Name: SABIDURÍA Proteína: Un banco de trabajo para En silico De novo Diseño de biomoléculas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Aprende a diseñar proteínas de novo con Protein WISDOM, una herramienta computacional para mejorar estabilidad y afinidad de unión. Este método permite a investigadores optimizar secuencias proteicas mediante análisis estructural.

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CAF agradece el apoyo de NSF, NIH (R01 GM52032; R24 GM069 736), y la Agencia de Protección Ambiental de EE. UU., EPAA (R 832721-010). Una parte de esta investigación fue posible gracias al apoyo gubernamental de la Oficina de Investigación Científica de la Fuerza Aérea del Departamento de Defensa. JS agradece el apoyo de los NIH (P50GM071508-06). MLBP agradece el apoyo de una beca de posgrado en ciencia e ingeniería de defensa nacional (NDSEG), 32 CFR 168a. GAK agradece el apoyo de una beca de investigación de posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias bajo el número de subvención DGE-1148900.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El marco de diseño de proteínas de novo consta de dos etapas, una etapa de selección de secuencia y una etapa de validación. El marco es lo suficientemente robusto como para manejar plantillas de diseño rígidas y flexibles, y se puede aplicar al diseño de una sola proteína o al diseño de proteínas complejas. El marco se ha aplicado con éxito a numerosos sistemas de proteínas con aplicaciones a docenas de enfermedades. Varios de los diseños han sido validados experimentalmente, proporcionando los inhibidores o ag...

