Name: SABIDURÍA Proteína: Un banco de trabajo para En silico De novo Diseño de biomoléculas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Aprende a diseñar proteínas de novo con Protein WISDOM, una herramienta computacional para mejorar estabilidad y afinidad de unión. Este método permite a investigadores optimizar secuencias proteicas mediante análisis estructural.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

CAF agradece el apoyo de NSF, NIH (R01 GM52032; R24 GM069 736), y la Agencia de Protección Ambiental de EE. UU., EPAA (R 832721-010). Una parte de esta investigación fue posible gracias al apoyo gubernamental de la Oficina de Investigación Científica de la Fuerza Aérea del Departamento de Defensa. JS agradece el apoyo de los NIH (P50GM071508-06). MLBP agradece el apoyo de una beca de posgrado en ciencia e ingeniería de defensa nacional (NDSEG), 32 CFR 168a. GAK agradece el apoyo de una beca de investigación de posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias bajo el número de subvención DGE-1148900.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El marco de diseño de proteínas de novo consta de dos etapas, una etapa de selección de secuencia y una etapa de validación. El marco es lo suficientemente robusto como para manejar plantillas de diseño rígidas y flexibles, y se puede aplicar al diseño de una sola proteína o al diseño de proteínas complejas. El marco se ha aplicado con éxito a numerosos sistemas de proteínas con aplicaciones a docenas de enfermedades. Varios de los diseños han sido validados experimentalmente, proporcionando los inhibidores o ag...

