Mejora de la preparación y conservación de las rebanadas de hipocampo de un ratón de grabación muy estable y reproducible de la potenciación a largo plazo

En este trabajo se presenta una metodología completa para preparar y conservar

El objetivo general de este procedimiento es poder registrar una potenciación muy estable y reproducible a largo plazo en cortes agudos del hipocampo. Esto se logra extrayendo primero el cerebro del ratón y diseccionando el hipocampo en un líquido cefalorraquídeo A frío bajo el microscopio. El segundo paso es cortar las rodajas transversales del hipocampo con un picador de tejidos.

A continuación, el corte se coloca en la cámara de registro de la interfaz, que se perfundirá con líquido cefalorraquídeo artificial oxigenado. El paso final es colocar los electrodos y registrar la actividad sináptica en la CA, una región del hipocampo. En última instancia, se utiliza un protocolo de estimulación de alta frecuencia para mostrar la inducción de una potenciación muy estable a largo plazo.

A través de este método se puede proporcionar información sobre el mecanismo subyacente a la plasticidad sináptica. También se puede aplicar a otros sistemas, como modelos animales del sistema neurodegenerativo o nervioso, o a enfermedades inmunitarias. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque todas las manipulaciones requieren una gran habilidad y mucha práctica.

Comience este procedimiento enjuagando el circuito de perfusión con agua destilada durante un mínimo de 20 minutos. A continuación, encienda los sistemas de calefacción. Enciende el burbujeo del cárgeno en el circuito.

El carbógeno se suministra al baño de agua debajo de la cámara de registro a través de difusores de aire. A continuación, controle el caudal en el baño de agua mediante un medidor de flujo Luego, drene el circuito y llénelo con un grifo de CSF filtrado para eliminar las burbujas. A continuación, coloque el anillo, que sostendrá la rebanada en la cámara de sujeción.

Retire con cuidado todas las burbujas de aire del circuito. Luego ajuste el nivel de CSF A en la cámara de registro con el tornillo de la aguja de succión, la velocidad de la bomba de entrada se ajusta a un mililitro por minuto y la bomba de salida se ajusta a cinco mililitros por minuto. Antes de la disección, prepare todo el instrumental quirúrgico.

Para quitarle el cerebro a un ratón sacrificado. Sostenga su cabeza con el dedo índice y el pulgar, y haga una incisión con las tijeras de disección a lo largo de la mitad de la parte superior de la cabeza, comenzando en el borde de la guillotina, corte y recorra el hueso frontal. A continuación, corte el músculo cutáneo a cada lado de la cabeza para exponer completamente las placas del cráneo.

A continuación, retira los músculos del lado de la cabeza. Posteriormente, corte el músculo temporal a cada lado a lo largo de la placa temporal. A continuación, corte las placas frontales por la mitad transversalmente.

Ahora haz un pequeño corte en el hueso occipital entre las dos placas. Corta en la base de las placas occipitales a cada lado. Luego, con las tijeras de resorte, corte a lo largo de la sutura sagital.

Finalmente, retira el cráneo separando las mitades entre sí con fórceps. Ahora, con el bisturí cortado justo antes del cerebelo y justo después del bulbo olfativo, transfiera transversalmente el cerebro extraído a la placa de disección con LCR A frío. Una vez que el cerebro está emergido en la placa de disección, corte los dos hemisferios entre sí con un bisturí insertado en el medio bajo un microscopio quirúrgico binocular, extienda cuidadosamente la estructura de un hemisferio para revelar el ventrículo lateral.

Extirpar el tronco encefálico y el céfalo colocando una espátula en la corteza frontal y la otra espátula en el céfalo. Tenga cuidado de no tocar el hipocampo con la espátula y de no estirarlo durante el corte del tejido. Después de eso, corta el fórnix.

