Name: 4D de imágenes multimodalidad Citrobacter rodentium Las infecciones en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Aprende a monitorear el ciclo de infección de Citrobacter rodentium en ratones mediante tomografía de luz difusa combinada con micro CT. Esta técnica de imagen multimodal 4D permite visualizar la colonización bacteriana en tiempo real.

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El servicio de imágenes en vivo en el Imperial College fue financiado por el MRC.

<ol><li>Chang, M. H., Cirillo, S. L., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Luciferase+to+Image+Bacterial+Infections+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice.</a> J. Vis. Exp. (48), e2547(2011).</li>
<li>Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infect Immun. 74, 5391-5396 (2006).</li>
<li>Wiles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+specificity%2C+colonization+and+clearance+dynamics+in+vivo+following+oral+challenges+with+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Cell Microbiol. 6, 963-972 (2004).</li>
<li>Wiles, S., Dougan, G., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+a+%27hyperinfectious%27+bacterial+state+after+passage+of+Citrobacter+rodentium+through+the+host+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Emergence of a 'hyperinfectious' bacterial state after passage of Citrobacter rodentium through the host gastrointestinal tract.</a> Cell Microbiol. 7, 1163-1172 (2005).</li>
<li>Fanning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifidobacterial+surface-exopolysaccharide+facilitates+commensal-host+interaction+through+immune+modulation+and+pathogen+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Bifidobacterial surface-exopolysaccharide facilitates commensal-host interaction through immune modulation and pathogen protection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2108-2113 (2012).</li>
<li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).</li>
<li>Collins, J. W., et al. Pre-treatment with Bifidobacterium breve UCC2003 modulates Citrobacter rodentium-induced colonic inflammation and organ specificity of infection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCollins%2C+JW+%22Microbiology%22">Microbiology</a>. , 10-1099 (2012).</li>
<li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol. Microbiol. 18, 593-603 (1995).</li>
<li>Hardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+replication+of+Listeria+monocytogenes+in+the+murine+gall+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder.</a> Science. 303, 851-853 (2004).</li>
<li>Szittner, R., Meighen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence%2C+expression%2C+and+properties+of+luciferase+coded+by+lux+genes+from+a+terrestrial+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence, expression, and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium.</a> J. Biol. Chem. 265, 16581-16587 (1990).</li>
<li>Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+antituberculosis+drug+activity+in+vitro+and+in+macrophages+using+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence.</a> J. Antimicrob. Chemother. 67, 404-414 (2012).</li>
<li>Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+in+vivo+bioluminescent+sources+based+on+multispectral+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging.</a> J. Biomed. Opt. 12, 024007(2007).</li>
<li>Cronin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+vivo+bioluminescent+imaging+for+the+study+of+bacterial+tumour+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting.</a> PLoS One. 7, e30940(2012).</li>
<li>Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrobacter+rodentium+of+mice+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Citrobacter rodentium of mice and man.</a> Cell Microbiol. 7, 1697-1706 (2005).</li>
<li>Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+variations+of+skin+pigmentation+in+C57BL%2F6+mice+affect+optical+bioluminescence+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation.</a> Mol. Imaging Biol. 13, 1114-1123 (2011).</li>
<li>Wiles, S., Crepin, V. F., Childs, G., Frankel, G., Kerton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+biophotonic+imaging+as+a+training+aid+for+administration+of+substances+in+laboratory+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Use of biophotonic imaging as a training aid for administration of substances in laboratory rodents.</a> Lab Anim. 41, 321-328 (2007).</li>
<li>Crepin, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+role+of+the+Tir%3ANck+and+Tir%3AIRTKS%2FIRSp53+signalling+pathways+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dissecting the role of the Tir:Nck and Tir:IRTKS/IRSp53 signalling pathways in vivo.</a> Mol. Microbiol. 75, 308-323 (2010).</li>
<li>Willekens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+radiation+dose+in+micro-CT+with+optimization+of+the+scan+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22ContrastMedia+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the radiation dose in micro-CT with optimization of the scan protocol.</a> ContrastMedia Mol. Imaging. 5, 201-207 (2010).</li>
<li>Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-animal+X-ray+dose+from+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Small-animal X-ray dose from micro-CT.</a> Mol Imaging. 3, 149-158 (2004).</li>
<li>Sato, F., Sasaki, S., Kawashima, N., Chino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+effects+of+whole+or+partial+body+x-irradiation+on+mice%3A+life+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Radiat.+Biol.+Relat.+Stud.+Phys.+Chem.+Med%22%5BJournal%5D)">Late effects of whole or partial body x-irradiation on mice: life shortening.</a> Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med. 39, 607-615 (1981).</li>
<li>Kohn, H. I., Kallman, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+strain+on+acute+x-ray+lethality+in+the+mouse.+II.+Recovery+rate+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat.+Res%22%5BJournal%5D)">The influence of strain on acute x-ray lethality in the mouse. II. Recovery rate studies.</a> Radiat. Res. 6, 329-338 (1957).</li>
</ol>

La producción y el libre acceso a este artículo es patrocinado por PerkinElmer. Los autores Kevin P, Francis, Jeff Meganck y Chaincy Kuo son empleados de pinza-A Company PerkinElmer. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los procedimientos científicos Animals Act 1986 y fueron aprobados por el Comité de Ética local.

