Name: Mejora de la preparación y conservación de las rebanadas de hipocampo de un ratón de grabación muy estable y reproducible de la potenciación a largo plazo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprende a preparar rebanadas de hipocampo de ratón para registrar potenciación a largo plazo estable durante más de 8 horas. Este protocolo mejora la reproducibilidad en estudios de plasticidad sináptica.

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Damos las gracias a Bernard Foucart de asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por el Fondo Belga para la Investigación Científica (FRS-FNRS) y por el Fondo de la Reina Elisabeth de Investigación Médica. Agnès Villers es Investigador Asociado en el Fondo Belga para la Investigación Científica.

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de los reglamentos para el cuidado y uso de animales en la investigación y con el acuerdo del comité de ética local. 1. Preparación artificial de fluido cerebro-espinal Los mismos medios de comunicación se utiliza para diseccionar, cortar y perfundir rebanadas (1 ml / min) durante el período de reposo y los registros electrofisiológicos. Este medio está compuesto de 124 mM de NaCl, 4,4 mM de KCl, 26 mM de NaHCO3, 1 mM NaH 2 PO 4, 2,5 mM de CaCl2, 1,3 mM MgSO4 y 10 mM de D-glucosa. <ol><li> Pesar los diferentes componentes para 2 l de MgSO4 ACSF excepto que ya está en solución (1 M). Usando una solución estándar permite estar seguro de la concentración exacta de Mg 2 + porque MgSO4 en polvo es altamente higroscópico. Ca 2 +: Mg + 2 ratio influye mucho en la inducción y mantenimiento de LTP14 y por lo tanto sus proporciones deben ser siempre respetados. </li><li> Poner todos los componentes, excepto CaCl2 en un vaso aforado y llevar a 2 L con agua destilada H 2 O. </li><li> Agitar vigorosamente. Cuando todo esté disuelto, añadir carbógeno través de un burbujeador de acuario y tubo conectado al depósito (95% O 2, 5% de CO 2). Espere unos minutos y añadir cloruro de calcio cuando el pH se fija en 7,4 por la acción de tampón de bicarbonato. </li><li> Mantenga 600 ml en un plato de cristal rectangular refrigerado y enfriar a 4 ° C con hielo alrededor del plato. Estos medios serán utilizados para la disección hipocampo. </li><li> Filtrar el 1400 ml restantes y mantenerse en un erlenmeyer. </li></ol> 2. Preparación del Rig electrofisiológico y el corte de cerebro Cámara de grabación El circuito de perfusión es de 2 bombas peristálticas, uno bombear fluido fresco de un tanque de reserva y el otro de bombeo de fluidos utilizados en tque la grabación cámara a un bin. Se añade fluido fresco a un sistema de perfusión hecha en casa donde se reoxigene y se calentó antes de llegar a la cámara de grabación de interfaz por gravedad (Figura 1A). La cámara de grabación de interfaz fue diseñada por FST (Herramientas de Bellas ciencia, Vancouver, Canadá, Figura 1B). Rodajas de tejido se colocan en el filtro de red tejida unidos a un anillo bien extraíble y se puede mantener continuamente bajo condiciones de interfaz mediante el ajuste de la altura de la aguja de aspiración así. Un tubo de plástico de fabricación casera bloqueado en su extremo y perforada lateralmente (0,5 mm) se fija a la aguja de aspiración para aumentar la estabilidad de nivel en la cámara. El cabezal de impresión está montado sobre un baño de agua que contiene una piedra de dispersión de gas que ayuda a mantener un ambiente húmedo haciendo pasar aire húmedo a través de los puertos de deflexión en el cabezal de impresión (para disminuir la formación de gotitas de agua). Baño y media temperatura son controlados por la variación continua del nivel de DC th actualáspero una silicona de goma incorporado elemento calentador en el baño de agua. Termistores en el baño de agua y pozos de registro permiten la temperatura de la cámara para ajustar y controlar con precisión en estos sitios. El sistema de calefacción de la cámara se completa con un sistema de calentamiento global de control de la temperatura de todo el equipo de perforación. El software desarrollado por investigadores de la Universidad de Edimburgo ( <a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a> ) supervisa e iguala la temperatura del aire oxigenado, la porción del cerebro, los electrodos y la plataforma queda proporcionando un ambiente estable para grabaciones de larga duración (Figura 1C) . La temperatura usada para cortes de hipocampo de ratón es 28 ° C. <ol><li> Enjuague todo el circuito de perfusión con H2O destilada durante un mínimo de 20 minutos y empezar los sistemas de calefacción. </li><li> Iniciar el burbujeo carbógeno en el circuito. Carbogen llega a los caseros a través de tubos de perfusión fvelas Ilter y en el baño de agua por debajo de la cámara de registro. La velocidad de flujo en el baño de agua está controlada por un medidor de flujo. Si el caudal es demasiado lento, el tejido podría llegar a ser hipóxico. A la inversa, si la tasa de flujo es demasiado alta, el gas podría no ser suficientemente calentada y humectada que conduce a secado del tejido. Tasa de flujo de gas