El diseño de proteínas de novo es la identificación de secuencias de proteínas que producirán una estructura terciaria deseada con propiedades o funciones mejoradas. Dado que el pliegue nativo de una proteína es la conformación que se encuentra en el mínimo de energía libre, el diseño de proteínas de novo busca secuencias que tengan un mínimo de energía libre en el pliegue objetivo. Este problema fue descrito por primera vez por Drexler1 y Pabo2 y se denominó el "problema del plegamiento inverso". Sin embargo, a diferencia del problema del plegamiento de proteínas, donde una secuencia puede producir solo una solución de estructura plegada, el problema de diseño de proteínas de novo exhibe degeneración. Muchas secuencias de aminoácidos diferentes pueden producir la misma estructura y función terciaria.
Mientras que el diseño de proteínas se ha realizado tradicionalmente experimentalmente a través del diseño racional y la evolución dirigida, los métodos computacionales se han empleado más recientemente para superar el limitado espacio de búsqueda inherente a los métodos experimentales. Se han utilizado una variedad de métodos computacionales, incluidos métodos deterministas, métodos estocásticos y métodos probabilísticos. 3,4 Los primeros métodos computacionales utilizaban plantillas troncales fijas para facilitar la resolución del problema. 5-7 Con el advenimiento de procesadores más rápidos, computación de alto rendimiento y algoritmos más eficientes, la flexibilidad de la red troncal se ha incorporado mediante el uso de un conjunto de plantillas de columna vertebral fija8-14 o mediante la incorporación de una verdadera flexibilidad de la red troncal expresando la plantilla en términos de rangos de distancias de átomo a átomo y ángulos diedros. 15,16
Este artículo describe en detalle Protein WISDOM, una herramienta en línea que se ha puesto a disposición de la comunidad académica para utilizar nuestro marco de diseño computacional de proteínas de novo. Este marco se ha aplicado al diseño de numerosas proteínas, para uso terapéutico dirigidas a enfermedades como el VIH, el cáncer, las enfermedades del complemento y otros trastornos autoinmunes. Muchos de los péptidos predichos fueron validados experimentalmente, demostrando el poder del método. La Tabla 1 proporciona un resumen de las diferentes proteínas que se han diseñado, incluido el tamaño de la proteína o péptido, el número de predicciones y la validación experimental.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Diseño de proteínas</td>
			<td>Longitud de la proteína</td>
			<td># de Predicciones Computacionales</td>
			<td># de Validaciones Experimentales</td>
			<td>referencia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diseño de secuencia completa de beta-defensina-2 humana</td>
			<td>41</td>
			<td>340</td>
			<td> </td>
			<td>(17)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibidores de la compstatina C3 humana</td>
			<td>13</td>
			<td>28</td>
			<td>3/3</td>
			<td>(18, 19)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Análogos de la compstatina que se unen a la rata C3c</td>
			<td>13</td>
			<td>5</td>
			<td> </td>
			<td>(20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Análogos de la compstatina con extensión de di-serina</td>
			<td>15</td>
			<td>8</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Estructura estabilizadora del análogo de la compstatina W4A9</td>
			<td>13</td>
			<td>18</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agonistas y antagonistas del receptor C3a</td>
			<td>77</td>
			<td>20</td>
			<td>4/7</td>
			<td>(21)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agonistas y antagonistas del receptor C5a</td>
			<td>74</td>
			<td>61</td>
			<td>2/61</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibidores de la gp14 del VIH-1</td>
			<td>12</td>
			<td>6</td>
			<td>4/5</td>
			<td>(22)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibidores del VIH-1 gp120</td>
			<td>9</td>
			<td>14</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibidores de Bak de Bcl-x L y Bcl-2</td>
			<td>De 16 a 18</td> años
			<td>10</td>
			<td>5/5</td>
			<td>(23)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibidores de ERK2</td>
			<td>11</td>
			<td>25</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibidores de EZH2</td>
			<td>21</td>
			<td>17</td>
			<td>10/10</td>
			<td>(24)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibidores de LSD1 y LSD2</td>
			<td>16</td>
			<td>41</td>
			<td>17/20</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibidores de HLA-DR1</td>
			<td>13</td>
			<td>6</td>
			<td> </td>
			<td>(25)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibidores de la PNP</td>
			<td>5</td>
			<td>13</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1. Resumen de las proteínas y péptidos diseñados utilizando el marco de diseño de proteínas de novo. El # de predicciones computacionales se presenta como el número de predicciones favorables (es decir, especificidades de pliegue por encima de un cierto punto de corte o afinidades de unión aproximadas mayores que la secuencia nativa). El # de validaciones experimentales da dos números: el primero es el número de predicciones que se validaron experimentalmente, mientras que el segundo es el número total de predicciones que se probaron experimentalmente.
Se realizó el diseño de la beta-defensina-2 humana (hβD-2) para mejorar la propiedad antimicrobiana del péptido. 17 Para este diseño, consideramos dos casos: 1) hasta 10 mutaciones a lo largo de hβD-2 y 2) diseño de secuencia completa de todas las posiciones de residuos de hβD-2 excepto las cisteínas (8, 15, 20, 30, 37 y 38). En el diseño se utilizaron tres plantillas de diseño diferentes y tres modelos de selección de secuencia diferentes. Se observaron altos niveles de similitud en las mutaciones entre el promedio ponderado y los modelos de intervalo de distancia tanto para el diseño de 10 mutaciones como para el diseño de secuencia completa. Además, se encontró que un gran número de secuencias tenían valores de especificidad de pliegue calculados más favorables que la secuencia nativa.
Los inhibidores del sistema del complemento (de C3, C3a y C5a) fueron diseñados para combatir una serie de enfermedades inmunitarias como el accidente cerebrovascular, el ataque cardíaco, la enfermedad de Alzheimer, el asma, la artritis reumatoide, el rechazo de los xenotrasplantes, la enfermedad respiratoria del adulto, la psoriasis y la enfermedad de Crohn. Se validó experimentalmente que tres inhibidores de la compstatina de C3c predichos por el marco de diseño de proteínas, más tres secuencias diseñadas racionalmente, eran mejores aglutinantes que la compstatina nativa. 18,19