La película 4D de infección bacteriana es una herramienta útil para visualizar e interpretar grandes cantidades de datos de imágenes multimodalidad rápida y fácilmente. Esta técnica facilita el análisis detallado de cómo una infección se propaga a través de un ratón individual y se puede utilizar para investigar cómo la eliminación de host o genes bacterianos o particular, las estrategias de intervención efecto de la carga bacteriana, la distribución, y la localización durante un estudio longitudinal 7. Estos videos también ofrecen materiales didácticos útiles y un medio de difusión de información al público. Hay varios pasos críticos en este protocolo que podrían afectar a la calidad de los datos obtenidos a partir de imágenes DLIT-μCT y la capacidad para compilar un video 4D de la infección. La parte más importante de este protocolo es el éxito de la infección y homogénea de los ratones con C. rodentium. Es esencial que los ratones utilizados para el estudio son entre 18-20 g y que la bacrial inóculos se preparan y aproximadamente 5 x 10 9 ufc, como se ha descrito previamente 2,3. Antes de la infección de los ratones es importante comprobar que el inóculo es bioluminiscente usando el espectro CT y una vez que el inóculo se ha preparado, que debe ser homogeneizada continuamente delante de cada ratón se gavaged para asegurar que los ratones reciben dosis infecciosas similares. La imagen DLIT-μCT de los ratones se ha optimizado para que la función de exposición automática en el software 4.3.1 Imagen Living determina automáticamente los parámetros de imagen óptimos para la señal de estar bien por encima del ruido. Sin embargo, la función de exposición automática se basa en la configuración y los parámetros definidos por el usuario que necesitan ser modificados como se describe en el procedimiento. De no hacerlo, dará lugar a imágenes de baja calidad con un bajo número de fotones recogidos que no den lugar a una progresión evidente en la infección, como los ajustes de fábrica del Spectrum CT de exposición automática se programan para los tumores que expresan imágenesla luciferasa de luciérnaga. Reconstrucciones realizaron con 560 a 620 nm dan la mejor concordancia entre los datos simulados y medidos y, por lo tanto, son los datos más fiables para incluir en la reconstrucción. Una limitación al uso de DLIT-μCT es que la radiación ionizante de la exploración μCT provoca daño de la radiación subletal que es acumulado en un estudio longitudinal 18. Exposición a la radiación subletal puede debilitar la respuesta inmune, provocar daños en el ADN, y la apoptosis en los órganos internos 19. En última instancia, daños por radiación subletal acumulada puede causar la muerte si la DL 50/30 para la radiación ionizante se excede, que está entre 5 y 7 Gy dependiendo de la cepa de ratón y la edad de los ratones utiliza 18,20,21. Aunque algunos de los daños molecular de las radiaciones ionizantes puede curar, ya que el principio general es el de estimar la dosis de forma conservadora, esto no suele ser contabilizada en la planificación del estudio. En cambio, el objetivo es mantenerse lo más below estos límites como sea posible al tiempo que el cumplimiento de los objetivos del estudio. Esto es particularmente importante en este estudio debido a la respuesta inmune normal a la infección, la frecuencia de formación de imágenes, y el hecho de que transgénico, inmuno-compuesto, o muy infectado animales pueden ser más susceptibles a la radiación ionizante. Al planificar el experimento para generar una película 4D de la infección, es importante tener en cuenta la longitud del experimento, el número de μCT escanea requerido durante este periodo y la DL 50/30 para la radiación ionizante para la cepa de ratón que está siendo utilizado. Otra limitación potencial de DLIT-μCT es la fuerza de la expresión del indicador dentro de la cepa bacteriana utilizada, ya que esto afectará límites de detección bacterianas y los tiempos de formación de imágenes. Es muy recomendable que los investigadores utilizan validados cepas bacterianas que son totalmente virulento, pero optimizado para máxima operón lux expresión, como se ha demostrado previamente para BLI2,3. Una advertencia para el diseño actual de la formación de imágenes 4D es que cada película se compone de exploraciones DLIT-μCT individuales que tienen diferente escala de fotones. Esto puede hacer que las imágenes difíciles de interpretar si los cambios en la localización de la BL focos, o su intensidad son sutiles, o si hay un foco BL intensa rodeada por múltiples focos débil. Por lo tanto, para visualizaciones longitudinales, es importante para mantener las barras de color consistente a través de los puntos de tiempo. El concepto de una película 4D de la infección se puede aplicar a cualquier patógeno bacteriano convenientemente etiquetado. El desarrollo futuro de esta técnica tendrá como objetivo utilizar la tomografía de imágenes de fluorescencia (FLIT), así como DLIT para facilitar la investigación de las respuestas del huésped a la infección usando una combinación de patógenos bacterianos y bioluminiscentes inyectables sondas fluorescentes cerca de infrarrojos para investigar las respuestas del huésped a la infección. Además de esto, en este protocolo sólodescriben el uso de bacterias bioluminiscentes para crear películas 4D de la infección. Sin embargo, en algunos casos, puede ser necesario el uso de bacterias marcadas fluorescentes, por ejemplo, etiquetado con IRFP, de modo que el reportero bioluminiscencia se puede utilizar para la investigación genética del huésped durante la infección. Es importante destacar que el uso de imágenes multimodalidad que combina DLIT / FLIT-μCT nos permitirá investigar de manera no invasiva varios parámetros durante una infección bacteriana, lo que contribuirá de manera significativa a la reducción, refinamiento y reemplazo del uso de animales en la investigación científica como se indica en la iniciativa del NC3R ( <a href="http://www.nc3rs.org.uk/" target="_blank">http://www.nc3rs.org.uk/</a> ).

