Usando el hemacitómetro para el conteo celular

Using a Hemacytometer to Count Cells

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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Using a Hemacytometer to Count Cells

2.2: Gel Purification

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10:19 min

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February 01, 2013

Overview

Muchos experimentos biomédicos requieren manipulación de una cantidad conocida de células, con el fin de lograr exactos, reproducibles y los datos estadísticamente relevantes. Por lo tanto, aprender a contar las células es una técnica indispensable para cualquier éxito científico biomédico. La forma más común para contar las células es mediante un hemacitómetro – un instrumento que lleva dos rejillas grabado a láser, que ayudan a la enumeración de una alícuota células bajo un microscopio simple de luz. Esta información puede utilizarse entonces para extrapolar el número de células en la muestra experimental.

Este video le mostrará cómo: ajustar la concentración de la muestra experimental por lo que no intenta contar demasiadas o demasiado pocas células; Cómo utilizar un hemacitómetro para contar una alícuota de pequeño (~ 10 μl) de las células; Cómo determinar qué cuadrante de la red de láser hemacitómetro para contar; Cómo calcular el número total de células en la muestra experimental, dependiendo de qué cuadrante fue utilizado; y cómo determinar la viabilidad de la población de la célula experimental mediante exclusión del azul tripán. Además, varias situaciones experimentales que confiable y precisa determinación del número de células es necesario, incluyendo un ejemplo usando un contador de células automatizado, también se discuten.

Procedure

Conteo de células es un paso importante en muchas células-ensayos para determinar la viabilidad y número de células. En general, el objetivo de contar es entender cuánto una muestra de una concentración desconocida de la célula debe diluirse para su uso posterior. La herramienta más común de laboratorio para el conteo de las células es el hemacitómetro.

El hemacitómetro es una herramienta cuenta que fue creada originalmente para el recuento de células sanguíneas. En el centro del hemacitómetro son dos cámaras de conteo, en que un laser grabado al agua fuerte se puede encontrar red.

La red se compone de 9 cuadrantes principales. Los cuadrantes de cuatro esquinas se dividen en 16 cuadrantes más pequeños. El cuadrante central se divide en 25 de estos cuadrantes más pequeños, cada uno de los cuales todavía se divide en 16 micro-cuadrantes.

En el extremo de cada cámara son puertos de introducción de muestra, en el cual se distribuye la muestra de células para ser contado.

A cada lado de las cámaras de recuentos son el cubreobjetos, soporte, sobre las que el cubreobjetos de cuarzo descansa, generalmente de 0,1 mm por encima de la cámara de conteo.

Desde el área de cada cuadrado grande es 1 mm2, el volumen contenido en cada cuadrado grande es 0,1 mm3 o 1/10.000 de un ml.

Antes de contar, siempre tome un momento para usar etanol y un kimwipe para limpiar y secar a pelusa, las huellas o marcas de agua del cubreobjetos y la cámara de conteo.

Añada cuidadosamente una pequeña cantidad de agua a cada uno de lo cubreobjetos, soporte, la tensión superficial del agua llevará a cabo el cubreobjetos en lugar.

Ahora suavemente triturate la suspensión de células, o pipeta hacia arriba y hacia abajo para liberar cualquier celular matas. Utilice una micropipeta para aspirar 10 μl de la suspensión y luego cargar uno de los puertos de introducción con la muestra. La solución se sorteará en la cámara de conteo por acción capilar y debe cubrir la red entera.

Mientras que las células se colocar, seleccione el objetivo. Luego cargar el hemacitómetro en el escenario.

A continuación ve las células bajo el microscopio. Si hay menos de 5 células en cada uno de los cuadrantes grandes, necesitará girar su muestra abajo otra vez y resuspender el precipitado en un volumen más pequeño. Si las células se solapan entre sí o son simplemente demasiado densos para distinguir fácilmente entre sí, puede que necesite diluir la muestra en un volumen mayor de solución. Asegúrese de hacer un seguimiento del factor con el cual están diluyendo las células. Usted necesitará en un cálculo posterior.