El diseño de proteínas de novo es la identificación de secuencias de proteínas que producirán una estructura terciaria deseada con propiedades o funciones mejoradas. Dado que el pliegue nativo de una proteína es la conformación que se encuentra en el mínimo de energía libre, el diseño de proteínas de novo busca secuencias que tengan un mínimo de energía libre en el pliegue objetivo. Este problema fue descrito por primera vez por Drexler1 y Pabo2 y se denominó el "problema del plegamiento inverso". Sin embargo, a diferencia del problema del plegamiento de proteínas, donde una secuencia puede producir solo una solución de estructura plegada, el problema de diseño de proteínas de novo exhibe degeneración. Muchas secuencias de aminoácidos diferentes pueden producir la misma estructura y función terciaria.
Mientras que el diseño de proteínas se ha realizado tradicionalmente experimentalmente a través del diseño racional y la evolución dirigida, los métodos computacionales se han empleado más recientemente para superar el limitado espacio de búsqueda inherente a los métodos experimentales. Se han utilizado una variedad de métodos computacionales, incluidos métodos deterministas, métodos estocásticos y métodos probabilísticos. 3,4 Los primeros métodos computacionales utilizaban plantillas troncales fijas para facilitar la resolución del problema. 5-7 Con el advenimiento de procesadores más rápidos, computación de alto rendimiento y algoritmos más eficientes, la flexibilidad de la red troncal se ha incorporado mediante el uso de un conjunto de plantillas de columna vertebral fija8-14 o mediante la incorporación de una verdadera flexibilidad de la red troncal expresando la plantilla en términos de rangos de distancias de átomo a átomo y ángulos diedros. 15,16
Este artículo describe en detalle Protein WISDOM, una herramienta en línea que se ha puesto a disposición de la comunidad académica para utilizar nuestro marco de diseño computacional de proteínas de novo. Este marco se ha aplicado al diseño de numerosas proteínas, para uso terapéutico dirigidas a enfermedades como el VIH, el cáncer, las enfermedades del complemento y otros trastornos autoinmunes. Muchos de los péptidos predichos fueron validados experimentalmente, demostrando el poder del método. La Tabla 1 proporciona un resumen de las diferentes proteínas que se han diseñado, incluido el tamaño de la proteína o péptido, el número de predicciones y la validación experimental.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Diseño de proteínas</td>
			<td>Longitud de la proteína</td>
			<td># de Predicciones Computacionales</td>
			<td># de Validaciones Experimentales</td>
			<td>referencia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diseño de secuencia completa de beta-defensina-2 humana</td>
			<td>41</td>
			<td>340</td>
			<td> </td>
			<td>(17)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibidores de la compstatina C3 humana</td>
			<td>13</td>
			<td>28</td>
			<td>3/3</td>
			<td>(18, 19)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Análogos de la compstatina que se unen a la rata C3c</td>
			<td>13</td>
			<td>5</td>
			<td> </td>
			<td>(20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Análogos de la compstatina con extensión de di-serina</td>
			<td>15</td>
			<td>8</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Estructura estabilizadora del análogo de la compstatina W4A9</td>
			<td>13</td>
			<td>18</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agonistas y antagonistas del receptor C3a</td>
			<td>77</td>
			<td>20</td>
			<td>4/7</td>
			<td>(21)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agonistas y antagonistas del receptor C5a</td>
			<td>74</td>
			<td>61</td>
			<td>2/61</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibidores de la gp14 del VIH-1</td>
			<td>12</td>
			<td>6</td>
			<td>4/5</td>
			<td>(22)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibidores del VIH-1 gp120</td>
			<td>9</td>
			<td>14</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibidores de Bak de Bcl-x L y Bcl-2</td>
			<td>De 16 a 18</td> años
			<td>10</td>
			<td>5/5</td>
			<td>(23)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibidores de ERK2</td>
			<td>11</td>
			<td>25</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibidores de EZH2</td>
			<td>21</td>
			<td>17</td>
			<td>10/10</td>
			<td>(24)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibidores de LSD1 y LSD2</td>
			<td>16</td>
			<td>41</td>
			<td>17/20</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibidores de HLA-DR1</td>
			<td>13</td>
			<td>6</td>
			<td> </td>
