4D de imágenes multimodalidad Citrobacter rodentium Las infecciones en ratones

El objetivo general de este procedimiento es monitorear el ciclo de infección cero DUM utilizando tomografía de imagen de luz difusa compuesta con micro TC integrada para crear una película en cuatro D de la infección. Esto se logra preparando primero un inóculo bacteriano bioluminiscente. El segundo paso del procedimiento es infectar a los ratones por sonda oral con cero dunum.

A continuación, se toman imágenes diarias de los ratones infectados utilizando micro TC de luz D, y los pasos finales son reconstruir los datos de micro TC DLI 3D y compilarlos en una película de cuatro D del ciclo de infección. En última instancia, los resultados pueden mostrar el cambio en la distribución y localización de la carga bacteriana a través de las imágenes multimodales de cuatro D de ratones infectados. Dr. James Collins.

Un post-doc en mi laboratorio demostrará el procedimiento hoy: A última hora de la tarde del día antes de la infección, se colocó un frasco criogénico de la cepa IC 180 de cero deum para que se descongele tan pronto como se descongele en una perla criogénica de bacterias a 15 mililitros de libra. Con micina de lata, luego configure el cultivo para que crezca durante la noche a 37 grados Celsius con agitación a 220 RPM. También cultivar 15 mililitros de LB no inoculado para controlar la contaminación media a la mañana siguiente.

Si el control inoculado por la ONU no está turbio, transfiera el cultivo inoculado a un tubo de 50 mililitros y centrifugue a 4.000 rpm durante 10 minutos A cuatro grados centígrados, vuelva a subir el pellet en un volumen de PBS y repita la centrifugación. A continuación, vuelva a suspender completamente las células en 1,5 mililitros de PBS para crear el inóculo bacteriano. Para verificar que el cultivo ICC 180 es bioluminiscente y estimar el número de bacterias, obtenga imágenes del cultivo en el TC del espectro ivus utilizando imágenes de bioluminiscencia de filtro abierto y utilice el ajuste automático en el asistente de imagen viva, 4.3 0.1.

Esto se describe en detalle en un video publicado anteriormente. Para demostrar la infección de ratones con roedor bioluminiscente, infectaremos a un ratón y usaremos un ratón para una infección simulada con PBS. Antes de realizar la infección, anestesiar al ratón con un 3% de flúor utilizando un sistema de anestesia XGI ocho para proporcionar una contención humana mientras la anestesia se afianza completamente.

Mezcle el inóculo bacteriano y extraiga un número conocido de bacterias en 0,2 mililitros en una jeringa para sonda nasogástrica oral. Ahora recupera el primer ratón que infecte agarrándolo firmemente por el pescuezo. Tenga en cuenta que los ratones se agotaron antes de la obtención de imágenes usando la crema detory como se describe en el artículo de texto, empuje la aguja hacia el paladar sobre la lengua y baje por el esófago e inyecte el inóculo bacteriano en el estómago.

Si hay resistencia, no fuerce la aguja porque esto pondrá el inóculo en los pulmones, en su lugar, vuelva a insertar suavemente la aguja. Posteriormente, si el ratón tiene problemas para respirar o caminar, se le debe aplicar la eutanasia para la infección simulada. Sonda nasogástrica de un ratón con 0,2 mililitros de PBS para confirmar que la sonda nasogástrica oral se realizó correctamente.

Tome imágenes de los ratones en la tomografía computarizada del espectro IVUS utilizando imágenes de bioluminiscencia de filtro abierto y utilice la configuración automática en la imagen viva. 4.3 0.1 asistente de imágenes como se describió anteriormente, Delight micro CT implica imágenes ópticas de delight integradas con una micro tomografía computarizada de baja dosis de radiación. Debido a que la dosis se acumula en los animales de cada sesión de imagen, nuestro objetivo es mantener la dosis lo más baja posible.

Debido a estas preocupaciones, se debe llamar a los ratones a la primera señal de síntomas perjudiciales o al final del período de imágenes de micro TC. Para este estudio, optimice los parámetros de la función de exposición automática en la imagen viva 4.3 0.1 para obtener imágenes de luciferasa bacteriana in vivo. Primero seleccione editar, luego preferencias, luego adquisición y luego ventana de exposición automática.

