Construcción de un microscopio de alta resolución con capacidades de captura óptica convencional y holográfica
22 de abril de 2013
El sistema descrito en este documento emplea una trampa óptica tradicional, así como una línea de trampas ópticas holográficas independiente, capaz de crear y manipular múltiples trampas. Esto permite la creación de disposiciones geométricas complejas de partículas de refracción a la vez que permite mediciones simultáneas de alta velocidad, de alta resolución de la actividad de enzimas biológicas.
En este procedimiento, se ensambla y alinea una línea de atrapamiento óptico convencional y holográfica. Para lograr esto, primero mida las ubicaciones de los componentes ópticos, luego monte los componentes de forma segura en sus ubicaciones adecuadas. A continuación, alinee la óptica para permitir el atrapado. El paso final es bloquear el haz TED del espejo holográfico.
En última instancia, el sistema terminado permite el atrapado holográfico y ordinario simultáneo. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el trampeo ordinario solo, es que permite el posicionamiento simultáneo de múltiples objetos refractivos en tres dimensiones y mediciones rápidas de manipulación de objetos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el diseño, la disposición y la alineación pueden ser un desafío.
El punto de partida de este video es un banco óptico con el microscopio colocado para crear una trampa óptica a 980 nanómetros. Comience con uno de los diodos láser fácilmente disponibles de esa longitud de onda. Utilice un láser de inclinación de cerdo con polarización, conservando la fibra monomodo del diámetro de campo de modo conocido.
La fibra debe ser lo suficientemente larga como para actuar como un filtro de modo y debe terminarse con un conector de canal de fibra con un conector FCPC o un conector F-C-A-P-C. La fibra óptica monomodo debe manipularse con cuidado, se deben evitar las torsiones. Asegure el diodo láser y el soporte que permite el control de la potencia y la temperatura.
La montura debe fijarse directamente al banco óptico para maximizar el disipador de calor pasivo. A continuación, monte el conector de fibra en la óptica de agrupación del haz. Asegúrese de que el puerto de fibra elegido coincida con el diámetro de campo modal del diodo.
La fibra flexible conecta el adaptador de clasificación a la mesa óptica a una distancia suficiente del microscopio para permitir la expansión del enrutamiento del haz y la colocación de otros componentes. Los colores de las varillas se pueden usar para fijar el espaciado de la lente para un posicionamiento robusto y repetible. Ajuste el puerto de fibra para garantizar un desperdicio de haz consistente a distancias comparables a la trayectoria general del haz al microscopio.
Hay cinco espejos en el camino del rayo láser DDE. A partir del láser dde, hay dos espejos para dirigir su salida a la carcasa del microscopio. El haz también tiene que pasar a través de un espejo dicroico, lo que permite la transmisión sin disminuciones del haz de diodo láser a 45 grados con respecto al ángulo de incidencias.
Por último, dos espejos diic de paso corto adicionales que transmiten luz visible, pero reflejan el infrarrojo cercano y superior. Dirija el haz hacia adentro y hacia afuera del microscopio. El espacio infinito uno está dentro de la carcasa del microscopio para ajustar los espejos, quitar el objetivo del microscopio.
Utilice los espejos y una tarjeta de visión infrarroja para dirigir el haz a través de la abertura en la etapa de montaje del objetivo. Si la viga está descentrada, ajuste los espejos para fijar la alineación de modo que la viga esté en el centro. Al montar lentes, un sistema de jaula puede resultar en un ensamblaje rígido.
Los calibradores se pueden usar para medir previamente las distancias entre las lentes a lo largo de las varillas de la jaula antes de la instalación. Monte temporalmente un puntero láser rojo con un adaptador personalizado en lugar del objetivo para que su haz esté a lo largo del eje óptico del microscopio. Utilice el rayo del puntero láser visible para colocar y alinear aproximadamente el expansor de haz de 980 nanómetros.
Esta configuración utiliza lentes con una distancia focal de 60 milímetros y 125 milímetros en una disposición keary para aproximadamente duplicar la cintura del haz. A continuación, instale las lentes de dirección de 980 nanómetros utilizando el haz de puntero como guía aquí. Cada lente tiene una montura de distancia focal de 60 milímetros, la primera lente en la trayectoria del haz en una etapa de precisión X, Y, Z con un rango de recorrido de al menos media pulgada para permitir la dirección del haz.
La segunda lente ahora se puede colocar para formar una disposición de uno a uno con la primera lente. Esta lente debe colocarse de manera que se conjugue ópticamente con el plano focal posterior del objetivo. Para preparar la trampa holográfica, monte el láser de 1064 nanómetros en una plataforma elevada aproximadamente a la altura del haz de 980 nanómetros.