de alta también podría aumentar la posibilidad de pulverización de agua sobre el tejido del baño de agua por debajo que conduce a choque osmótico. Esto se puede evitar mediante la adición de bits de malla de nylon (100 micras) en la salida de los puertos de deflexión. </li><li> Vaciar el circuito y se llenan de ACSF filtrada. </li><li> Coloque el anillo que apoyará el corte en la cámara de retención. Un filtro de red tejida con aberturas de malla que van de 500 a 750 micras se estira y unido al anillo con dos partes de resina epoxi pegamento. El filtro de red tejida está hecha de 87% poliamida y 13% elastano (Panty 15 den). Pegamento se debe aplicar cuidadosamente para evitar la formación de relieves en la superficie del ring. </li><li> Retire con cuidado todas las burbujas de aire del circuito. </li><li> Ajuste el nivel de ACSF en la cámara de registro con el tornillo de la aguja de aspiración. La velocidad de las bombas peristálticas se ajusta a 1 ml / min para la entrada de la bomba y a 5 ml / min para la salida de la bomba. </li></ol> El sistema de perfusión se coloca sobre una mesa de vibración-resistente y rígido rodeado por una jaula de Faraday. 3. Preparación de la zona de disección Los instrumentos quirúrgicos: un bisturí con una hoja # 11, unas tijeras pequeñas estándar disección, tijeras, pinzas de resorte curvas, dos Heidemann espátulas y una cuchara. Material complementario: una guillotina, una almohadilla inferior, un cortador de tejidos McIlwain con una hoja de afeitar, papel de filtro, una pipeta Pasteur de vidrio con una tetina de goma, 2 Pipetas Pasteur plástico uno de los cuales con una boca ancha, una placa de Petri, un cilindro metálico de 7 mm de diámetro (Figura 2A). <ol><li&gt; En el plato de disección llena de frío ACSF (preparado en el paso 1), sumerjo una tapa de vidrio refrigerada de una placa de tinción, envuelto en papel de filtro. Retire con cuidado las burbujas de aire y oxigenar la ACSF a través de un burbujeador de acuario (Figura 2A). </li><li> Diseñar instrumentos con el fin de uso. Añadir tres capas de papel de filtro en la placa de cortador de tejidos y una nueva hoja de afeitar limpia con agua destilada y éter (Figura 2B). La cuchilla debe ser horizontal cuando toca el papel. Fuerza de la cuchilla se ajusta a la mitad del valor máximo y la velocidad a aproximadamente un tercio del valor máximo. </li><li> Atentamente comprobar si todo está listo (instrumentos, temperatura ...) porque no tendrá tiempo después. </li><li> Pídale a alguien que rociar la disección con una pipeta Pasteur llena de ACSF frío. </li><li> Anestesiar el ratón con IP Nembutal (100 mg / kg) antes de la decapitación. Anestesia con halotano también se puede utilizar. Hemos comparado los dos métodos y obtaINED mismos resultados. Decapitación debe realizarse bajo anestesia pero dislocación cervical también puede ser utilizado. Sin embargo dislocación cervical necesita una muy buena práctica para evitar el sufrimiento de los animales. </li><li> Disección de la underpad lo antes posible bajo la ducha continua ACSF frío. </li></ol> 4. La extracción del cerebro <ol><li> Mientras mantiene todavía la cabeza con el dedo índice y el pulgar de una mano en la boca del cañón, hacer una incisión con las tijeras de disección a lo largo de la mitad de la parte superior de la cabeza de partida en el borde del corte de guillotina y funcionando rostral al hueso frontal . </li><li> Cortar a través del músculo cutáneo en cada lado de la cabeza para exponer completamente las placas de cráneo y eliminar los músculos en el lado caudal de la cabeza. </li><li> Con las tijeras de disección, corte el músculo temporal en cada lado, a lo largo de la placa temporal, a continuación, cortar las placas frontales en el medio, transversalmente. A continuación, hacer un pequeño corte en el hueso occipital, entre los dos plates. </li><li> Para cada lado, cortado en la base caudal de las placas occipitales. </li><li> Corte a lo largo de la sutura sagital con unas tijeras de primavera. </li><li> Con unas pinzas, retire las mitades de cráneo, mediante la difusión de lejos el uno del otro. </li><li> Con el bisturí, cortado transversalmente justo después de que el bulbo olfatorio y justo antes de que el cerebelo entonces sumergirse el cerebro extraído en el plato de disección con ACSF frío. </li></ol> 5. Disección del hipocampo <ol><li> Una vez que el cerebro está sumergido en el plato de disección, cortar los dos hemisferios de uno al otro con un escalpelo insertado en el centro. </li><li> La disección de hipocampo se realiza con espátulas bajo control visual a través de un microscopio quirúrgico binocular (X25, Figura 2A). En uno de los hemisferios, se extendió con cuidado las estructuras para ver el ventrículo lateral. Retirar el tallo cerebral y el diencéfalo. Esto se hace mediante la aplicación de la espátulas en la corteza frontal en un lado y en el diencéfalo en laotro lado. Tenga cuidado de no tocar el hipocampo con espátulas y no estirarlo durante el corte del tejido. </li><li> Sever el fondo de saco y luego empuje suavemente el hipocampo de la corteza (removerá), mediante la inserción de una espátula en el ventrículo. </li><li> Cuando se extrae el hipocampo, eliminar el exceso de tejido de la corteza y el resto de los vasos sanguíneos. </li></ol> 6. El corte de las rebanadas <ol><li> Con un plástico de boca ancha pipeta Pasteur, transferir el hipocampo en una cuchara con su superficie hacia arriba Alvear (lado convexo). </li><li> Retire el exceso de líquido con una pipeta Pasteur de plástico estándar. </li><li> Incline la cuchara verticalmente casi tocando el papel de filtro del helicóptero (Figura 2B) y dejar el hipocampo de la cuchara, tocando rápidamente el papel de filtro y retírese la cuchara. </li><li> Orientar el hipocampo y cortarlo transversalmente a 400 micras con el helicóptero (véase la figura 2C para la orientación del hipocampopus con respecto a la hoja de afeitar). Actuar lo más rápidamente posible. </li><li> Retire el papel de filtro con el hipocampo en rodajas y se envuelve alrededor del cilindro metálico para difundir las rodajas un poco. Entonces, sin los cortes con chorros de ACSF utilizando un plástico pipeta Pasteur y su recopilación en una placa de Petri llena de ACSF fría estándar. </li></ol> 7. La incubación de las rebanadas de la interfaz de <ol><li> Seleccionar rebanadas con un plástico pipeta Pasteur estándar y rápidamente colocarlos en la cámara de registro. Rebanadas recuperarse del trauma disección directamente en la cámara de registro, en la interfaz a 28 ° C. </li><li> El corte lo más probable fregadero. Baje el nivel de líquido para alcanzar el nivel de macro, y luego elevarlo a hacerlo flotar. </li><li> Gire el corte en la posición correcta mientras que la reducción del nivel. Las rebanadas son siempre orientado en la misma forma para facilitar la colocación de los electrodos (2 estimulante y uno electrodos de registro) en la región CA1. </li><li> Deténgase cuandoel fluido es en la interfaz. Un &quot;menisco&quot; de los medios de comunicación alrededor de la rebanada es indicativo de un nivel suficiente de medios de comunicación. El filtro de red debe estar saturado con los medios de comunicación, pero no completamente sumergido. </li><li> Mantenga la cámara cubierta con papel de filtro colocado sobre la tapa perforada. </li><li> Dejar reposar la rebanada durante al menos 1,5 horas a 28 ° C. </li></ol> 8. Grabación de las respuestas sinápticas <ol><li> Grabación de electrodo: capilares de vidrio se retiró para obtener una resistencia a punta de 2-5 mW cuando se llena de ACSF. Un pequeño trozo de papel de filtro se coloca alrededor de la punta del electrodo y la cera de hueso se aplica en la extremidad para reducir la condensación. Electrodos de estimulación: platino iridio electrodos bipolares de racimo con un diámetro de 12,5 micras se compran a FHC (EE.UU.). Con el cuidado adecuado, cada electrodo se puede utilizar al menos 30 veces (Figura 1B). </li><li> La posición de los electrodos en el stratum radiatum de la región CA1, todos los electrodos alineadosarriba (Figura 3A). Los electrodos se bajaron 75 a 150 micras debajo de la superficie de la rebanada con micromanipuladores Narishige. Los dos electrodos de estimulación se colocan para estimular dos paquetes distintos de Schaffer colaterales. Cuando los electrodos se bajan en el sector, filtros de papel son cuidadosamente colocados a su alrededor para cerrar la cámara. </li><li> La estimulación bifásica (0,08 mseg duración del pulso por medio de la onda) se lleva a cabo a un voltaje constante con un estimulador Grass conectado a unidades de aislamiento SIU-V. La respuesta máxima se comprueba mediante el aumento de la intensidad del estímulo de 2 V a un máximo de 12 V. EPSP de campo son amplificados 1000 veces con un amplificador de WPI ISO-80 y se filtraron a 10 Hz y 10 kHz. La señal se envía entonces a un PC a través de un Instrumento Nacional convertidor A / D. Estimulación, adquisición y análisis de datos se realizaron con el programa WinLTP ( <a href="http://www.winltp.com">www.winltp.com</a> ). EPSP de campo se registran al 40% de la amplitud máxima obtenida en una entrada Salidaponer curva. Para cada sector, las laderas fEPSP se normalizaron en contra de la pendiente media en el min 30 anterior LTP inducción. </li><li> LTP se activa mediante la aplicación de un solo tren de estimulación (100 Hz) a la fuerza de prueba en una vía, mientras que la segunda vía sirve como un control. </li></ol> 9. La limpieza de la instalación <ol><li> Enjuague todo el circuito con una solución al 3% de peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) por lo menos durante 10 min, luego de drenaje. El circuito se enjuaga cuidadosamente con agua destilada antes de comenzar cualquier experimento. El uso de H 2 O 2 no es absolutamente necesario que otros laboratorios utilizan únicamente agua destilada para limpiar, pero hemos notado la deposición de residuos oscuros en el sistema de tuberías cuando se utiliza sólo agua. </li><li> Cambie el agua en el baño de agua por debajo de la cámara de registro. </li><li> Baño de los electrodos de estimulación consejos en alcohol durante 5 min. </li></ol>