			<td>(25)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibidores de la PNP</td>
			<td>5</td>
			<td>13</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1. Resumen de las proteínas y péptidos diseñados utilizando el marco de diseño de proteínas de novo. El # de predicciones computacionales se presenta como el número de predicciones favorables (es decir, especificidades de pliegue por encima de un cierto punto de corte o afinidades de unión aproximadas mayores que la secuencia nativa). El # de validaciones experimentales da dos números: el primero es el número de predicciones que se validaron experimentalmente, mientras que el segundo es el número total de predicciones que se probaron experimentalmente.
Se realizó el diseño de la beta-defensina-2 humana (hβD-2) para mejorar la propiedad antimicrobiana del péptido. 17 Para este diseño, consideramos dos casos: 1) hasta 10 mutaciones a lo largo de hβD-2 y 2) diseño de secuencia completa de todas las posiciones de residuos de hβD-2 excepto las cisteínas (8, 15, 20, 30, 37 y 38). En el diseño se utilizaron tres plantillas de diseño diferentes y tres modelos de selección de secuencia diferentes. Se observaron altos niveles de similitud en las mutaciones entre el promedio ponderado y los modelos de intervalo de distancia tanto para el diseño de 10 mutaciones como para el diseño de secuencia completa. Además, se encontró que un gran número de secuencias tenían valores de especificidad de pliegue calculados más favorables que la secuencia nativa.
Los inhibidores del sistema del complemento (de C3, C3a y C5a) fueron diseñados para combatir una serie de enfermedades inmunitarias como el accidente cerebrovascular, el ataque cardíaco, la enfermedad de Alzheimer, el asma, la artritis reumatoide, el rechazo de los xenotrasplantes, la enfermedad respiratoria del adulto, la psoriasis y la enfermedad de Crohn. Se validó experimentalmente que tres inhibidores de la compstatina de C3c predichos por el marco de diseño de proteínas, más tres secuencias diseñadas racionalmente, eran mejores aglutinantes que la compstatina nativa. 18,19
Estudios posteriores examinaron la pérdida de actividad de la compstatina frente a C3c no primates y diseñaron una serie de inhibidores C3c candidatos en ratas y ratones. Se demostró que cinco secuencias tienen energías libres de asociación más favorables con C3c de rata que el mutante de compstatina W4A9 conocido por inhibir C3c. Esto se debe a una nueva formación de puente salino por parte de Arg1. 20 Se predijo que ocho secuencias con una extensión N-terminal serían mejores aglutinantes que W4A9 con una extensión di-Serina. Finalmente, se predijo que 18 secuencias de compstatina estabilizarían la conformación unida de W4A9, proporcionando fuertes candidatos para inhibidores de C3c en primates y no primates.
Además de los inhibidores de C3c, se diseñaron agonistas y antagonistas de los receptores C3a y C5a basados en las estructuras de C3a y C5a. Se probaron experimentalmente siete secuencias de C3a predichas por el modelo. Dos de las secuencias eran agonistas potentes, mientras que otras dos eran agonistas parciales. 21 Los dos potentes agonistas mostraron una mejora de 58 veces sobre un "superagonista" previamente descubierto. El diseño de agonistas y antagonistas del receptor C5a proporcionó un conjunto de 61 secuencias. Se sintetizaron todas las secuencias y se encontró que dos eran nuevos agonistas C5a.
Los inhibidores de fusión del VIH-1, el virus que causa el SIDA, fueron diseñados para evitar que el VIH-1 infecte las células. El primer diseño se dirigió a gp41, una glicoproteína de la envoltura del VIH-1. El marco de diseño de proteínas predijo seis secuencias que eran mejores aglutinantes que la secuencia nativa. Cuatro de estas secuencias predichas se validaron experimentalmente para inhibir el VIH-1, y la mejor secuencia tenía un IC50 tan bajo como 29 μM. Esta secuencia mostró una mejora de 3 a 15 veces con respecto a la secuencia nativa y no tuvo pérdida de actividad contra una cepa de virus resistente a Enfuvirtida. 22 El segundo diseño se dirigió a gp120, otra glicoproteína de la envoltura del VIH-1. Se predijo que catorce secuencias serían aglutinantes de gp120 y proporcionarían potenciales inhibidores de fusión adicionales del VIH-1.
Numerosas proteínas relacionadas con el cáncer proporcionaron objetivos prometedores para la terapéutica del cáncer. Bcl-2 y Bcl-xL son proteínas antiapoptóticas que evitan la muerte celular. Los inhibidores de estas dos proteínas se diseñaron para inducir la muerte celular en las células cancerosas. Se predijo que diez secuencias serían mejores aglutinantes que las nativas, y estos resultados capturaron resultados experimentales y de mutagénesis anteriores. 23 Otra proteína diana, ERK2, está involucrada en cascadas de transducción de señales que la convierten en un objetivo prometedor para las terapias antiproliferativas contra el cáncer. Se predijo que veinticinco secuencias eran inhibidores de ERK2.