¡Ahora es el momento para contar las células!

Como hemos hablado anteriormente, la cámara de conteo está cubierta en una cuadrícula de grabado a láser. Las líneas de los cuadrantes que sea más fácil hacer un seguimiento de las células que está contando. Elegir el cuadrante de tamaño para contar dependiendo de la densidad de las células de su muestra. Por ejemplo, si hay un número bajo de células, contar todas las celdas de uno de los cuadrantes de la esquina. Para las muestras con una cantidad media de células, elija uno de los 16 cuadrantes más pequeños. Si hay una muy alta densidad de células, contar las células en uno de los cuadrantes centrales 25. No importa de que cuadrante eliges o la densidad de la muestra de células, contar por lo menos 20-50 células por superoderecho.

No todas las células caen perfectamente dentro de los cuadrantes. Usted puede contar las células que tocan las líneas superior e izquierdas, pero ignoran los que tocar la parte inferior o derecha unos. Para obtener el recuento más preciso, utilice un contador de células para hacer un seguimiento de las células y tomar la media del número de células en 4 cuadrantes del mismo tamaño.

Para calcular el número de células en un volumen de 1 ml, multiplica el número de células contadas por 10.000, porque, como lo mencionamos antes, cada gran plaza en la parrilla de 1/10.000 de un ml. Si ha contado uno de estos cuadrantes más grandes, simplemente multiplique a este número 1. Si ha contado una de las plazas más pequeñas en uno de los cuadrantes de la esquina, multiplique a este número por 16. Si se cuentan todas las células en uno de los cuadrantes centrales 25, multiplique a este número por 25. Si usted sucedió a diluir su suspensión antes de cargar el hemacyotmeter, también necesitará multiplicar por el factor de dilución.

Entonces, para calcular el número de células en 1 ml de esta muestra, se multiplicarían las 20 células en este cuadrante central 104 y 25 para un total de 5 x 106 células en 1 ml de la muestra.

Ahora que sabemos que el número total de células en 1 ml de la muestra, tenemos que multiplicar a este número por el volumen total de nuestra solución. Por ejemplo, si tenemos 5 x 106 células en 1 ml, 2 ml, tendremos un total de 1 x 107 células.

Entonces, para evitar errores de miscounting, distribución desigual de las células, o los errores de pipeteo, al otro lado de la cámara de carga y contar su muestra de célula una segunda vez.

Conteo de las células bajo el microscopio también es un buen momento para evaluar la viabilidad de las células de su muestra. Tripán azul, un colorante vital, a menudo se mezcla con la muestra antes de ser cargado en el hemacitómetro para este propósito.

Células vivas excluyen este tinte, ya que las células vivas son muy selectivas acerca de lo que permiten a través de sus membranas. Una célula muerta, sin embargo, tienen una membrana intacta, que permite el trypan azul pase a través y tinción del citoplasma.

Para comprobar la viabilidad de su muestra de células, diluir una alícuota de la suspensión celular en trypan azul y luego cargar la muestra teñida de azul tripán al igual que la muestra celular regular. Bajo el contraste de fase, las células vivas aparecerán brillante y dorada y deben ser contadas; no cuentan ninguna de las células embotadas, muertas, azul.

Calcular el número de células como antes, multiplicando al número por el factor de dilución de azul de tripano. Así que si nuestra muestra representativa original primero había sido diluida en trypan azul, luego habría multiplicado nuestro número total de células por el 1:10 dilución de azul de tripano, para un total de 1 x 108 células en nuestra muestra.

Cuando hayas acabado contando, no olvide limpiar el cubreobjetos y la cámara de conteo.

Ahora que eres una célula cuenta pro, vamos a hablar de algunos de los motivos que necesites para saber cuántas células tiene en un experimento particular.

Después de aislar células de un tejido normal o experimental, es importante saber cuántas células has recuperado. Aquí los investigadores querrán saber cuántos esplenocitos, o células de bazo, han aislado de este bazo de ratón.