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Hemos desarrollado en nuestro laboratorio un protocolo resultante de la combinación de los métodos desarrollados y utilizados por otros laboratorios que tienen una gran experiencia en la LTP grabaciones 11,17. Este protocolo está adaptado para adultos hipocampo del ratón y se puede utilizar en animales de cualquier edad y de cualquier genotipo fondo. También permite el análisis de LTP en ratones transgénicos en desarrollo las enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer 18,19. </...

Hoy en día, hay una comprensión limitada de cómo se almacenan y recuperan en el plano del circuito neuronal recuerdos complejos. Sin embargo, una hipótesis unificadora de almacenamiento de memoria está disponible y ampliamente aceptado: memorias se almacenan como los cambios en la fuerza de las conexiones sinápticas entre neuronas en el sistema nervioso central. Por su parte, la investigación sobre la plasticidad sináptica se ha beneficiado en gran medida a partir de dos grandes descubrimientos. (1) En un experimento seminal, Bliss y Lomo 1, usando el conejo anestesiado intacta, encontraron que la entrega de un breve de alta frecuencia (1 seg, 100 Hz) la estimulación de la vía perforante del hipocampo causó una larga duración (varias horas) el aumento de las conexiones sinápticas relacionadas. Este fascinante fenómeno se llama &quot;potenciación a largo plazo&quot; o LTP por Douglas y Goddard en 1975 2. (2) Posteriormente, se encontró que un fenómeno similar podría ser activado en rodajas de cerebro (0,4 mm) mantenida artificialmente en activo in vitro </em&gt;. La LTP más ampliamente estudiado se observó in vitro mediante la entrega de uno o varios tetani a un haz de axones (los llamados colaterales de Schaffer) durante la grabación del campo de potencial sináptico excitatorio resultante evocado en las neuronas piramidales de la llamada región CA1. Los mecanismos de inducción de LTP en gran medida han sido revelados. Básicamente, un influjo de Ca2 + a través de los receptores de NMDA activa las enzimas con dos consecuencias: una fosforilación de los receptores AMPA (lo que aumenta su eficiencia) y una incorporación de los receptores AMPA supletorias en la membrana postsináptica 3. Por el contrario, los mecanismos de la fase de mantenimiento de la LTP son en gran parte desconocidos, en particular debido a que es experimentalmente mucho más difícil mantener una rebanada saludable para muchas horas de durante 30 a 60 min. Una gran cantidad de estudios se han dedicado a la comprensión de los mecanismos de LTP y teorías interesantes han sido elaborados durante los años 4-11. Pero sinhasta ahora, los mecanismos moleculares precisos que subyacen en el aumento estable en la fuerza sináptica no se han dilucidado. Esto podría deberse en parte a la dificultad de reproducir los resultados anteriores en distintos laboratorios, utilizando diferentes técnicas para la preparación y el mantenimiento de los cortes de hipocampo. En su documento sobre la metodología, Sajikumar et. Al 12 hizo hincapié en la importancia de las condiciones experimentales para la preparación de rodajas de hipocampo de rata y el registro de LTP estable. En este video se presenta todos los pasos de optimización desarrollados en nuestro laboratorio en los últimos años para poder grabar una LTP muy estable en rodajas de hipocampo de ratón. Esta optimización se ha realizado a partir de protocolos desarrollados y utilizado con éxito por otros laboratorios que estudian los mecanismos de LTP en ratones y ratas 13 11. Se permite a los investigadores experimentados para inducir y grabar un LTP duración muy larga en ratones adultos con una alta tasa de éxito. El physiological base de la LTP inducida fue comprobado cuidadosamente y demostró 14. En este documento sobre la metodología, se muestra que las modificaciones de las condiciones experimentales, como la temperatura o la oxigenación pueden tener un profundo impacto en el mantenimiento LTP, mientras que el procedimiento de disección puede modificar profundamente rebanadas excitabilidad. También debe hacerse hincapié en que el control preciso de todos estos parámetros requiere una formación de varios meses para los estudiantes novatos.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fuerte>Reactivo/Material</fuerte></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 </td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 1M</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>63126</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Air Liquide (Bélgica)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capilares</td><td>WPI, Inc. (Reino Unido)</td><td>TW150-4</td><td></td></tr><tr><td>Electrodos estimulantes</td><td>FHC (EE. UU.)</td><td>CE2B30</td><td></td></tr><tr><td>Herramientas quirúrgicas</td><td>FST (Alemania)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro 84 g/m2</td><td>Sartorius</td><td>FT-3-105-110</td><td></td></tr><tr><td>Mesh</td><td>Lycra</td><td>15 den</td><td></td></tr><tr><td>Glue</td><td>UHU</td><td>plus endfest300</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Instrumento</fuerte></td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>WPI, Inc. (UK)</td><td>ISO-80</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de registro de interfaz</td><td>FST (Alemania)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bombas peristálticas</td><td>Gilson (EE. UU.)</td><td>Minipuls 3</td><td></td></tr><tr><td>Controlador</td><td>de temperatura Universidad de Edimburgo</td><td><a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Cortadora de tejidos</td><td>Mcllwain</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estimuladores</td><td>Grass (USA)</td><td>S88X + SIU-V</td><td></td></tr><tr><td>Análisis de programas</td><td>WinLTP</td><td><a href="http://www.winltp.com" target="_blank">www.winltp.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipuladores</td><td>Narishige</td><td>MM-3 y MMO-220A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio quirúrgico</td><td>Leica Microsystem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Convertidor A/D</td> National <td>Instruments</td><td>NIPCI-6229 Serie</td><td></td> M</tr></tbody></table>