A continuación, seleccione los valores de rango seguidos del tiempo del experimento en segundos y establezca el máximo en 300 segundos. Por último, seleccione el recuento objetivo mínimo seguido de la luminiscencia y establezca este valor en 10.000 recuentos. Una vez que se ha inicializado el sistema, se ha configurado la anestesia y se han revisado los enclavamientos de seguridad de rayos X.

Proceda con la anestesia de un ratón. Utilice un sistema de anestesia XGI eight con un caudal de oxígeno de dos litros por minuto y un 3% de flúor. Con el ratón listo para la creación de imágenes, abra el asistente de creación de imágenes en el software.

Esta herramienta optimiza automáticamente varios parámetros para proporcionar la mejor relación señal/ruido posible para cada filtro de emisión seleccionado. Cuando se lo solicite el asistente de imágenes, incluya los filtros de emisión de cinco sesenta y cinco ochenta seiscientos veinte nanómetros. A continuación, asegúrese de que la microtomografía computarizada de un ratón esté seleccionada y haga clic en adquirir para iniciar la toma de imágenes.

Después de devolver el ratón anestesiado a su jaula, retire la plataforma de imágenes de un ratón de la TC del espectro y desinfecte la plataforma del animal con el gen 1%tri. Nota. Si la plataforma del animal está muy sucia, se puede reemplazar la almohadilla de espuma. Continúe tomando imágenes de los ratones diariamente hasta ocho días después de la infección para generar los datos de imágenes longitudinales.

Los períodos de prueba más largos aumentan la probabilidad de artefactos debido a la exposición acumulativa a la radiación. Para producir reconstrucciones de micro TC de tres luces DD reproducibles de alta calidad, se requieren una serie de pasos. En primer lugar, abra el software de imagen viva, 4.3 0.1 y seleccione Examinar en la ventana de exploración.

Abra la carpeta que contiene los archivos delight micro CT haciendo clic en cargar. Abra el archivo DLI micro CT en el explorador de imágenes vivas. Por ejemplo, ver deum día siete después de la infección.

En la paleta de herramientas, seleccione Topografía de superficie seguido de ratón desnudo. Ajuste el umbral y, a continuación, haga clic en generar superficie. Si la reconstrucción de la superficie se realiza correctamente, se mostrará un contorno de superficie en la ventana de vista 3D.

Para ver la microtomografía computarizada renderizada en la ventana de vista 3D, oculte el contorno de la superficie o disminuya la opacidad de la superficie. Se accede a ambas opciones seleccionando primero Herramientas ópticas 3D. A continuación, anule la selección del objeto de superficie de visualización o ajuste la barra deslizante de opacidad para proporcionar una localización anatómica detallada de la reconstrucción de las tres luces DD.

En referencia al esqueleto del animal, modifique los datos volumétricos 3D. Para ver el esqueleto con un contraste óptimo, haga clic en Herramientas de multimodalidad 3D y ajuste el control deslizante del histograma hacia la derecha hasta que solo los huesos sean claramente visibles. Luego, si aún no está seleccionado, haga clic en histograma logarítmico, invertido de coloración, degradado, calidad de iluminación y eliminación de ruido.

Si lo desea, recorte la imagen para eliminar cualquier estructura no deseada de la reconstrucción 3D de la paleta de herramientas, seleccione Reconstrucción 3D con luz D. Asegúrese de que solo se seleccionen los filtros de cinco sesenta y cinco ochenta seiscientos seis de veinte nanómetros. A continuación, haga clic en Inicio.

Esto abre la ventana de vista previa de datos con las señales de bioluminiscencia filtradas espectralmente del ratón en 2D. Estas señales son umbral automáticamente por el software, pero se pueden ajustar manualmente si es necesario, utilizando las pestañas en la parte inferior del menú. El umbral determina la intensidad mínima de datos que se incluirán como datos en la reconstrucción.