Modelos animales pequeños, en particular, aquellos ratones que utilizan, se utilizan habitualmente para investigar la patogénesis bacteriana o para poner a prueba las estrategias de intervención para las infecciones, tales como antibióticos, probióticos, prebióticos y vacunas 1-7. Los principales lecturas experimentales de infecciones animales pequeños son la carga de patógenos, la localización espacial y temporal de la infección, y los cambios en la respuesta inmune del organismo infectado. En imagen óptica in vivo es una herramienta valiosa para la investigación de enfermedades infecciosas y se pueden utilizar para supervisar múltiples lecturas experimentales mediante el uso de genes informadores (luciferasa, proteínas fluorescentes, beta-lactamasa, etc), colorantes fluorescentes, nanopartículas o sondas quimioluminiscentes dirigidos a una proteína, proceso biológico, o microorganismo 6. Imágenes de bioluminiscencia (BLI) es una modalidad de imagen óptico utilizado para controlar la colonización de los animales pequeños, tales como ratones y ratas, por bac patógenaria 3,6,8,9. Los ratones se infectan con bacterias recombinantes que expresan una luciferasa, tales como el operón lux CDABE de Photorhabdus luminescens. Estas bacterias pueden entonces ser detectados a través de su producción de luz usando un CCD basado en formación de imágenes in vivo del sistema 3,6,9. Es importante destacar que sólo los microorganismos metabólicamente activas son bioluminiscentes (BL), es decir, sólo las células bacterianas viables se detectan mediante esta metodología 10,11. Uso de 2D BLI, la ubicación de la fuente de BL se infiere de la superficie del animal en el que se emitió la señal 8. La localización anatómica exacta de los focos BL in vivo tiene que ser determinada mediante el análisis ex vivo de órganos 3,6,9 En contraste, tomografía compuesto 3D difusa la luz de imagen (DLIT) puede ser utilizado para compilar una reconstrucción 3D cuantitativa de la BL fuente 12. DLIT se lleva a cabo mediante la recopilación de BL imágenes tomadas con filtros ópticos de paso de banda estrecha definidos yposteriormente insertando en ellos una tomografía óptica difusa algoritmo de reconstrucción 3D 1,7,12,13. Actualmente, modalidad de imágenes múltiples es la única metodología disponible para obtener verdadera localización anatómica no invasiva de bioluminiscente focos in vivo sin la necesidad de un análisis ex vivo. Recientemente, se utilizó una combinación de DLIT co-registrado con μCT formación de imágenes para evaluar Citrobacter rodentium (C rodentium) dinámica de colonización después del tratamiento profiláctico con una bacteria probiótica 7. C. rodentium es un patógeno entérico murino específico utilizado para modelar la infección humana por enteropatógenos y enterhemorrhagic Escherichia coli 14. C. infección rodentium causas de la colitis, típicamente asociado con la pérdida leve de peso, diarrea, polarizado respuesta inmune Th1 y cambios patológicos distintos, incluyendo hiperplasia de las criptas del colon y adhesión y borrado lesión formatiel 14. Además de esto, C. patogénesis rodentium se ha estudiado a fondo el uso de BLI y su dinámica de colonización en ratones C57BL/6J están bien documentadas, por lo que esta bacteria un microorganismo modelo ideal para su uso con múltiples modalidades de imagen 3,4,7. Este protocolo es el primero en describir una metodología para la formación de imágenes DLIT-μCT integrado de una infección bacteriana utilizando una única plataforma de formación de imágenes multimodalidad, el IVIS Spectrum CT, y la generación de una película de 4D que muestra la verdadera dinámica de esta infección no invasiva.