Luego, empuje suavemente el hipocampo fuera de la corteza insertando una espátula en el ventrículo. Cuando se extraiga el hipocampo, retire el exceso de tejido cortical y los vasos sanguíneos restantes con una pipeta de plástico de boca ancha. Transfiera el hipocampo en una cuchara con su superficie alvi hacia arriba a la plataforma del picador.

Elimine el exceso de líquido de la cuchara con una pipeta de plástico estándar para pastos. Después de eso, incline la cuchara hacia arriba verticalmente y casi tocando el papel de filtro en la picadora. Deja caer el hipocampo tocando rápidamente el papel de filtro.

A continuación, retire la cuchara. A continuación, orienta el hipocampo y córtalo en rodajas. Transversalmente a 400 micras con el picador.

Realice el procedimiento lo más rápido posible. A continuación, retira el papel de filtro con las rodajas del hipocampo y envuélvelo alrededor del cilindro metálico para extender un poco las rodajas. A continuación, libere las rodajas con pulverizaciones de LCR A utilizando una pipeta pastoral de plástico estándar y recójalas en una placa de Petri llena de frío.

Un líquido cefalorraquídeo. Transfiera el corte seleccionado a la cámara de registro con una pipeta de plástico estándar. Permita que el corte se recupere del trauma de disección en la cámara de interfaz de registro a 28 grados Celsius.

Si el sector se hunde, baje el nivel de CSF A al nivel de corte y, a continuación, vuelva a subir el nivel de CSF A para que el sector flote. Después de eso, oriente el corte a la posición que facilitaría el posicionamiento de los electrodos en la región CA uno. Deje de bajar el nivel de A CSF cuando esté en la interfaz.

El menisco de la media alrededor de la rebanada es indicativo de un nivel suficiente de LCR A. La malla debe estar saturada de medios, pero no completamente sumergida. A continuación, mantenga la cámara cubierta con papeles de filtro sobre la tapa perforada.

Deje reposar la rebanada durante al menos una hora y 30 minutos a 28 grados centígrados antes de grabar. Aquí hay un boceto que muestra dos entradas sinápticas independientes como una y S dos para la misma población neuronal. Se utilizó la vía S uno para inducir LTP, mientras que la vía S dos actuó como control.

Estas son las trazas de muestra F-E-P-S-P registradas justo antes de la inducción de LTP como lo indican las trazas rojas y una hora después de la inducción de LDP indicada por las trazas azules. Aquí están las EPSP F de una rebanada perfectamente sana, y aquí están las EPSP F de una rebanada que presenta un alto nivel de excitabilidad cuando las rebanadas no están perfectamente sanas. Se observan respuestas polisinápticas y se reduce la potenciación de la pendiente F-E-P-S-P.

A continuación se presenta una comparación de los cursos temporales de la pendiente F-E-P-S-P después de la LTP inducida por un solo tren de estimulación de alta frecuencia registrado en 2005, 2010 y 2011 en nuestro laboratorio. Los primeros experimentos se registraron en 2005 indicados por círculos rellenos. Los registros posteriores indicados por cuadrados rellenos se beneficiaron de un procedimiento de disección mejorado.

Los resultados actuales surgen de la optimización de la oxigenación de la interfaz y el control de la temperatura, junto con la estandarización de los electrodos según lo indicado por los círculos abiertos. Aquí mostramos que el aumento del caudal de oxígeno en el baño de agua debajo de la cámara de registro de 0,15 a 0,25 litros por minuto, como lo indica la curva azul, induce una disminución en la pendiente F-E-P-S-P en un 20%, aumentando la temperatura de 28 a 29 grados Celsius. Como se ha indicado, la curva verde induce un aumento de más del 50% en la pendiente F-E-P-S-P.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que cada paso es crucial y que los errores en el protocolo pueden conducir a resultados diferentes. Después de ver este video, tendrá una buena comprensión de cómo obtener una potenciación muy estable a largo plazo. Registro en cortes agudos del hipocampo.