mejora de la preparación y conservación de las rebanadas de hipocampo de un ratón de grabación muy estable y reproducible de la potenciación a largo plazo

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Potenciación a largo plazo (LTP) es un tipo de plasticidad sináptica que se caracteriza por un aumento en la fuerza sináptica y cree que está involucrado en la codificación de la memoria. LTP suscitó en la región CA1 de cortes de hipocampo agudos se ha estudiado ampliamente. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a la fase de mantenimiento de este fenómeno son aún poco conocidos. Esto podría deberse en parte a las diversas condiciones experimentales utilizadas por diferentes laboratorios. En efecto, la fase de mantenimiento de la LTP es fuertemente dependiente de los parámetros externos, como la oxigenación, temperatura y humedad. También depende de los parámetros internos como orientación del plano de corte en lonchas y viabilidad rodaja después de la disección. La optimización de todos estos parámetros permite la inducción de una potenciación muy reproducible y muy estable a largo plazo. Esta metodología ofrece la posibilidad de explorar más a fondo los mecanismos moleculares implicados en el aumento estableen la fuerza sináptica en rebanadas de hipocampo. También destaca la importancia de las condiciones experimentales de investigación in vitro de los fenómenos neurofisiológicos.

Esta metodología se ha utilizado para analizar las propiedades de larga duración potenciación a largo plazo inducida en cortes de hipocampo agudos de C57Bl/6J ratones adultos (JANVIER SAS, Francia) 14. Sorprendentemente, la mejora de las condiciones experimentales ha dado lugar a una nueva forma de ver la LTP. Hemos demostrado que aumentan la larga duración en la fuerza sináptica no requiere la síntesis de nuevas proteínas. Aquí, mostramos que la inducción de LTP depende rebanadas...

En este trabajo se presenta una metodología completa para preparar y conservar<em&gt; In vitro</em&gt; Cortes de hipocampo agudos de ratones adultos. Este protocolo permite la grabación de la potenciación a largo plazo duradera muy estable (LTP) durante más de 8 horas con una tasa de éxito del 95%.

Mejora de la preparación y conservación de las rebanadas de hipocampo de un ratón de grabación muy estable y reproducible de la potenciación a largo plazo