Las histonas metiltransferasas y desmetilasas controlan dinámicamente la metilación de histonas, que se ha relacionado con muchos tipos de cáncer, incluidos el de próstata, mama, linfoma, mieloma, vejiga, colon, piel, hígado, endometrio, pulmón y gástrico. El marco de diseño de proteínas de novo identificó 17 inhibidores de EZH2 (una metiltransferasa de lisina) y de los diez probados experimentalmente, se encontró que todos inhibían EZH2. 24 El péptido más potente tenía un IC50 de aproximadamente 13 μM, era igualmente efectivo con concentraciones elevadas de enzimas y no competía con el cofactor. Estos péptidos fueron el primer conjunto de inhibidores de EZH2. 53 inhibidores de LSD1 (una desmetilasa) fueron predichos por el marco y de los 20 probados experimentalmente, 17 eran inhibidores de LSD1 y 18 eran inhibidores de LSD2. Los mejores inhibidores tenían valores de IC50 por debajo de 1 μM, lo que los convierte en los inhibidores peptídicos más potentes descubiertos hasta la fecha.
Los dos últimos sistemas de proteínas proporcionaron objetivos para el tratamiento de diversas enfermedades autoinmunes como la enfermedad celíaca, la diabetes mellitus tipo 1, el lupus eritematoso sistémico, el síndrome de Sjögren, el síndrome de Churg-Strauss, la tiroiditis de Hashimoto, la enfermedad de Graves, la púrpura trombocitopénica idiopática, la artritis reumatoide y las alergias. Ninguno de estos inhibidores potenciales ha sido validado experimentalmente, sin embargo, el marco predijo seis secuencias que se unen a HLA-DR1 y 13 secuencias que se unen a PNP.
La Tabla 2 resume los inhibidores y agonistas validados experimentalmente que se predicen utilizando el marco de diseño de proteínas de novo. La métrica de afinidad de unión aproximada se utilizó para predecir nueve de las secuencias (inhibidores de C3c humano, VIH-1 gp41, EZH2, LSD1 y LSD2), mientras que la métrica de especificidad de pliegue se utilizó para identificar cuatro de las secuencias (agonistas/antagonistas de C3aR). Estos péptidos ponen de manifiesto el éxito del marco de diseño de proteínas de novo, en particular la métrica de afinidad de unión aproximada añadida. El marco es extremadamente versátil en su aplicabilidad. Se han diseñado y validado experimentalmente con éxito seis proteínas diferentes relacionadas con veinticinco enfermedades diferentes.
<table border="1" cellpadding="1" cellspacing="1" height="147" width="856">
	<tbody>
		<tr>
			<td>nombre</td>
			<td>IC50</td>
			<td>EC50</td>
			<td>Objetivo proteico</td>
			<td>Enfermedades aplicables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ027</td>
			<td>0,94 μM</td>
			<td> </td>
			<td>C3c humano</td>
			<td colspan="1" rowspan="7">accidente cerebrovascular, ataque cardíaco, enfermedad de Alzheimer, asma, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, psoriasis, diabetes tipo I, enfermedad de Crohn, pancreatitis y fibrosis quística</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ086</td>
			<td>1,98 μM</td>
			<td> </td>
			<td>C3c humano</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ059</td>
			<td>4,73 μM</td>
			<td> </td>
			<td>C3c humano</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ110-4</td>
			<td> </td>
			<td>15,2 nM</td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ060-4</td>
			<td> </td>
			<td>36,4 nM</td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ007-5</td>
			<td>15,4 nM</td>
			<td> </td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ002-5</td>
			<td>26.1 nM</td>
			<td> </td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ435</td>
			<td>29 - 253 μM</td>
			<td> </td>
			<td>VIH-1 gp41</td>
			<td>SIDA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ037</td>
			<td>13,57 μM</td>
			<td> </td>
			<td>EZH2</td>
			<td colspan="1" rowspan="5">cánceres de próstata, mama, linfoma, mieloma, vejiga, colon, piel, hígado, endometrio, pulmón y gástrico</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ011-1</td>
			<td>0,521 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ016-1</td>
			<td>0,249 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ026-1</td>
			<td>2,51 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ015-1</td>
			<td>1.332 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 2. Péptidos predichos computacionalmente y validados experimentalmente dirigidos a diversas enfermedades.