<table><tbody><tr><td>Bioluminiscente C. rodentium</td><td>Frankel lab</td><td>ICC180</td><td>Wiles et al., 2004</td></tr><tr><td>Veet</td><td>Boots</td><td>El tiempo óptimo de depilación es de 7 min. La depilación funciona mejor si la crema se frota bien.</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorano (100% v/v)</td><td>Abbott</td><td>B506</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cilindro de oxígeno médico</td><td>BOC Medical</td><td></td><td>Size F. <fuerte>Nota: </fuerte> se requiere un regulador adecuado.</td></tr><tr><td>Caldo Luria Bertani</td><td>Merck</td><td>1.10285.0500</td><td>25 g en 1L de agua desmineralizada.</td></tr><tr><td>Luria Bertani agar</td><td>Merck</td><td>1.10283.0500</td><td>37 g en 1L de agua desmineralizada.</td></tr><tr><td>Sulfato de kanamicina</td><td>Sigma (Fluka)</td><td>60615</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>50 ml Tubos cónicos de polipropileno Falcon</td><td>BD (Falcon)</td><td>352070</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Universales</td><td>Corning (Gosselin)</td><td>E5633-063</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Jeringa de 1 ml</td><td>BD (Plastipak)</td><td>300013</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Aguja dosificadora oral (16G x 75 mm) curvada</td><td>Vet Tech</td><td>DE005</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microbancos (crioviales)</td><td>Pro-Lab Diagnostics</td><td>PL.170/Y</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Calibrador IVIS Spectrum CT</td><td>- a PerkinElmer Company</td><td>133577 Rev A / Spectrum CT</td> <td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Calibrador de UPS de 6 kVA</td><td>: una empresa</td><td></td> <td>PerkinElmer &nbsp;</td></tr><tr><td>Calibre del sistema de anestesia XGI-8</td><td>- a PerkinElmer Company</td><td>118918</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtro de anestesia XAF-8 Calibre de carbón</td><td>- a PerkinElmer Company</td><td>118999/00</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Imagen viviente v4.3.1 SP1</td><td>Caliper- a PerkinElmer Company</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Incubadora vibratoria de sobremesa</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 44</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4"> </td></tr></tbody></table>

4d de imágenes multimodalidad<em&gt; citrobacter rodentium</em&gt; las infecciones en ratones

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Este protocolo describe los pasos necesarios para el seguimiento longitudinal de una infección bacteriana bioluminiscente mediante tomografía 3D compuesta de imágenes con luz difusa integrada μCT (DLIT-μCT) y el uso posterior de estos datos para generar una película del ciclo de infección de cuatro dimensiones (4D). Para desarrollar las películas de infección 4D y para validar la formación de imágenes DLIT-μCT para estudios de infección bacteriana usando un espectro CT IVIS, hemos utilizado la infección con C. bioluminiscente rodentium, que causa colitis espontánea en ratones. En este protocolo, se esboza la infección de ratones con bioluminiscente C. rodentium y la monitorización no invasiva de la colonización por el diario de imágenes DLIT-μCT y enumeración de bacterias de las heces durante 8 días. El uso de la IVIS Spectrum CT facilita la co-registro sin fisuras de las exploraciones ópticas y μCT utilizando una única plataforma de imágenes. La modalidad μCT dosis bajas permite la generación de imágenes de los ratonesen múltiples puntos de tiempo durante la infección, proporcionando localización anatómica detallada de focos de bacterias bioluminiscentes en 3D sin causar artefactos de la radiación acumulativa. Es importante destacar que el cine 4D de ratones infectados proporcionan una poderosa herramienta de análisis para monitorear la dinámica de colonización bacteriana in vivo.

