de e coli mediante cromatografía de afinidad AMLO.

MGM 1 0 1 se libera de MVP mediante escisión proteolítica y se separa de MVP mediante cromatografía de intercambio catiónico. Finalmente, los anillos de MGM 1 0 1 se purifican hasta homogeneidad mediante cromatografía de exclusión por tamaño. En última instancia, aproximadamente 0,8 miligramos de MGM 1 0 1 soluble.

De un litro de cultivo bacteriano se puede utilizar para la caracterización bioquímica y estructural de esta proteína, que es importante para la reparación del ADN en las mitocondrias. La principal ventaja de utilizar una versión marcada con una proteína de unión mortal de MGM 1 0 1 es que esta versión es menos tóxica, más soluble y más estable que la versión sin marca. Como resultado, podemos obtener una expresión elevada de la proteína nativa MGM 1 0 1 en e coli.

Hola, mi nombre es Sarah Vicki. Soy especialista sénior de apoyo a la investigación en el laboratorio del Dr. Jji TEN en la Universidad Médica SUNY Upstate. Mi colega, Wan Wong, y yo demostraremos ahora la expresión y purificación de MGM 1 0 1. Comience a generar la proteína de fusión utilizando PCR para amplificar la secuencia madura del recubrimiento de MGM 1 0 1.

No incluya los primeros 22 residuos amino terminales de MGM 1 0 1, que se sabe que son escindidos. Después de importarse a las mitocondrias, el MGM 1 0 1 amplificado se coloca entonces aguas abajo de la secuencia MAL E, que codifica la proteína de unión a maltosa o MVP en una versión modificada del vector de expresión PM MAL C dos E. Esto genera la fusión M-V-P-M-G-M 1 0 1 con un enlazador que contiene un sitio de escisión para la proteasa de precisión. Primero se construye el plásmido seleccionando transformantes de e coli sin la selección azul-blanco.

El plásmido resultante PLC dos E, MGM 1 0 1, se introduce luego en la cepa de e coli BL dos uno codon plus DE tres RIL, y se cultiva en placas de LB que contienen ampicilina y cloranfenicol. Comience inoculando 10 mililitros frescos de medio LB suplementado con los transformantes de e coli, incubados a 37 grados Celsius durante la noche con agitación a 200 RPM. Al día siguiente, inocule dos litros del medio LB suplementado con 10 mililitros de la precultura.

Cultive las células a 37 grados Celsius con agitación. Cuando la DO 600 alcance 0,5, induzca la expresión de la proteína de fusión M-B-P-M-G-M 1 0 1 añadiendo IPTG a una concentración final de 0,3 milimolar y cultive las células con agitación a 30 grados Celsius durante cinco horas. Después de transcurridas cinco horas, transfiera los cultivos a botellas de centrífuga de 500 mililitros y recolecte las células por centrifugación.

Después de desechar el sobrenadante, agregue 30 mililitros de tampón de lisis que contenga inhibidores de proteasas y resuspenda el botón celular pipeteando hacia arriba y hacia abajo. A continuación, someta la suspensión celular a sonicación en hielo durante 20 segundos. Utilizando un procesador ultrasónico con un ciclo de trabajo del 50%, deje enfriar las células en hielo durante 30 segundos.

Luego, repita los pasos de sonicación y enfriamiento dos veces adicionales. Manteniendo la suspensión sobre hielo. Añada un mililitro de dos miligramos por mililitro.

Incube el lisado celular con un stock de ADN a cuatro grados Celsius durante dos horas. Después de transcurridas dos horas, ajuste la concentración final de sal a 500 milimolares añadiendo cuatro mililitros de cloruro de sodio cinco molares a 36 mililitros de lisado.

Luego, para eliminar los restos celulares, centrifugue a 10,000 ×g a cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. En este punto, se puede usar una alícuota de 20 microlitros para monitorear la eficiencia de la lisis por sonicación.

En un gel de página SDS. A continuación, el lisado celular se pasa por una columna de amilosa. Para purificar la proteína de fusión MVP MGM 1 0 1, comience añadiendo 1,5 mililitros de una suspensión al 50 % de resina AMLO a un tubo cónico de 15 mililitros.

Luego, para equilibrarlo, agregue 13 mililitros de tampón de lisis y centrifugue a 2000 ×g durante cinco minutos. Repita este lavado cuatro veces más, luego resuspenda la resina en 0,75 mililitros de tampón de lisis. Agregue la suspensión de AMLO equilibrada al lisado celular y agite suavemente a cuatro grados Celsius durante la noche.