Coloque una placa de media onda y un polarizador justo después de la salida del láser. Para permitir el ajuste manual de la potencia del láser. Instale el expansor de haz para este láser de modo que el residuo del haz se expanda para que coincida con el tamaño diagonal del espejo holográfico.
Si está limitado por el espacio, use lentes con distancias focales pequeñas, 16 milímetros y 175 milímetros. Ahora use el rayo del puntero láser para posicionar el modulador de luz espacial o SLM, que es parte del paquete holográfico comercial utilizado. En este experimento, el modulador de luz espacial debe colocarse de manera que se conjugue ópticamente con el plano focal posterior del objetivo.
Colóquelo de modo que el haz del puntero láser tenga el mínimo ángulo posible de incidentes, pero de modo que su reflexión despeje de forma segura todo el hardware de la mesa óptica. Coloque otro espejo frente al expansor de rayo láser de 1064 nanómetros para dirigir su luz al modulador de luz espacial. Asegúrese de que la luz del puntero láser incida en el centro de la apertura del expansor de haz.
Por último, instale un par de lentes de telescopio entre el modulador de luz espacial y el espejo dicroico. Estas lentes tienen distancias focales de 125 milímetros y 200 milímetros. Retire el puntero láser, deje el soporte del adaptador personalizado para que sirva como apertura de alineación de rumbo.
Comience a verificar la alineación usando solo el haz de 980 nanómetros. Utilice un visor de tarjetas de infrarrojos para alinear el haz de 980 nanómetros a lo largo del eje central de la apertura en el adaptador personalizado. A continuación, utilice la tarjeta infrarroja para asegurarse de que el haz de 1064 nanómetros llegue a los mismos puntos que el haz de 980 nanómetros a lo largo de su trayectoria de haz compartida.
Una vez hecho esto, reemplace el adaptador de montaje del puntero láser personalizado con un objetivo de aceite o agua de alta apertura numérica. A continuación, alinee la trampa de 980 nanómetros haciendo caminar el rayo láser hasta que se vea un patrón de interferencia radialmente simétrico en la cámara con el espejo holográfico apagado. Alinee la trampa de 1064 nanómetros utilizando el modulador de luz espacial y el primer espejo dicroico que camine por el haz de 1064 nanómetros UN DEFRACTED.
En este ejemplo, la imagen alineada para ambas trampas indica una buena alineación para un reventado eficiente, pero se puede refinar aún más. También hay aberraciones menores asociadas con el haz redondo 1064, que golpea un espejo SLM cuadrado, que no se pueden eliminar fácilmente refinando la alineación de la lente. Con el fin de bloquear la trampa producida por el haz subactuado del modulador de luz espacial, inserte un pequeño objeto opaco en la trayectoria de la luz subactuada en una ubicación conjugada con el plano de muestra para este sistema.
Una microesfera opaca de 100 a 300 micras de diámetro, que es de metal, se pega a una cubierta o ventana de vidrio redondo transparente infrarrojo. El bloque se coloca en el punto focal común de las lentes, que se conjuga ópticamente con el plano de la muestra. Si los haces de captura ópticos se inyectan en el espacio infinito del microscopio, el bloqueador de haz se puede colocar para bloquear la luz no remitida o se puede mover para permitir el paso de toda la luz.
La configuración ensamblada permite al operador atrapar múltiples objetos refractivos en tiempo real y colocarlos en las tres dimensiones en el campo de visión. Aquí, las capacidades holográficas del instrumento se muestran mediante la captura de microesferas, suspendidas en agua desionizada, los círculos rojos y verdes muestran las posiciones de las trampas con el verde indicando una trampa seleccionada para reposicionar en este clip, la reproducción se acelera después de atrapar un objeto. Su trampa se reposiciona manualmente.
El arreglo final tiene 11 cuentas que representan el logotipo de la Universidad de Utah donde se realizó este experimento. El sistema también permite el uso de las trampas holográficas y convencionales juntas. Aquí el operador define y controla dos filas de trampas holográficas.
Se define una trampa convencional adicional entre las dos filas. Las microesferas suspendidas en agua desionizada están unidas por las trampas. El cordón central se mueve a un desplazamiento espacial máximo de 4,1 micrómetros y luego se devuelve a su ubicación original en las mismas circunstancias.
Pero con la cuenta central moviéndose a 82 micrómetros por segundo, se produce esta secuencia de fotogramas. Observe el desenfoque de movimiento en la segunda y tercera imagen. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar y alinear un sistema de trampa óptica dual con trampa holográfica y normal independientes en la misma configuración.