sabidurÍa proteína: un banco de trabajo para<em&gt; en silico</em&gt;<em&gt; de novo</em&gt; diseño de biomoléculas

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

El objetivo de diseño de novo de proteínas es para encontrar las secuencias de aminoácidos que se pliegan en una estructura 3-dimensional deseada con mejoras en las propiedades específicas, tales como la afinidad de unión, agonista o antagonista del comportamiento, o la estabilidad, con relación a la secuencia nativa. Diseño proteína se encuentra en el centro de diseño de fármacos actuales avances y descubrimientos. No sólo el diseño de proteínas proporcionar predicciones para dianas de fármacos potencialmente útiles, sino que también mejora nuestra comprensión del proceso de plegamiento de proteínas y las interacciones proteína-proteína. Los métodos experimentales como la evolución dirigida han tenido éxito en el diseño de proteínas. Sin embargo, estos métodos están limitados por el escaso espacio de secuencias que se pueden buscar tractably. En contraste, el diseño de estrategias computacionales permiten la proyección de un conjunto mucho mayor de secuencias que cubren una amplia variedad de propiedades y la funcionalidad. Hemos desarrollado una gama de cálculo de novo de proteínas diseño methods capaces de hacer frente a varias áreas importantes de diseño de proteínas. Estos incluyen el diseño de proteínas monoméricas para aumentar la estabilidad y complejos para el aumento de la afinidad de unión. Para difundir estos métodos de amplio uso que presentamos SABIDURÍA Protein ( <a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a> ), una herramienta que proporciona métodos automatizados para una variedad de problemas de diseño de proteínas. Plantillas estructurales se presentan al iniciar el proceso de diseño. La primera etapa de diseño es una optimización de secuencia de fase de selección que tiene como objetivo mejorar la estabilidad a través de la minimización de la energía potencial en el espacio de secuencia. Secuencias seleccionadas se ejecutan a continuación, a través de una etapa de especificidad veces y una etapa de afinidad de unión. Una lista ordenada por rango de las secuencias para cada paso del proceso, junto con estructuras diseñadas pertinentes, proporciona al usuario con una valoración cuantitativa completa del diseño. Aquí le proporcionamos los detalles of cada método de diseño, así como varios éxitos notables experimentales obtenidos mediante el uso de los métodos.