La infección de ratones C57BL/6J con 5 x 10 9 ufc C. rodentium es un modelo de infección bacteriana bien descrita y resulta en una infección gastrointestinal auto-limitante que los picos entre 6-8 días después de la infección y dura entre 3 a 4 semanas 2,14. La infección se limita a la luz intestinal por el sistema inmune murino y, como consecuencia, las bacterias se desprenden continuamente en las heces. La colonización de ratones por C. rodentium se puede controlar de forma no invasiva por enumeración bacteriana directa de las heces, o de formación de imágenes de bioluminiscencia 2,3. Este manuscrito describe un protocolo optimizado para la realización de 3D ​​y 4D de imágenes multimodalidad de C. rodentium dentro de ratones para monitorizar la carga bacteriana y la localización durante la infección. Los resultados presentados en la Figura 1 demuestran los controles que se requieren para el éxito de formación de imágenes 4D. Antes de la infección de los ratones, es esencial para disuadirmina que el inóculo bacteriano utilizado es bioluminiscente (Figura 1A) y que, tras la alimentación forzada oral de un ratón con bioluminiscente C. rodentium, que la señal se puede observar en el estómago del animal y no en los pulmones (Figura 1B) 16. Además de controlar la colonización bacteriana utilizando imágenes de bioluminiscencia, es una buena práctica para cuantificar el número de bacterias en las heces; que se utiliza como una medida indirecta de la colonización bacteriana de la mucosa gastrointestinal Figura 2 demuestra la carga bacteriana típica en las heces tomada de 8 ratones C57BL6 / J. ratones que han sido infectadas con el ~ 5 x 10 9 ufc ICC180 y monitoreados durante 8 días PI aumenta Colonización del día 2 PI hasta el día 6-7, donde los picos de infección en ~ 5 x 10 10 ufc / g, que está en consonancia con los informes anteriores 2,3,17. Para enfatizar la importancia de la evaluaciónting de la propagación de la infección en un solo ratón, Figuras 1b y 3, así como Video 1 se han generado a partir del mismo ratón después de C. rodentium infección, como se describió anteriormente. Diario DLIT-μCT se utilizó para evaluar la distribución espacial de las bacterias bioluminiscentes dentro de este ratón, utilizando el esqueleto como referencia anatómica. Figura 3 demuestra la reconstrucción DLIT-μCT de un ratón C57BL/6J infectado con ICC180 en 3 puntos de tiempo clave PI En día 3 PI pequeña bioluminiscente focos se puede observar en el colon, que exhiben un aumento moderado de la intensidad de bioluminiscencia por 5 días PI con poco cambio en la distribución espacial. En el día 7 PI se observó un aumento significativo en bioluminiscencia y los focos propagación bioluminiscente a través de todo el colon. Video 1 es una recopilación de las reconstrucciones 3D DLIT-μCT de 1-8 días PI con ICC180 e ilustra C.rodentium dentro del tracto gastrointestinal proximal entre 1-2 días PI que se extiende a los dos puntos en el día 3 PI De 4-6 días PI los números de bacterias en el colon se expanden hasta alcanzar un máximo de 7 días PI donde los focos bacteriana cubre todo el colon. En el día 8 PI sólo dos focos distintas de bacterias están presentes en el colon proximal y distal. La posibilidad de ver la reconstrucción en 3D en cada momento en orden cronológico representa una poderosa herramienta para analizar las interacciones patógeno de acogida y es más fácil de interpretar que un 3D aún del mismo conjunto de datos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig1.jpg" /> Figura 1. Bioluminiscencia de imágenes 2D de A) bioluminiscente C. rodentium ICC180 inóculo y B) un ratón después de una sonda oral con 200 l del inóculo. Punta de flecha (&gt;) ilustra bioluminiscente C. rodentium </<html> em&gt; en el estómago. <img alt="La figura 2" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig2.jpg" /> Figura 2. C. dinámica de colonización. rodentium cuantificación de C. rodentium unidades formadoras de colonias de las heces durante 8 días PI <img alt="Figura 3" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3.jpg" /> Figura 3. La luz difusa imagen de tomografía computarizada de μCT bioluminiscente C. infección rodentium de un ratón de un control en el día 3, 5 y 7 PI punta de flecha (&gt;) ilustra la colonización del colon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50450/50450fig3large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . Video 1.p :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver el video. película 4D de la infección por C. rodentium de un ratón controlado de 1-8 días PI

Imágenes multimodalidad es un enfoque valioso para el estudio de la colonización bacteriana en los modelos animales pequeños. Este protocolo describe la infección de ratones con bioluminiscente<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Y el seguimiento longitudinal de la colonización bacteriana mediante tomografía luz difusa 3D compuesto con μCT de imágenes para crear una película de 4D<em&gt; C. rodentium</em&gt; Infección.