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

El objetivo general de este procedimiento es poder registrar una potenciación a largo plazo muy estable y reproducible en cortes agudos del hipocampo. Esto se logra primero extrayendo el cerebro del ratón y diseccionando el hipocampo en un LCR frío bajo el microscopio. El segundo paso consiste en cortar secciones transversales del hipocampo con un cortador de tejidos.A continuación, se coloca el corte en la cámara de registro de interfaz, que será perfundida con un fluido artificial cerebroespinal oxigenado. El paso final consiste en colocar los electrodos y registrar la actividad sináptica en la región CA1 del hipocampo. En última instancia, se utiliza un protocolo de estimulación de alta frecuencia para demostrar la inducción de una potenciación a largo plazo muy estable.Este método puede proporcionar información sobre el mecanismo subyacente a la plasticidad sináptica. También puede aplicarse a otros sistemas, como modelos animales de enfermedades neurodegenerativas o del sistema nervioso, o a enfermedades inmunitarias. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque todas las manipulaciones requieren gran habilidad y mucha práctica.Comience este procedimiento enjuagando el circuito de perfusión con agua destilada durante un mínimo de 20 minutos. Luego encienda los sistemas de calentamiento. Inicie la burbujeo de carbógeno en el circuito.El carbógeno se suministra al baño de agua debajo de la cámara de registro mediante difusores de aire. A continuación, controle el caudal en el baño de agua mediante un medidor de flujo. Posteriormente, drene el circuito y llénelo con LCR filtrado para eliminar las burbujas. Luego coloque el anillo, que servirá de soporte para la sección en la cámara de mantenimiento.Retire cuidadosamente todas las burbujas de aire del circuito. Luego, ajuste el nivel de LCR A en la cámara de registro mediante el tornillo de la aguja de succión; la velocidad de la bomba de entrada se ajusta a un mililitro por minuto, y la de la bomba de salida a cinco mililitros por minuto. Antes de la disección, prepare todos los instrumentos quirúrgicos.Para extraer el cerebro de un ratón sacrificado. Sostenga su cabeza con el dedo índice y el pulgar, y realice una incisión con las tijeras de disección a lo largo de la línea media de la parte superior de la cabeza, comenzando en el borde de la guillotina y cortando hasta el hueso frontal. A continuación, corte el músculo cutáneo en cada lado de la cabeza para exponer completamente las placas del cráneo.Luego retire los músculos del lado coddle de la cabeza. Posteriormente, corte el músculo temporal en cada lado a lo largo de la placa temporal. A continuación, corte las placas frontales en la parte media transversalmente.Ahora haga un pequeño corte en el hueso occipital entre las dos placas. Corte en la base del codillo de las placas occipitales en cada lado. Luego, con las tijeras de resorte, corte a lo largo de la sutura sagital.Finalmente, retire el cráneo separando las dos mitades con pinzas. Luego, con el bisturí, corte justo antes del cerebelo y justo después del bulbo olfatorio, transversalmente, y transfiera el cerebro extraído al recipiente de disección con A CSF frío. Una vez que el cerebro esté sumergido en el recipiente de disección, separe los dos hemisferios entre sí mediante un corte con el bisturí insertado en la línea media bajo un microscopio quirúrgico binocular, separando cuidadosamente la estructura de un hemisferio para revelar el ventrículo lateral.Retire el tronco encefálico y el cefalón colocando una espátula sobre la corteza frontal y la otra espátula sobre el cefalón. Tenga cuidado de no tocar el hipocampo con la espátula ni de estirarlo durante el corte del tejido. Posteriormente, seccione el fórnix.Luego, empuje suavemente el hipocampo fuera de la corteza insertando una espátula en el ventrículo. Cuando el hipocampo esté extraído, elimine el tejido cortical excesivo y los vasos sanguíneos residuales con una pipeta Pasteur de plástico de boca ancha. Transfiera el hipocampo a una cucharilla con su superficie