Al día siguiente, cargue la mezcla de lisado y resina de amilosa en una columna de cromatografía de columna econo instalada en una cámara fría. Abra la llave de paso para permitir que las proteínas no unidas pasen a un tubo de recolección mediante filtración por gravedad. A continuación, lave la resina AMLO agregando 300 mililitros de tampón de lavado uno.

Una vez que haya pasado, repita el lavado con 150 mililitros del tampón de lavado dos. Después de agregar el tampón Ellucian y recolectar el EIT según se describe en el protocolo del texto, determine el rendimiento y la pureza de M-V-P-M-G-M 1 0 1 cargando una alícuota del EIT en un gel de SDS-PAGE.

Después de que el gel haya corrido, realice la tinción con kumasi; debería observarse una única banda principal de aproximadamente 70 kilodalton. Añada 50 unidades de proteasa de precisión a los M-V-P-M-G-M 1 0 1 EITs y colóquelos en un tubo de diálisis con tampón de diálisis. Deje que la escisión continúe durante la noche a cuatro grados Celsius.

Realice una electroforesis en gel SDS-PAGE como antes. Para evaluar la eficiencia de la escisión, una escisión completa debe generar dos bandas de 42 y 28 kilodalton, que corresponden a MVP y MGM 1 0 1, respectivamente. Cargue el MVP MGM 1 0 1 escindido mediante múltiples inyecciones en una columna preparativa macro mini de alta S a escala bio conectada a un sistema FPLC BioRad Biologic DUO flow.

Inicie la cromatografía de intercambio catiónico aplicando un gradiente escalonado de sal de cinco milimolar 300, milimolar 500, milimolar 750 y 1000 milimolar de cloruro de sodio. Esto se crea mezclando el tampón A y el tampón B. Establezca un flujo de 0,5 mililitros por minuto. Recoja fracciones de dos mililitros en un recolector de fracciones; típicamente, el MGM 1 0 1 se eluye a 500 milimolar de sal.

Combine las fracciones correspondientes al pico de MGM 1 0 1 y verifique la pureza de la proteína en un gel SDS-PAGE. El pico de MGM 1 0 1 debe mostrar una sola banda de aproximadamente 28 kilodalton después de combinar las fracciones proteicas procedentes de la cromatografía de intercambio catiónico y dializar la proteína en tampón de equilibrio para GF a cuatro grados centígrados durante la noche. A continuación, transfiera la proteína a una columna centrífuga de ultrafiltración Aveva Spin 15 R y centrifugue a 3000 ×g a cuatro grados Celsius para concentrar la proteína.

Una vez que el volumen se reduzca a aproximadamente un mililitro, cargue MGM 1 0 1 en una columna calibrada de grado preparativo supra seis equilibrada con tampón de cromatografía, e inicie la exclusión por tamaño con el tampón de cromatografía a un flujo de 0,5 mililitros por minuto. Las proteínas oligoméricas grandes eluyen en las primeras fracciones, mientras que las proteínas pequeñas eluyen en las fracciones tardías. Los anillos de MGM 1 0 1 eluyen a aproximadamente 400 kilodaltons.

Recolecte las fracciones de los picos purificados de MGM 1 0 1 utilizando un recolector de fracciones; cargue alícuotas de las fracciones en un gel de SDS-PAGE al 12 % para verificar la calidad final de la proteína. A continuación, concentre la proteína con Aveva. Centrifugue seis veces a 3000 ×g a cuatro grados Celsius.

Luego, congele rápidamente las alícuotas de proteína en tubos de microcentrífuga sumergiéndolos en nitrógeno líquido durante dos minutos. Almacene las muestras a menos 80 grados Celsius durante un período de seis a doce meses. Utilice las muestras de MGM 1 0 1 para el ensayo de unión a ADN de cadena sencilla y para la visualización estructural mediante microscopía electrónica de transmisión.

Los resultados del ensayo de retardo en electroforesis demuestran que el MGM 1 0 1 purificado presenta una actividad de unión robusta al ADN de cadena sencilla. La sonda de ADN de cadena sencilla es retenida de manera creciente en los pozos de un gel nativo de poliacrilamida por el MGM 1 0 1 oligomérico.

Ya que M GM 1 0 1 se añade a una concentración mayor de 400 nanomolar. Estas micrografías electrónicas muestran la organización estructural de orden superior de MGM 1 0 1. El M GM 1 0 1 recién preparado existe como anillos distintos con un diámetro de 20 nanómetros, que pueden revelarse mediante microscopía de transmisión con tinción negativa.

Después de varias semanas de almacenamiento a cuatro grados Celsius, MGM 1 0 1 forma filamentos helicoidales supramoleculares. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en una semana.

Gracias por ver.