4D de imágenes multimodalidad<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Las infecciones en ratones

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

El objetivo general de este procedimiento es monitorear el ciclo de infección por zero DUM mediante tomografía de imágenes difusas compuestas con micro-TC integrada para crear una película en cuatro dimensiones de la infección. Esto se logra primero preparando un inóculo bacteriano bioluminiscente. El segundo paso del procedimiento consiste en infectar ratones por gavaje oral con zero dunum.Los ratones infectados se someten luego a imágenes diarias mediante microtomografía computarizada con luz D, y los pasos finales consisten en reconstruir los datos tridimensionales de microtomografía computarizada DLI y compilarlos en una película tetradimensional del ciclo de infección. En última instancia, los resultados pueden mostrar el cambio en la distribución y localización de la carga bacteriana mediante imágenes multimodales tetradimensionales de ratones infectados. Dr. James Collins.Un postdoctorado en mi laboratorio demostrará el procedimiento hoy. Por la tarde, el día anterior a la infección, saque un vial criogénico de la cepa deum cero IC 180 para que descongele; tan pronto como esté descongelado, añada un gránulo criogénico de bacterias a 15 mililitros de LB con canamicina, luego incube el cultivo durante la noche a 37 grados Celsius con agitación a 220 RPM. Además, cultive 15 mililitros de LB no inoculado al día siguiente por la mañana para controlar la contaminación del medio.Si el control inoculado con UN no es turbio, transfiera la cultura inoculada a un tubo de 50 mililitros y centrifúguela a 4.000 RPM durante 10 minutos. A cuatro grados Celsius, redisuelva el precipitado en un volumen de PBS y repita la centrifugación. Luego, resuspenda completamente las células en 1,5 mililitros de PBS para crear el inóculo bacteriano. Para verificar que la cultura ICC 180 sea bioluminiscente y estimar el número de bacterias, image la cultura en el sistema IVIS Spectrum CT mediante imágenes de bioluminiscencia con filtro abierto y utilice la configuración automática en el asistente Living Image, 4.3 0.1.Esto se describe en detalle en un video publicado previamente. Para demostrar la infección de ratones con roedores bioluminiscentes, infectaremos un ratón y usaremos otro ratón para una infección simulada con PBS. Antes de realizar la infección, anestesie el ratón con isoflurano al 3 % utilizando un sistema de anestesia XGI eight para proporcionar una restricción humanitaria mientras la anestesia hace efecto completamente.Mezcle el inóculo bacteriano y aspire una cantidad conocida de bacterias en 0,2 mililitros en una jeringa para la administración oral. Ahora, tome el primer ratón a infectar sujetándolo firmemente por la piel del cuello. Tenga en cuenta que los ratones fueron desprovistos previamente antes de la imagenología utilizando crema depilatoria, tal como se describe en el artículo, introduzca la aguja hacia el paladar por encima de la lengua y hacia abajo por el esófago, e inyecte el inóculo bacteriano en el estómago.Si hay resistencia, no fuerce la aguja porque esto colocaría el inóculo en los pulmones; en su lugar, vuelva a insertar suavemente la aguja. Posteriormente, si el ratón tiene dificultades para respirar o caminar, debe ser sometido a eutanasia para la infección simulada. Administre por sonda gástrica a un ratón 0,2 mililitros de PBS para confirmar que la administración oral por sonda se realizó correctamente.Imague los ratones en el espectro de CT por IVUS utilizando imagen de bioluminiscencia con filtro abierto y use la configuración automática en la imagen en vivo. El asistente de imagen 4.3 0.1, como se describió previamente, implica un micro CT Delight que combina imagen óptica integrada con un escaneo de micro CT de baja dosis de radiación. Debido a que la dosis se acumula en los animales durante cada sesión de imagen, nuestro objetivo es mantener la dosis tan baja como sea razonablemente posible.Debido a estas consideraciones, los ratones deben ser sacrificados ante el primer signo de síntomas perjudiciales o al final del período de imagenología por micro-TC. Para este estudio, optimice los parámetros de la función de exposición automática en Living Image 4.3 0.1 para la imagenología de luciferasa bacteriana in vivo. Primero seleccione editar, luego preferencias, luego adquisición y luego la ventana de exposición automática.A continuación, seleccione los valores de rango seguidos por el tiempo de experimento en segundos y establezca el máximo en 300 segundos. Por último, seleccione el recuento objetivo mínimo seguido por la luminiscencia y fije este valor en 10.000 recuentos. Una vez que el sistema haya sido inicializado, que se haya configurado la anestesia y que se hayan comprobado los dispositivos de seguridad de rayos X.Proceda con la anestesia de un ratón. Utilice un sistema de anestesia XGI eight con un flujo de oxígeno de dos litros por minuto y 3% de isoflurano. Cuando el ratón esté listo para la adquisición de imágenes, abra el asistente de adquisición en el software.Esta herramienta optimiza automáticamente varios parámetros para proporcionar la mejor relación señal-ruido posible para cada filtro de emisión seleccionado. Cuando el asistente de imagen lo solicite, incluya los filtros de emisión de quinientos sesenta y cinco, ochocientos sesenta y seiscientos veinte nanómetros. Luego, asegúrese de que esté seleccionada la micro-TC de ratón número uno y haga clic en adquirir para comenzar la adquisición de imágenes.Después de devolver el ratón anestesiado a su jaula, retire la plataforma de imagen para un ratón del CT de espectro y desinfecte la plataforma para el animal usando tri gene al 1 %. Nota: Si la plataforma para el animal está muy sucia, se puede reemplazar la almohadilla de espuma. Continúe con la obtención de imágenes de los ratones diariamente hasta ocho días posteriores a la infección para generar los datos de imagen longitudinal.Períodos de prueba más largos aumentan la probabilidad de artefactos debido a la exposición acumulativa a la radiación. Para producir reconstrucciones de micro-TC de luz en tres DD de alta calidad y reproducibles, se requieren una serie de pasos. Primero, abra el software Living Image, versión 4.3 0.1, y seleccione Examinar en la ventana de exploración.Abra la carpeta que contiene los archivos de micro CT de delight haciendo clic en cargar. Abra el archivo de micro CT de DLI en el navegador de imágenes vivas. Por ejemplo, consulte deum día siete post-infección.En la paleta de herramientas, seleccione topografía de superficie seguido de