alveolar hacia arriba, hacia la plataforma del cortador.Retire el exceso de líquido del cucharón con una pipeta Pasteur de plástico estándar. Después, incline el cucharón verticalmente hasta que quede casi tocando el papel filtro en el cortador. Suelte el hipocampo tocando rápidamente el papel filtro.Luego retire la cuchara. A continuación, oriente el hipocampo y córtelo transversalmente en rebanadas de 400 micrones con el cortador.Realice el procedimiento lo más rápidamente posible. Posteriormente, retire el papel de filtro con los cortes hipocampales y enróllelo alrededor del cilindro metálico para separar ligeramente los cortes. Luego, suelte los cortes rociándolos con A CSF utilizando una pipeta pasteur de plástico estándar y recójalos en una placa de Petri llena de frío.Una CSF. Transfiera el corte seleccionado a la cámara de registro utilizando una pipeta de plástico estándar. Permita que el corte se recupere del trauma de la disección en la cámara de interfaz de registro a 28 grados Celsius.Si la sección se hunde por debajo del nivel del LCR A hasta el nivel de la sección, eleve nuevamente el nivel del LCR A para hacer flotar la sección. Luego, oriente la sección hacia la posición que facilite la colocación de los electrodos en la región CA1. Detenga el descenso del nivel del LCR A cuando se encuentre en la interfase.El menisco del medio alrededor del corte indica un nivel suficiente de LCR A. La malla debe estar saturada con medio, pero no completamente sumergida. Luego, mantenga la cámara cubierta con papeles de filtro sobre la tapa perforada.Deje que el corte repose durante al menos una hora y treinta minutos a 28 grados Celsius antes de la grabación. A continuación se muestra un esquema que muestra dos entradas sinápticas independientes, S uno y S dos, hacia la misma población neuronal. La vía S uno se utilizó para inducir la potenciación a largo plazo (LTP), mientras que la vía S dos actuó como control.Estas son las trazas de F-EPSP de muestra registradas justo antes de la inducción de la PTL, indicadas por las trazas rojas, y una hora después de la inducción de la DLP, indicadas por las trazas azules. Aquí se muestran los F-EPSP de un trozo perfectamente saludable, y aquí los F-EPSP de un trozo que presenta un alto nivel de excitabilidad cuando los trozos no son perfectamente saludables. Se observan respuestas polisinápticas y la potenciación de la pendiente del F-EPSP está reducida.Aquí se muestra una comparación de los cursos temporales de la pendiente F-E-P-S-P después de la PTL inducida mediante un único tren de estimulación de alta frecuencia, registrada en 2005, 2010 y 2011 en nuestro laboratorio. Los primeros experimentos, registrados en 2005, se indican con círculos rellenos. Las grabaciones posteriores, indicadas con cuadrados rellenos, se beneficiaron de un procedimiento de disección mejorado.Los resultados actuales surgen de la optimización de la oxigenación de la interfaz y del control de temperatura, junto con la normalización de los electrodos, como indican los círculos abiertos. Aquí mostramos que aumentar la velocidad de flujo de oxígeno en el baño de agua debajo de la cámara de registro de 0,15 a 0,25 litros por minuto, como indica la curva azul, induce una disminución del 20 % en la pendiente F-E-P-S-P al aumentar la temperatura de 28 a 29 grados Celsius. Como se indica, la curva verde induce un aumento superior al 50 % en la pendiente F-E-P-S-P.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que cada paso es crucial y que los errores en el protocolo pueden conducir a resultados diferentes. Tras ver este video, tendrá un buen entendimiento de cómo obtener una potenciación a largo plazo muy estable. Grabación en cortes agudos del hipocampo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

En este artículo se describen los procedimientos para la preparación de rodajas de hipocampo de ratas y ratones transgénicos para el estudio de las alteraciones sinápticas del cerebro asociadas con el envejecimiento y relacionadas con la edad las enfermedades neurodegenerativas, tales como la enfermedad de Alzheimer.