Diseño De Novo de Inhibidores de Entrada para el VIH-1
El marco de diseño de novo implementado en Protein WISDOM se ha utilizado para el diseño de péptidos inhibidores en varios sistemas terapéuticos importantes (Tablas 1 y 2). Un sistema destacado es el diseño de péptidos para inhibir la entrada del VIH-1 al receptor celular huésped CD4, que aquí se utiliza como un sistema representativo para demostrar el uso práctico de la interfaz de Protein WISDOM. Los pépti...

Desarrollamos métodos computacionales de diseño de proteínas de novo capaces de abordar varias áreas importantes del diseño de proteínas. Para difundir estos métodos presentamos Protein WISDOM, una herramienta en línea para el diseño de proteínas (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>). A partir de un molde estructural, se puede realizar el diseño de proteínas monoméricas para aumentar la estabilidad y complejos para aumentar la afinidad de unión.

SABIDURÍA Proteína: Un banco de trabajo para<em&gt; En silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Diseño de biomoléculas

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en diseñar proteínas o péptidos con propiedades mejoradas de plegamiento, unión o función. Esto se logra cargando la estructura de la proteína o del complejo y definiendo mutaciones y restricciones biológicas. Como segundo paso, para definir el objetivo de diseño, se realiza una optimización de selección de secuencias, que genera un gran número de posibles secuencias de proteínas o péptidos con propiedades mejoradas de estabilidad e interacción. A continuación, plegamiento.Se realizan cálculos de especificidad y/o afinidad de unión aproximada sobre la secuencia diseñada con el fin de validar las proteínas o péptidos diseñados para las propiedades mejoradas deseadas. Se obtienen resultados que muestran propiedades mejoradas de las secuencias diseñadas, basados en el análisis computacional de las estructuras producidas mediante el procedimiento. Este protocolo ha sido desarrollado en el laboratorio del profesor Chris Doles, flautista en la Universidad de Princeton.Este protocolo computacional general de diseño de proteínas de novo es capaz de abordar varias áreas importantes del diseño de proteínas. Estas incluyen el diseño de proteínas monoméricas para aumentar su estabilidad y complejos para incrementar su afinidad de unión. Hemos tenido varios diseños exitosos notables en una variedad de áreas terapéuticas diferentes, incluyendo inhibidores de la GP41 del VIH, dirigidos a EZH2 para terapéuticas contra el cáncer e inhibidores dirigidos a los componentes del complemento C3A. Con el fin de hacer que la aplicación de la metodología de diseño de proteínas esté disponible para la comunidad académica más amplia, hemos desarrollado una interfaz web llamada Protein Wisdom.Esta interfaz permite al usuario tener control total sobre el envío de plantillas, la definición de restricciones de diseño y la especificación de parámetros del método para emplear fácilmente los métodos de diseño en una amplia variedad de problemas de diseño. Tras registrarse en el sitio web de Protein Wisdom según se describe en el protocolo escrito, envíe la secuencia de proteína y la estructura de la plantilla haciendo clic en el botón de inicio de sesión del usuario. Para comenzar el experimento de diseño de proteínas, se muestra al usuario la página principal del usuario, que incluye el número de trabajos enviados, el número de estructuras cargadas y una lista de las estructuras cargadas hasta ahora. Inicie un nuevo trabajo de diseño.Al hacer clic en crear nuevo trabajo, el usuario accede a la página de presentación del trabajo. Asigne un nombre al trabajo e indique si se basa en un trabajo anterior. Haga clic en continuar.Cargue la estructura proteica de la plantilla de diseño. Esta plantilla debe estar en formato estándar de banco de datos de proteínas o formato PDB. Puede ser una plantilla rígida con un conjunto de coordenadas para cada átomo o una plantilla flexible con múltiples modelos, como los obtenidos a partir de estructuras en solución por RMN.En el caso de diseñar una sola proteína, solo puede haber una cadena. En la plantilla, un usuario puede cargar una nueva plantilla o seleccionar entre las plantillas existentes que haya cargado previamente. Si se cargan múltiples plantillas, asegúrese de que cada modelo comience con el número de modelo y finalice con fin de modelo.Asegúrese de que cada residuo esté designado por un aminoácido natural. Haga clic en continuar. Una vez que la plantilla se haya cargado y confirmado correctamente, el usuario accederá a la página principal de control.En esta página, el usuario puede ver el estado del trabajo, modificar los conjuntos de mutaciones y las restricciones biológicas, y enviar el trabajo para la selección de secuencias de la etapa uno. En este momento, dado que la etapa uno aún no ha finalizado, no hay opciones disponibles para la etapa dos. Estas aparecen una vez que los resultados de la etapa uno están disponibles.A continuación, haga clic en el enlace conjuntos de mutaciones en la página de control principal para definir conjuntos de mutaciones, seleccione qué residuos podrán mutar y seleccione a qué aminoácidos se les permitirá mutar. Por defecto, los aminoácidos permitidos en cualquier posición se seleccionan en función del área de superficie accesible al solvente o se requieren conjuntos de mutaciones SSA. Haga clic en guardar cambios después de seleccionar los conjuntos de mutaciones.Tenga en cuenta la complejidad computacional de la optimización que se debe resolver. Existe un límite superior de 20 a la 25.ª potencia para la complejidad computacional permitida. A continuación, haga clic en el enlace de restricciones biológicas en la página principal de control para definir las restricciones biológicas, y especifique las restricciones de carga o contenido de aminoácidos en toda la proteína o en una porción de la misma.El número total de mutaciones permitidas que pueden ocurrir si es necesario; las restricciones biológicas son opcionales. Regrese a la página principal de control cuando termine. Haga clic en el enlace comenzar etapa uno para dirigir al usuario a la página de envío de la etapa uno.Seleccione la cadena para diseñar el número de secuencias a generar, el campo de fuerza dependiente de la distancia y el cálculo del modelo. Los detalles específicos sobre estas selecciones se pueden encontrar en el protocolo escrito. Envíe el trabajo; el usuario será redirigido de vuelta a la página principal de control.El estado del trabajo se actualizará para indicar el progreso actual del mismo. El trabajo quedará bloqueado para su edición tras el envío. Tras la finalización del trabajo, el usuario recibirá un correo electrónico con los resultados, que consisten en una lista de secuencias diseñadas.Los resultados también son visibles en la página principal de control. En la página