ratón desnudo. Ajuste el umbral y luego haga clic en generar superficie. Si la reconstrucción de superficie es exitosa, se mostrará un contorno de la superficie en la ventana de vista 3D.Para ver la microtomografía computarizada renderizada en la ventana de vista 3D, oculte el contorno de la superficie o reduzca la opacidad de la superficie. Ambas opciones se acceden primero seleccionando las herramientas ópticas 3D. Luego, desactive la opción de mostrar el objeto de superficie o ajuste la barra deslizante de opacidad para proporcionar una localización anatómica detallada de la reconstrucción de luz DD triple.Con respecto al esqueleto del animal, modifique los datos volumétricos tridimensionales. Para visualizar el esqueleto con contraste óptimo, haga clic en herramientas multimodales 3D y ajuste el control deslizante del histograma hacia la derecha hasta que solo los huesos sean claramente visibles. Luego, si aún no está seleccionada, haga clic en histograma logarítmico, invierta el gradiente de color y active la iluminación de calidad y la reducción de ruido.Si se desea, recorte la imagen para eliminar cualquier estructura no deseada de la reconstrucción 3D desde la paleta de herramientas, seleccione la reconstrucción 3D D light. Asegúrese de que solo estén seleccionados los filtros de quinientos sesenta y cinco, ochenta y seis, cien y seis veinte nanómetros. Luego haga clic en iniciar.Esto abre la ventana de vista previa de datos con las señales de bioluminiscencia filtradas espectralmente provenientes del ratón imagenado en 2D. El software establece automáticamente un umbral para estas señales, aunque puede ajustarse manualmente si es necesario, utilizando las pestañas en la parte inferior del menú. El umbral determina la intensidad mínima de los datos que se incluirán como datos en la reconstrucción.A continuación, desde la paleta de herramientas, seleccione la reconstrucción 3D de micro-TC con luz D y verifique las propiedades ópticas. Al hacer clic en la pestaña propiedades, las propiedades del tejido deben establecerse en tejido de ratón y el espectro de la fuente en bacterias. Ahora haga clic en reconstruir para realizar la reconstrucción con luz D.La ubicación real de la señal luminosa D marcada con un círculo rojo se encuentra dentro del cinturón pélvico. Esta resulta más fácil de interpretar cuando la imagen gira durante la película. Para generar la película tridimensional en micro-TC de DLI, diríjase al menú de herramientas y seleccione animación 3D, animaciones preestablecidas, eje en sentido antihorario y luego duración total.Establezca este valor en 10 segundos o 25 cuadros por segundo. Una vez que la configuración de la animación 3D sea correcta, presione grabar y guarde las reconstrucciones 3D de micro-TC DLI como archivos VI. Es fundamental realizar estas reconstrucciones utilizando configuraciones idénticas para que sean comparables.También es importante realizar los videos utilizando el mismo número de cuadros por segundo y la misma duración total. De lo contrario, la temporización del video 40 no será homogénea. En la computadora, abra Windows Live Movie Maker y cree un archivo nuevo.Inserte las reconstrucciones de micro-TC de DLI en orden cronológico desde el primer día posterior a la infección. Utilizando la pestaña de herramientas, agregue subtítulos al comienzo de cada video seleccionando el video, luego seleccione inicio y después elija agregar subtítulo. El texto del subtítulo puede formatearse desde la barra de herramientas y la ubicación del subtítulo también es ajustable.Ahora agregue una página de título haciendo clic en inicio y luego en título. Escriba su título en el cuadro utilizando la barra de herramientas para formatear el texto. A continuación, guarde el proyecto como un archivo MMP.Esto es esencial si desea modificar la película. Finalmente, guarde la película como un archivo WMV desde el menú del creador de películas, seleccione guardar película y elija la opción de cuatro controles informáticos que son esenciales para una buena técnica. Antes de infectar los ratones, se determinó que el inóculo bacteriano utilizado era bioluminiscente.Después de la administración oral por gavaje con el roedor bioluminiscente, se verificó si la señal podía observarse en el estómago del animal, indicado mediante una punta de flecha blanca, y ausente de los pulmones. El mismo ratón se mostrará en ejemplos posteriores de una infección individual. Zero denture es un patógeno extracelular confinado al lumen intestinal durante la infección demostrada.Por lo tanto, se elimina por las heces, las cuales se analizaron para demostrar que la colonización aumenta desde el día dos hasta el día seis o siete, cuando la infección alcanza su punto máximo diariamente. Se utilizó micro-TC con luz para evaluar la distribución espacial de las bacterias bioluminiscentes dentro de este ratón, empleando el esqueleto como referencia anatómica. Al tercer día postinfección, se observaron pequeños focos bioluminiscentes en el colon, indicados por una flecha azul.Estos focos mostraron un aumento moderado en la intensidad de la bioluminiscencia al quinto día postinfección, con pocos cambios en la distribución espacial al séptimo día postinfección; no obstante, se observó un aumento significativo de la bioluminiscencia y la diseminación de los focos bioluminiscentes a lo largo de todo el colon. Tres reconstrucciones micro CT de luz DD desde el primer hasta el octavo día postinfección ilustran la propagación de la infección por sero deum. La infección bacteriana comienza como focos distintos dentro del tracto gastrointestinal proximal.Al tercer día, la infección se disemina al colon. Durante los siguientes días, los focos de infección se extienden más, aumentando en tamaño y número. La infección alcanza su punto máximo el día siete.Luego, en el día ocho, las colonias se redujeron a dos focos bacterianos distintos en el colon proximal y distal. Esta tecnología permitirá a los investigadores estudiar el mecanismo de colonización bacteriana e infección en tiempo real y evaluar la eficacia de estrategias de intervención.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Valentine, M. E., et al., Generación de mutantes de deleción génica en cuadro en Pseudomonas aeruginosa y pruebas de atenuación de virulencia en un modelo simple de infección en ratón. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demuestra el uso de un enfoque de imagen basado en bioluminiscencia para monitorizar la infección bacteriana en un modelo de ratón vivo. La imagen secuencial bioluminiscente y de rayos X permite la visualización en tiempo real y la localización anatómica de la infección...