Estudios posteriores examinaron la pérdida de actividad de la compstatina frente a C3c no primates y diseñaron una serie de inhibidores C3c candidatos en ratas y ratones. Se demostró que cinco secuencias tienen energías libres de asociación más favorables con C3c de rata que el mutante de compstatina W4A9 conocido por inhibir C3c. Esto se debe a una nueva formación de puente salino por parte de Arg1. 20 Se predijo que ocho secuencias con una extensión N-terminal serían mejores aglutinantes que W4A9 con una extensión di-Serina. Finalmente, se predijo que 18 secuencias de compstatina estabilizarían la conformación unida de W4A9, proporcionando fuertes candidatos para inhibidores de C3c en primates y no primates.
Además de los inhibidores de C3c, se diseñaron agonistas y antagonistas de los receptores C3a y C5a basados en las estructuras de C3a y C5a. Se probaron experimentalmente siete secuencias de C3a predichas por el modelo. Dos de las secuencias eran agonistas potentes, mientras que otras dos eran agonistas parciales. 21 Los dos potentes agonistas mostraron una mejora de 58 veces sobre un "superagonista" previamente descubierto. El diseño de agonistas y antagonistas del receptor C5a proporcionó un conjunto de 61 secuencias. Se sintetizaron todas las secuencias y se encontró que dos eran nuevos agonistas C5a.
Los inhibidores de fusión del VIH-1, el virus que causa el SIDA, fueron diseñados para evitar que el VIH-1 infecte las células. El primer diseño se dirigió a gp41, una glicoproteína de la envoltura del VIH-1. El marco de diseño de proteínas predijo seis secuencias que eran mejores aglutinantes que la secuencia nativa. Cuatro de estas secuencias predichas se validaron experimentalmente para inhibir el VIH-1, y la mejor secuencia tenía un IC50 tan bajo como 29 μM. Esta secuencia mostró una mejora de 3 a 15 veces con respecto a la secuencia nativa y no tuvo pérdida de actividad contra una cepa de virus resistente a Enfuvirtida. 22 El segundo diseño se dirigió a gp120, otra glicoproteína de la envoltura del VIH-1. Se predijo que catorce secuencias serían aglutinantes de gp120 y proporcionarían potenciales inhibidores de fusión adicionales del VIH-1.
Numerosas proteínas relacionadas con el cáncer proporcionaron objetivos prometedores para la terapéutica del cáncer. Bcl-2 y Bcl-xL son proteínas antiapoptóticas que evitan la muerte celular. Los inhibidores de estas dos proteínas se diseñaron para inducir la muerte celular en las células cancerosas. Se predijo que diez secuencias serían mejores aglutinantes que las nativas, y estos resultados capturaron resultados experimentales y de mutagénesis anteriores. 23 Otra proteína diana, ERK2, está involucrada en cascadas de transducción de señales que la convierten en un objetivo prometedor para las terapias antiproliferativas contra el cáncer. Se predijo que veinticinco secuencias eran inhibidores de ERK2.
Las histonas metiltransferasas y desmetilasas controlan dinámicamente la metilación de histonas, que se ha relacionado con muchos tipos de cáncer, incluidos el de próstata, mama, linfoma, mieloma, vejiga, colon, piel, hígado, endometrio, pulmón y gástrico. El marco de diseño de proteínas de novo identificó 17 inhibidores de EZH2 (una metiltransferasa de lisina) y de los diez probados experimentalmente, se encontró que todos inhibían EZH2. 24 El péptido más potente tenía un IC50 de aproximadamente 13 μM, era igualmente efectivo con concentraciones elevadas de enzimas y no competía con el cofactor. Estos péptidos fueron el primer conjunto de inhibidores de EZH2. 53 inhibidores de LSD1 (una desmetilasa) fueron predichos por el marco y de los 20 probados experimentalmente, 17 eran inhibidores de LSD1 y 18 eran inhibidores de LSD2. Los mejores inhibidores tenían valores de IC50 por debajo de 1 μM, lo que los convierte en los inhibidores peptídicos más potentes descubiertos hasta la fecha.
Los dos últimos sistemas de proteínas proporcionaron objetivos para el tratamiento de diversas enfermedades autoinmunes como la enfermedad celíaca, la diabetes mellitus tipo 1, el lupus eritematoso sistémico, el síndrome de Sjögren, el síndrome de Churg-Strauss, la tiroiditis de Hashimoto, la enfermedad de Graves, la púrpura trombocitopénica idiopática, la artritis reumatoide y las alergias. Ninguno de estos inhibidores potenciales ha sido validado experimentalmente, sin embargo, el marco predijo seis secuencias que se unen a HLA-DR1 y 13 secuencias que se unen a PNP.
La Tabla 2 resume los inhibidores y agonistas validados experimentalmente que se predicen utilizando el marco de diseño de proteínas de novo. La métrica de afinidad de unión aproximada se utilizó para predecir nueve de las secuencias (inhibidores de C3c humano, VIH-1 gp41, EZH2, LSD1 y LSD2), mientras que la métrica de especificidad de pliegue se utilizó para identificar cuatro de las secuencias (agonistas/antagonistas de C3aR). Estos péptidos ponen de manifiesto el éxito del marco de diseño de proteínas de novo, en particular la métrica de afinidad de unión aproximada añadida. El marco es extremadamente versátil en su aplicabilidad. Se han diseñado y validado experimentalmente con éxito seis proteínas diferentes relacionadas con veinticinco enfermedades diferentes.
<table border="1" cellpadding="1" cellspacing="1" height="147" width="856">
	<tbody>
		<tr>
			<td>nombre</td>
			<td>IC50</td>
			<td>EC50</td>
			<td>Objetivo proteico</td>
			<td>Enfermedades aplicables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ027</td>
			<td>0,94 μM</td>
			<td> </td>
			<td>C3c humano</td>
			<td colspan="1" rowspan="7">accidente cerebrovascular, ataque cardíaco, enfermedad de Alzheimer, asma, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, psoriasis, diabetes tipo I, enfermedad de Crohn, pancreatitis y fibrosis quística</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ086</td>
			<td>1,98 μM</td>
			<td> </td>
			<td>C3c humano</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ059</td>
			<td>4,73 μM</td>
			<td> </td>
			<td>C3c humano</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ110-4</td>
			<td> </td>
			<td>15,2 nM</td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ060-4</td>
			<td> </td>
			<td>36,4 nM</td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ007-5</td>
			<td>15,4 nM</td>
			<td> </td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ002-5</td>
			<td>26.1 nM</td>
			<td> </td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ435</td>
			<td>29 - 253 μM</td>
			<td> </td>
			<td>VIH-1 gp41</td>
			<td>SIDA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ037</td>
			<td>13,57 μM</td>
			<td> </td>
			<td>EZH2</td>
			<td colspan="1" rowspan="5">cánceres de próstata, mama, linfoma, mieloma, vejiga, colon, piel, hígado, endometrio, pulmón y gástrico</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ011-1</td>
			<td>0,521 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ016-1</td>
			<td>0,249 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ026-1</td>
			<td>2,51 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ015-1</td>
			<td>1.332 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 2. Péptidos predichos computacionalmente y validados experimentalmente dirigidos a diversas enfermedades.