Cuando esté realizando un experimento para ver cómo dos diferentes poblaciones celulares reaccionan, es importante saber cuántos de cada tipo de célula están mezclando, como en esta cultura Co el experimento con B y T las células.

Se desea saber cuántas células tienen muchos otros tipos de ensayos de célula. Aquí un análisis ELISPOT se está estableciendo para determinar el número de células en una muestra que se secretan IFNγ, una proteína inflamatoria, en respuesta al virus del papiloma humano.

Al realizar un experimento en el cual mRNA debe ser extraído o aisladas, de las células de interés, es importante saber cuántas llamadas vas a empezar, con el fin de adquirir una cantidad suficiente de mRNA para el experimento.

El hemacitómetro es una herramienta barata y relativamente fácil de usar para el recuento de células, pero puede ser tedioso y tiene el potencial para error humano.

El cetro contador automático portátil es, como su nombre indica, una mano llevado a cabo contando el dispositivo que tiene una precisión de conteo mejoradora comparada con el hemacitómetro y que puede discriminar el tamaño y el volumen de las células en una muestra de células.

El contador de células automatizado TC10 evalúa el numero de celular y viabilidad, automáticamente calcula el número total de células en la muestra y permite a las células ser visto en su pantalla de lectura así.

Sólo ha visto introducción de Zeus a la cuenta del celular. En este video repasamos: es lo que un hemacitómetro, cómo contar las células y determinar la viabilidad celular, y algunas de las razones diferentes necesitará contar células. Gracias por ver y no olvide contar las células azules.

Transcript

Cell counting is an important step in many cell-based assays for determining cell number and viability. In general, the goal of counting is to understand how much a sample of an unknown cell concentration should be diluted for further use. The most common laboratory tool for counting cells is the hemacytometer.

The hemacytometer is a counting tool that was originally created for counting blood cells. At the center of the hemacytometer are two counting chambers, upon which a laser etched grid can be found.

The grid is made up of 9 major quadrants. The four corner quadrants are further divided into 16 smaller quadrants. The central quadrant is divided into 25 of these smaller quadrants, each of which is yet further divided into 16 micro-quadrants.

At the far end of each chamber are sample introduction ports, into which the cell sample to be counted is dispensed.

On either side of the counting chambers are the cover slip mounting supports, upon which the quartz coverslip rests, usually about 0.1 mm above the counting chamber.

Since the area of each large square is 1 mm2, the volume contained by each large square is 0.1 mm3 or 1/10,000th of a ml.

Before counting, always take a moment to use ethanol and a kimwipe to clean and dry away any lint, fingerprints, or watermarks from the coverslip and the counting chamber.

Then carefully add a small amount of water to each of the coverslip mounting supports, the surface tension of the water will hold the coverslip in place.

Now gently triturate the cell suspension, or pipette it up and down, to dislodge any cell clumps. Use a micropipette to aspirate about 10 μl of the suspension and then load one of the introduction ports with the sample. The solution will be drawn into the counting chamber by capillary action and should cover the entire grid.

While the cells are settling, select the objective. Then load the hemacytometer onto the stage.

Next view the cells under the microscope. If there are fewer than 5 cells in each of the large quadrants, you may need to spin your sample down again and resuspend the pellet in a smaller volume. If the cells are overlapping each other or are simply too dense to easily distinguish from one another, you may need to dilute your sample in a higher volume of solution. Be sure to keep track of the factor with which you are diluting your cells. You will need it in a later calculation.

Now it’s time to count the cells!

As we talked about earlier, the counting chamber is covered in a laser-etched grid. The lines of the quadrants make it easier to keep track of the cells you are counting. Choose the size quadrant for counting depending on the density of the cells in your sample. For example, if there are a low number of cells, count all the cells in one of the corner quadrants. For samples with a medium amount of cells, choose one of the 16 smaller quadrants. If there is a very high density of cells, count the cells in one of the 25 central quadrants. No matter which quadrant you choose or the density of the cell sample, count at least 20-50 cells per quandrant.