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Fuente: Luyts, N., et al. Seguimiento longitudinal de infecciones urinarias y su tratamiento en ratones mediante imagen bioluminiscencia. J. Vis. Exp. (2021).Este vídeo muestra la inducción y seguimiento de la infección urinaria en un modelo murino utilizando E. coli bioluminiscente inyectada en la vejiga, donde ocurren adhesiones, invasión y replicación intracelular bacteriana. La luz emitida por el operón bioluminiscente sirve como marcador en tiempo real de la carga bacteriana durante la...

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Citrobacter infección rodentium ofrece un valioso modelo para estudiar las infecciones bacterianas entéricas, así como respuestas inmunes del huésped y la colitis en ratones. Este protocolo describe la medición de la integridad de la barrera, la carga de patógenos y el daño histológico que permita la caracterización detallada de las contribuciones patógeno y del huésped a la colitis infecciosa murino.

La<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Modelo: Estudiar Contribuciones patógeno y del huésped a la colitis infecciosa

Streptococcus pneumoniae es el patógeno que lleva causando neumonía adquirida en la comunidad grave y responsable de más de 2 millones de muertes en todo el mundo. El impacto de los factores bacterianos implicados en la aptitud o la virulencia se puede controlar en tiempo real en una neumonía o bacteriemia modelo agudo ratón utilizando bacterias bioluminiscentes.

Siguiendo en tiempo real el impacto de factores de virulencia neumocócica en un ratón de neumonía aguda modelo utilizando bacterias bioluminiscentes

Los modelos animales han demostrado ser herramientas muy valiosas en la definición de mecanismos de acogida y de patógenos específicos que contribuyen al desarrollo de la inflamación crónica. Aquí se describe un modelo de ratón de infección oral con el patógeno humano Porphyromonas gingivalis y metodologías detalle para evaluar la progresión de la inflamación en sitios locales y sistémicos.

Un modelo de ratón para Patógenos inducida inflamación crónica en los sitios locales y sistémicos

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Cefoperazona tratados modelo de ratón clínicamente relevante<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; R20291 Strain

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Detección de la colonización de Escherichia Coli enterohemorrágica en anfitrión murino no invasiva In Vivo el sistema de bioluminiscencia

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4D de imágenes multimodalidad

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