A continuación, en la paleta de herramientas, seleccione la reconstrucción D light micro CT 3D y compruebe las propiedades ópticas. Al hacer clic en la pestaña de propiedades, las propiedades del tejido deben establecerse en tejido de ratón, el espectro de fuente establecido en bacterias. Ahora haga clic en reconstruir para realizar la reconstrucción de la luz D.

La ubicación real de la señal de luz D con un círculo rojo es dentro de la cintura pélvica. Esto es más fácil de interpretar cuando la imagen gira durante la película. Para generar la película DLI micro CT 3D, vaya al menú de herramientas y seleccione Animaciones preestablecidas de animación 3D, eje en sentido contrario a las agujas del reloj y, a continuación, duración total.

Establezca este valor en 10 segundos o 25 fotogramas por segundo. Una vez que la configuración de la animación 3D sea correcta, presione grabar y guarde las reconstrucciones DLI micro CT 3D como archivos VI. Es vital hacer estas reconstrucciones utilizando escenarios idénticos para que sean comparables.

También es importante hacer los vídeos utilizando el mismo número de fotogramas por segundo y la duración total. De lo contrario, el tiempo del video 40 no es homogéneo. En la computadora, abra Windows Live Movie Maker y cree un nuevo archivo.

Inserte las reconstrucciones de micro TC DLI en orden cronológico desde el primer día después de la infección. Con la pestaña de herramientas, agregue subtítulos al inicio de cada vídeo seleccionando el vídeo, seleccionando Inicio y, a continuación, seleccionando Agregar subtítulo. El texto del pie de foto se puede formatear desde la barra de herramientas y la ubicación del pie de foto también es ajustable.

Ahora agregue una página de título haciendo clic en inicio y luego en título. Escriba su título en el cuadro usando la barra de herramientas para formatear el texto. A continuación, guarde el proyecto como un archivo MMP.

Esto es esencial si quieres modificar la película. Finalmente, guarde la película como un archivo WMV desde el menú del creador de películas, seleccione guardar película y elija las cuatro opciones de computadora Los controles son esenciales para una buena técnica. Antes de infectar a los ratones, se determinó que el inóculo bacteriano utilizado era bioluminiscente.

Después de la sonda nasogástrica oral con roedor bioluminiscente, se comprobó si la señal podía observarse en el estómago del animal ilustrada por una punta de flecha blanca y ausente de los pulmones. El mismo ratón se mostrará en ejemplos posteriores de una infección individual. La dentadura cero es un patógeno extracelular confinado a la luz intestinal durante la infección demostrada.

Por lo tanto, se elimina en las heces, que se analizaron para mostrar que la colonización aumenta desde el segundo día hasta el día seis o siete, cuando la infección alcanza su punto máximo diariamente. Se utilizó micro tomografía computarizada de luz D para evaluar la distribución espacial de las bacterias bioluminiscentes dentro de este ratón utilizando el esqueleto como referencia anatómica. Al tercer día, después de la infección, se observaron pequeños focos bioluminiscentes en el colon ilustrados con una flecha azul.

Estos focos mostraron un aumento moderado en la intensidad de la bioluminiscencia al quinto día después de la infección con pocos cambios en la distribución espacial al séptimo día después de la infección, hubo un aumento significativo en la bioluminiscencia y los focos bioluminiscentes se extendieron por todo el colon. Tres reconstrucciones de micro TC con luz DD desde el día uno hasta el octavo después de la infección ilustran la propagación de la infección por serodeum. La infección bacteriana comienza como focos distintos dentro del tracto gastrointestinal proximal.

Al tercer día, la infección se propaga al colon. Durante los días siguientes, los focos de infección se extendieron aún más, creciendo en tamaño y número. La infección alcanza su punto máximo el séptimo día.

Luego, en el octavo día, las colonias se redujeron a dos focos bacterianos distintos en el colon proximal y distal. Esta tecnología permitirá a los investigadores estudiar los mecanismos de colonización e infección bacteriana en tiempo real e investigar la eficacia de las estrategias de intervención.