aparece un cuadro para la especificidad del plegamiento de la etapa dos, que permite al usuario realizar esta validación; para ello, haga clic en comenzar especificidad del plegamiento de la etapa dos. Para acceder a la página de construcción de la etapa dos, defina los límites superior e inferior de la distancia entre carbonos alfa especificando el factor de flexibilidad de la plantilla, ya sea como un porcentaje de la distancia o como una distancia fija.A continuación, defina los límites angulares superior e inferior para los ángulos diedros PHI y laterales. Al especificar el factor de flexibilidad de la plantilla como un porcentaje, haga clic en el botón de envío, especifique el número de estructuras por secuencia a generar y haga clic en Continuar. Tenga en cuenta que existe un límite superior de 500 estructuras por secuencia para generar.Luego, haga clic en continuar para confirmar la intención de enviar a validación de plegamiento. La etapa uno y la etapa dos quedan bloqueadas para edición hasta la finalización de la etapa dos. Al completar el trabajo, se envía un correo electrónico al usuario con los resultados, que también pueden visualizarse en la página principal de control.Aquí se pueden ver y descargar los archivos de texto que contienen las secuencias diseñadas, los valores de energía correspondientes de la etapa uno y los valores de especificidad de plegamiento de la etapa dos. Además, el usuario puede hacer clic en el enlace ver resultados, que muestra una tabla en el navegador con los rangos y valores de energía de la etapa uno, así como los rangos y valores de especificidad de plegamiento de la etapa dos. Se utilizan cálculos aproximados de afinidad de unión para determinar la afinidad de la proteína o péptido ligando diseñado respecto al resto del complejo.Estos cálculos pueden realizarse directamente después de la etapa uno o tras completar los cálculos de especificidad de plegamiento. Para comenzar, haga clic en el número de secuencia para seleccionarla. Para iniciar el cálculo de afinidad de unión aproximada, el usuario será dirigido a la página de selección de secuencia, que presenta una lista de las secuencias de diseño junto con sus rangos de selección de secuencia y de especificidad de plegamiento.Una vez que se selecciona y guarda la secuencia, el usuario es redirigido a la página principal de control. A continuación, haga clic en Comenzar la etapa dos, afinidad de unión aproximada para enviar el trabajo; al completarse, los resultados se envían por correo electrónico al usuario, los cuales incluyen un archivo adjunto que contiene el número de secuencia, la afinidad de unión aproximada y los valores de las funciones de partición. Para cada trabajo posterior de afinidad de unión aproximada, este archivo contiene los resultados de todas las secuencias completadas.Los resultados completos también pueden consultarse accediendo a la página de control principal del trabajo mostrado. A continuación se muestra la plantilla de diseño para inhibidores de entrada del VIH uno, que es la estructura cristalina del péptido entrecruzado de 14 residuos C 14 link mid a 14 en complejo con el núcleo de GP 41. Este péptido plantilla es un inhibidor potente conocido y se presenta sin el entrecruzador.Una vez definidas las entradas del diseño y presentado el sistema para la selección de secuencias en la etapa uno, los resultados de la selección ordenada pueden accederse mediante los enlaces de visualización de resultados en la página principal del trabajo. Este enlace proporciona un resumen fácil de leer de todos los resultados calculados para un sistema determinado, que puede ordenarse según cualquiera de los resultados de las etapas.Para un análisis rápido, los resultados también se pueden visualizar a través del enlace de resultados de secuencia, que ofrece un resumen de las secuencias seleccionadas en código de aminoácidos de tres letras. La tercera opción para acceder a los resultados es mediante el enlace de resultados de energía, que proporciona un resumen de la ejecución del modelo de optimización con las secuencias seleccionadas, sus energías y el tiempo que tomó resolver el modelo para obtener la solución. Tras la finalización de la etapa uno, selección de secuencias y envío de los métodos de especificidad de plegamiento y afinidad de unión aproximada de la etapa dos, los resultados se pueden acceder y ordenar en la sección de resultados de vista resumida.Alternativamente, se pueden ver individualmente en la sección Plegamiento de resultados de especificidad; en la sección Resultados de especificidad del plegamiento, el número de secuencia y los valores de especificidad del plegamiento se proporcionan como una matriz. Los resultados de los cálculos aproximados de afinidad de unión se presentan como una lista ordenable. En la sección Ver resultados, todas las secuencias que se han ejecutado para el cálculo aproximado de afinidad de unión tienen un enlace resaltado en la columna Ver. El enlace Ver dirige al usuario a una página de información del diseño.Esta página proporciona archivos zip descargables para todas las estructuras de complejos y péptidos utilizadas. En la etapa final de diseño de estructuras, tanto para los complejos como para los péptidos, se proporcionan las 10 estructuras de menor energía en una lista ordenada por rango. Cada estructura tiene un enlace de visualización, que permite al usuario ver la estructura en un entorno JM O interactivo.También se proporciona un enlace de descarga para permitir al usuario descargar cada estructura individualmente. Se presentan más detalles de los resultados en la sección de resultados de afinidad de unión aproximada. Esta sección proporciona los valores de las funciones de partición del péptido, de la proteína y del complejo, junto con el valor final de la afinidad de unión aproximada.Al trabajar con protein wisdom, es importante recordar que la selección de restricciones de diseño puede tener un gran impacto en los resultados generales del diseño. Las restricciones de diseño no solo aceleran la búsqueda general al limitar la cantidad de espacio de secuencias que deben explorar los algoritmos de optimización, sino que el uso de restricciones de optimización derivadas de información experimental puede conducir a obtener diseños de proteínas biológicamente relevantes. Esperamos que la disponibilidad de los métodos de diseño a través de la interfaz web protein wisdom permita un uso más amplio de estos métodos de diseño.Continuamos ampliando y desarrollando las capacidades de los métodos de diseño y esperamos generalizar el marco para incluir sistemas multiméricos, interacciones proteína-ADN y diseño con modificaciones postraduccionales y aminoácidos no canónicos en un futuro próximo. Con cada ampliación, la disponibilidad de los métodos a través de Protein Wisdom permitirá una aplicación sencilla y eficiente por parte de la comunidad académica.