Preparación de la aguda rodajas de hipocampo de ratas y ratones transgénicos para el estudio de las alteraciones sinápticas durante el envejecimiento y la patología amiloide

Este artículo de video describe procedimientos experimentales para estudiar la plasticidad a largo plazo y sus procesos asociativos, como el marcaje sináptico, la captura y el etiquetado cruzado en las neuronas piramidales CA1 utilizando cortes agudos del hipocampo de roedores.

Investigación de sináptica Tagging / Captura y Cruz de captura utilizando aguda hipocampo rebanadas de Roedores

Este protocolo muestra la implementación de un optimizado N-metil-D-glucamine (NMDG) método de protección recuperación de preparación de corte de cerebro. Una formulación de medios de comunicación solo se utiliza para obtener confiablemente rebanadas de cerebro sano de animales de cualquier edad y para diversas aplicaciones experimentales.

Preparación de rebanadas cerebrales agudas mediante un optimizado N-metil-D-glucamine recuperación protección método

Este protocolo describe la estabilización del nivel de oxígeno en un pequeño volumen de tampón reciclado y aspectos metodológicos de la plasticidad sináptica dependiente de actividad de la grabación en rebanadas hippocampal agudas sumergidas.

Grabación de la plasticidad sináptica en rebanadas Hippocampal agudas mantenidas en un pequeño volumen reciclado - perfusión- y sistema de cámara de tipo inmersión

Utilizamos electrodos de grabación y estimulación en rodajas longitudinales del cerebro del hipocampo y electrodos de registro y estimulación posicionados longitudinalmente en el hipocampo dorsal in vivo para evocar potenciales postsinápticos extracelulares y demostrar plasticidad sináptica a largo plazo a lo largo del interlamellar longitudinal CA1.

Investigación de la plasticidad sináptica a largo plazo en Interlamellar Hippocampus CA1 por grabación de campo electrofisiológica

El protocolo presentado describe el transporte y la preparación del tejido hipocampal humano resecado con el objetivo final de utilizar las rebanadas cerebrales vitales como una herramienta de evaluación preclínica para posibles sustancias antiepilépticas.

Preparación de rebanadas agudas de hipocampo humano para grabaciones electrofisiológicas

Este es un protocolo para la preparación aguda de la rebanada de hipocampo adulto y envejecido del ratón que aprovecha la perfusión transcardial y el corte de rodajas con NMDG-aCSF helado para reducir el daño hipoxico al tejido. Las rebanadas resultantes se mantienen saludables durante muchas horas y son adecuadas para grabaciones de parches y de campo a largo plazo.

Minimizar la hipoxia en las rebanadas de hipocampo de ratones adultos y envejecidos

Este protocolo describe la preparación de rodajas horizontales de corteza hipocampal-entorrinaal (HEC) de ratones que exhiben actividad espontánea de ondulación de onda aguda. Las rodajas se incuban en una cámara de retención de interfaz simplificada y las grabaciones se realizan en condiciones sumergidas con líquido cefalorraquídeo artificial de flujo rápido para promover la oxigenación tisular y la aparición espontánea de la actividad a nivel de red.

Corte cerebral de ratón agudo para investigar la actividad espontánea de la red de hipocampo

Este artículo tiene como objetivo describir un protocolo sistemático para obtener rebanadas cerebrales hipocampales horizontales en ratones. El objetivo de esta metodología es preservar la integridad de las vías de fibra del hipocampo, como la trayectoria perforante y el tracto de fibra musgo para evaluar los procesos neurológicos relacionados con el giro desánido.

Rebanadas hipocampales horizontales del cerebro del ratón

Presentamos un protocolo para preparar rodajas agudas del hipocampo dorsal-intermedio de ratones. Comparamos esta preparación transversal con el corte coronal en términos de calidad de las grabaciones y preservación de las características morfológicas de las neuronas grabadas.

Preparación de rodajas agudas del hipocampo dorsal para la grabación de células enteras y la reconstrucción neuronal en el dentate gyrus de ratones adultos

Aprende a preparar rebanadas de hipocampo de ratón para registrar potenciación a largo plazo estable durante más de 8 horas. Este protocolo mejora la reproducibilidad en estudios de plasticidad sináptica.

Mejora de la preparación y conservación de las rebanadas de hipocampo de un ratón de grabación muy estable y reproducible de la potenciación a largo plazo (Video) | JoVE Journal

Mejora de la preparación y conservación de las rebanadas de hipocampo de un ratón de grabación muy estable y reproducible de la potenciación a largo plazo

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