Not all of the cells will fall neatly within the quadrants. You can count the cells that touch the top and left lines, but disregard the ones touching the bottom or right ones. To get the most accurate count, use a cell counter to keep track of the cells and take the average of the number of cells in 4 quadrants of the same size.

To calculate the number of cells in a 1 ml volume, multiply the number of cells counted by 10,000, because, as we mentioned before, each large square on the grid is 1/10,000th of a ml. If you counted one of these larger quadrants, simply multiply this number 1. If you counted one of the smaller squares in one of the corner quadrants, multiply this number by 16. If you counted all of the cells in one of the 25 central quadrants, multiply this number by 25. If you happened to dilute your cell suspension before loading the hemacyotmeter, you will also need to multiply by the dilution factor.

Then, to calculate the number of cells in 1 ml of this sample, we would multiply the 20 cells in this central quadrant by 104 and 25 to get a total of 5 x 106 cells in 1 ml of the sample.

Now that we know the total number of cells in 1 ml of the sample, we need to multiply this number by the total volume of our solution. So for example, if we have 5 x 106 cells in 1 ml, then in 2 ml, we will have a total of 1 x 107 cells.

Then, to avoid errors from miscounting, uneven distribution of cells, or pipetting errors, load the other side of the chamber and count your cell sample a second time.

Counting the cells under the microscope is also a great time to evaluate the viability of the cells in your sample. Trypan blue, a vital stain, is often mixed with the sample prior to being loaded into the hemacytometer for this purpose.

Live cells exclude this dye, because living cells are very selective about what they allow through their membranes. A dead cell, however, does not have an intact membrane, which allows the trypan blue to pass through and stain the cytoplasm.

To check the viability of your cell sample, dilute an aliquot of your cell suspension in trypan blue, and then load the trypan blue stained sample just like the regular cell sample. Under the phase contrast, the live cells will appear bright and golden and should be counted; do not count any of the dull, dead, blue cells.

Calculate the number of cells as before, this time multiplying the final number by the trypan blue dilution factor. So if our original representative sample had first been diluted in trypan blue, we then would have multiplied our total number of cells by our 1:10 trypan blue dilution, for a total of 1×108 cells in our sample.

When you’re finished counting, remember to clean the coverslip and counting chamber!

Now that you are a cell counting pro, let’s talk about some of the reasons you might need to know how many cells you have in a particular experiment.

After isolating cells from a normal or experimental tissue, it’s important to know how many cells you’ve recovered. Here the investigators will want to know how many splenocytes, or spleen cells, they have isolated from this mouse spleen.

When you are performing an experiment to see how two different cell populations react, it’s important to know how many of each cell type you are mixing together, like in this co-culture experiment with B and T cells.

You will want to know how many cells you have for many other types of cell-based assays. Here an ELISPOT assay is being set up to determine the number of cells in a sample that will secrete IFNγ, an inflammatory protein, in response to the human papilloma virus.

When performing an experiment in which mRNA needs to be extracted, or isolated, from your cells of interest, it’s important to know how many calls you’re starting with, in order to acquire a sufficient amount of mRNA for the experiment.

The hemacytometer is an inexpensive and relatively easy to use tool for counting cells, but it can be tedious and has the potential for human error.

The Scepter Handheld Automatic Counter is, as the name implies, a hand held counting device that has an improved counting accuracy compared to the hemacytometer and that can discriminate both the size and volume of the cells in a cell sample.

The TC10 automated cell counter evaluates both cell number and viability, automatically calculates the total cell number in your sample, and allows the cells to be viewed on its readout screen as well.

You’ve just watched JoVE’s introduction to cell counting. In this video we reviewed: what a hemacytometer is, how to count cells and determine cell viability, and some different reasons you may need to count cells. Thanks for watching and remember not to count the blue cells!

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