sabidurÍa proteína: un banco de trabajo para<em&gt; en silico</em&gt;<em&gt; de novo</em&gt; diseño de biomoléculas

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

El objetivo de diseño de novo de proteínas es para encontrar las secuencias de aminoácidos que se pliegan en una estructura 3-dimensional deseada con mejoras en las propiedades específicas, tales como la afinidad de unión, agonista o antagonista del comportamiento, o la estabilidad, con relación a la secuencia nativa. Diseño proteína se encuentra en el centro de diseño de fármacos actuales avances y descubrimientos. No sólo el diseño de proteínas proporcionar predicciones para dianas de fármacos potencialmente útiles, sino que también mejora nuestra comprensión del proceso de plegamiento de proteínas y las interacciones proteína-proteína. Los métodos experimentales como la evolución dirigida han tenido éxito en el diseño de proteínas. Sin embargo, estos métodos están limitados por el escaso espacio de secuencias que se pueden buscar tractably. En contraste, el diseño de estrategias computacionales permiten la proyección de un conjunto mucho mayor de secuencias que cubren una amplia variedad de propiedades y la funcionalidad. Hemos desarrollado una gama de cálculo de novo de proteínas diseño methods capaces de hacer frente a varias áreas importantes de diseño de proteínas. Estos incluyen el diseño de proteínas monoméricas para aumentar la estabilidad y complejos para el aumento de la afinidad de unión. Para difundir estos métodos de amplio uso que presentamos SABIDURÍA Protein ( <a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a> ), una herramienta que proporciona métodos automatizados para una variedad de problemas de diseño de proteínas. Plantillas estructurales se presentan al iniciar el proceso de diseño. La primera etapa de diseño es una optimización de secuencia de fase de selección que tiene como objetivo mejorar la estabilidad a través de la minimización de la energía potencial en el espacio de secuencia. Secuencias seleccionadas se ejecutan a continuación, a través de una etapa de especificidad veces y una etapa de afinidad de unión. Una lista ordenada por rango de las secuencias para cada paso del proceso, junto con estructuras diseñadas pertinentes, proporciona al usuario con una valoración cuantitativa completa del diseño. Aquí le proporcionamos los detalles of cada método de diseño, así como varios éxitos notables experimentales obtenidos mediante el uso de los métodos.

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El marco de diseño de novo implementado en Protein WISDOM se ha utilizado para el diseño de péptidos inhibidores en varios sistemas terapéuticos importantes (Tablas 1 y 2). Un sistema destacado es el diseño de péptidos para inhibir la entrada del VIH-1 al receptor celular huésped CD4, que aquí se utiliza como un sistema representativo para demostrar el uso práctico de la interfaz de Protein WISDOM. Los pépti...

Desarrollamos métodos computacionales de diseño de proteínas de novo capaces de abordar varias áreas importantes del diseño de proteínas. Para difundir estos métodos presentamos Protein WISDOM, una herramienta en línea para el diseño de proteínas (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>). A partir de un molde estructural, se puede realizar el diseño de proteínas monoméricas para aumentar la estabilidad y complejos para aumentar la afinidad de unión.

SABIDURÍA Proteína: Un banco de trabajo para<em&gt; En silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Diseño de biomoléculas

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en diseñar proteínas o péptidos con propiedades mejoradas de plegamiento, unión o función. Esto se logra cargando la estructura de la proteína o del complejo y definiendo mutaciones y restricciones biológicas. Como segundo paso, para definir el objetivo de diseño, se realiza una optimización de selección de secuencias, que genera un gran número de posibles secuencias de proteínas o péptidos con propiedades mejoradas de estabilidad e interacción. A continuación, plegamiento.Se realizan cálculos de especificidad y/o afinidad de unión aproximada sobre la secuencia diseñada con el fin de validar las proteínas o péptidos diseñados para las propiedades mejoradas deseadas. Se obtienen resultados que muestran propiedades mejoradas de las secuencias diseñadas, basados en el análisis computacional de las estructuras producidas mediante el procedimiento. Este protocolo ha sido desarrollado en el laboratorio del profesor Chris Doles, flautista en la Universidad de Princeton.Este protocolo computacional general de diseño de proteínas de novo es capaz de abordar varias áreas importantes del diseño de proteínas. Estas incluyen el diseño de pr

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