protein-wisdom-workbench-for-silico-de-novo-design

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Las secuencias de proteínas sintéticas basadas en motivos de consenso suelen ignorar los residuos co-evolutivos, que implican dependencias interposicionales (IPDs).  Los IPD pueden ser esenciales para la actividad, y los diseños que los ignoran pueden dar lugar a resultados subóptimos.  Este protocolo utiliza StickWRLD para identificar IPD y ayudar a informar el diseño racional de proteínas, lo que resulta en resultados más eficientes.

Optimización de las proteínas sintéticas: Identificación de interposicional Dependencias de indicación Estructuralmente y / o Residuos Funcionalmente Vinculados

Describimos los protocolos para la determinación de la estructura del dominio de unión IKK de NEMO por cristalografía de rayos X. Los métodos incluyen la expresión de proteínas, purificación y caracterización, así como estrategias para la optimización exitosa del cristal y la determinación de la estructura de la proteína en su forma no unida.

Producción, cristalización y determinación de la estructura del dominio vinculante iKK de NEMO

El análisis de partículas individuales en microscopía crioelectrónica es una de las principales técnicas utilizadas para determinar la estructura de conjuntos biológicos a alta resolución. Scipion proporciona las herramientas para crear toda la tubería para procesar la información adquirida por el microscopio y lograr una reconstrucción en 3D del espécimen biológico.

Análisis crio-EM y de partículas individuales con Scipion

Una habilidad clave en el modelado biomolecular es mostrar y anotar sitios activos en proteínas. Esta técnica se demuestra utilizando cuatro programas gratuitos populares para la visualización macromolecular: iCn3D, Jmol, PyMOL y UCSF ChimeraX.

Modelado de un sitio activo enzimático utilizando software gratuito de visualización molecular

Este protocolo proporciona un enfoque para la optimización de la formulación sobre los factores de estudio de mezcla, continuos y categóricos que minimiza las opciones subjetivas en la construcción del diseño experimental. Para la fase de análisis, se emplea un procedimiento de ajuste de modelado efectivo y fácil de usar.

Un flujo de trabajo para la optimización de la formulación de nanopartículas lipídicas (LNP) utilizando experimentos de proceso de mezcla diseñados y modelos de conjunto autovalidados (SVEM)

Este protocolo presenta las herramientas disponibles para modelar ligandos de moléculas pequeñas en mapas crioEM de macromoléculas.

Modelado de ligandos en mapas derivados de la criomicroscopía electrónica

El diseño de proteínas implica la construcción de secuencias de aminoácidos y la incorporación de motivos específicos para crear variantes funcionales. Este enfoque es fundamental para el desarrollo de péptidos antimicrobianos (AMP) para combatir los patógenos resistentes a los antibióticos. En este artículo se presenta un procedimiento para la construcción de proteínas utilizando diversas herramientas bioinformáticas.

Aplicación de I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, servidor HADDOCK y HEX loria para el diseño de proteínas De Novo e In Silico

Este protocolo proporciona un método para la optimización global sistemática de biosensores codificados genéticamente a través de la generación y evaluación de bibliotecas genéticas asistidas por automatización. Esto se combina con metodologías de diseño de experimentos para agilizar la experimentación y permitir la selección de componentes genéticos para ajustar los biosensores a resultados de diseño específicos.

Muestreo eficiente del espacio de diseño de biosensores codificados genéticamente habilitado con un diseño de experimentos y flujo de trabajo de automatización

Se presenta un procedimiento para la formación de un poli (etilenglicol) auto-ensambladas monocapa (PEG-SAM) en un substrato de silicio con microelectrodos de oro. El PEG-SAM se forma en un solo paso y evita la contaminación biológica en las superficies de silicio y oro. Electroforesis se utiliza para modelar biomoléculas a la nanoescala.

Antifouling monocapas auto-ensambladas de microelectrodos de Biomoléculas Patrones

El video que acompaña describe el uso del sistema de fraccionamiento GELFREE 8100, las particiones que las muestras de proteínas complejas sobre la base del peso molecular y se recupera la fracción en fase líquida. El video describe cómo funciona la tecnología, cómo se utiliza, y proporciona los datos resultantes, con el análisis de electroforesis en gel de poliacrilamida de homogeneizado fraccionada hígado de bovino.

Utilizando el sistema de fraccionamiento GELFREE 8100 de peso molecular basado en Fraccionamiento con la recuperación de la fase líquida

Aprende a diseñar proteínas de novo con Protein WISDOM, una herramienta computacional para mejorar estabilidad y afinidad de unión. Este método permite a investigadores optimizar secuencias proteicas mediante análisis estructural.

SABIDURÍA Proteína: Un banco de trabajo para

Explorar más videos