No olvide que trabajar con láseres de alta potencia puede ser extremadamente peligroso y tome precauciones como usar gafas protectoras adecuadas.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este artículo describe un sistema que integra técnicas de atrapamiento óptico convencional y holográficas, permitiendo la manipulación de múltiples trampas. Este enfoque innovador facilita la creación de arreglos geométricos complejos de partículas refractivas mientras permite mediciones de alta velocidad y alta resolución de la actividad de enzimas biológicas.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Atrapamiento óptico
- Biofísica
- Medición de la actividad enzimática
Antecedentes
- Los métodos de atrapamiento óptico tradicionales están limitados en su capacidad para manipular múltiples objetos simultáneamente.
- El atrapamiento óptico holográfico ofrece mayor flexibilidad en el posicionamiento y manipulación de partículas.
- Combinar estas técnicas puede mejorar la precisión y velocidad de medición.
- Los nuevos usuarios pueden enfrentar desafíos en el diseño y alineación de los componentes ópticos.
Propósito del estudio
- Desarrollar un sistema que permita el atrapamiento óptico convencional y holográfico simultáneo.
- Permitir la manipulación de múltiples objetos refractivos en tres dimensiones.
- Facilitar mediciones rápidas de la actividad de enzimas biológicas.
Métodos utilizados
- Ensamblaje y alineación de componentes de atrapamiento óptico.
- Medición de ubicaciones para componentes ópticos.
- Montaje seguro de componentes en posiciones designadas.
- Alineación de ópticas para permitir un atrapamiento efectivo.
Resultados principales
- El sistema integra exitosamente técnicas de atrapamiento convencional y holográficas.
- Permite el posicionamiento simultáneo de múltiples objetos refractivos.
- Se lograron mediciones de alta velocidad de la actividad enzimática.
- Los usuarios reportaron desafíos en la configuración inicial pero reconocieron las ventajas del sistema.
Conclusiones
- El sistema desarrollado mejora las capacidades de las técnicas de atrapamiento óptico.
- Proporciona ventajas significativas para los investigadores que estudian procesos biológicos.
- Puede ser necesaria una capacitación adicional para que los nuevos usuarios dominen la configuración.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Optical trapping systems enable precise manipulation of refractive objects for high-resolution force and motion measurements at nanometer and piconewton scales. Integrating conventional and holographic trapping allows simultaneous multi-object positioning and real-time 3D control, supporting mechanistic studies of molecular interactions and cellular mechanics. This capability enhances predictive confidence in target validation by enabling quantitative assessment of binding forces and conformational changes under physiological conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of molecular binding forces and complex formation dynamics.
- Operational Value: Provides functional target validation by measuring piconewton-scale forces generated by molecular motors or enzyme activity in real time.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating quantitative force-displacement data that correlates with target engagement and mechanism of action.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enabling controlled manipulation of dielectric beads or cellular organelles as force sensors.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through precise positioning and simultaneous readout of trap position relative to object motion.
- Scalability: Supports screening readiness via holographic pattern generation for parallel trapping of multiple objects in the field of view.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance by enabling measurement of nanoscale mechanical properties in primary cells or tissue-derived models under near-physiological conditions.
- Mechanistic De-risking: Connects discovery observations to preclinical validation through force-production readouts that inform target modulation strategies.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by quantifying how perturbations affect mechanical output in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The system fits within the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing quantitative biophysical readouts that inform target prioritization and mechanism elucidation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct measurement of intermolecular forces and conformational changes in protein complexes.
- Screening: Delivers assay readiness through high-speed, high-resolution position tracking of trapped objects, facilitating reliable compound evaluation via force-based readouts.
- Analytics: Generates nanometer-scale displacement and piconewton-force measurements that allow teams to compare conditions and assess target modulation efficacy.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling mechanical phenotyping in disease-relevant cellular systems, supporting biomarker alignment for mechanotransduction pathways.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for multi-parametric analysis across projects, reducing redundant setup and enabling cross-team standardization of force measurement protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence through direct, label-free measurement of mechanical outputs that reduce ambiguity in target mechanism interpretation.
- Operational Value: Ensures standardization and scalability via holographic trapping patterns and simultaneous multi-object control, improving throughput in force measurement campaigns.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by enabling early de-risking of targets through quantitative force data, reducing late-stage failure due to unanticipated mechanical liabilities.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by delivering objective, quantitative data on target engagement strength and conformational dynamics across candidate molecules.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, laser safety, and beam path optimization for dual-wavelength trapping systems.
- Depends on stable optical bench infrastructure, precision translation stages, and infrared-compatible components for 980 nm and 1064 nm laser integration.
- Necessitates cross-team standardization of trapping protocols, calibration procedures, and data analysis pipelines for force and displacement readouts.
- Involves adaptation considerations when transitioning from bead-based assays to primary cells or tissue explants due to varying refractive indices and sample viability constraints.
- Limited by alignment complexity and potential aberrations from mismatched beam profiles, particularly when holographic patterns interact with spatial light modulator geometry.
