Microscopia intravital de la microcirculación en el músculo de ratón Cremaster para el análisis de la migración de la célula madre periféricas

El objetivo general de este procedimiento es visualizar las interacciones de las células madre endoteliales in vivo. Esto se logra introduciendo primero un catéter de la arteria femoral en un animal sedado para el acceso intraarterial. Durante el segundo paso, el músculo cromático se prepara quirúrgicamente para la microscopía de fluorescencia intravital.

A continuación, se inyecta la población de células madre de interés a través del catéter de la arteria femoral. En última instancia, se pueden visualizar y cuantificar las interacciones entre las células madre transferidas adoptivamente y el endotelio de la microcirculación muscular maestra. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina regenerativa, como por ejemplo, ¿cómo se regula la migración de las células madre aplicadas terapéuticamente dentro de un organismo vivo?

Antes de comenzar la microcirugía, se colocó un catéter conectado a una jeringa de un mililitro con cloruro de sodio al 0,9%. A continuación, afeita suavemente la cara anterior del escroto derecho, así como el muslo derecho y la ingle de un ratón macho anestesiado de 20 a 25 miligramos. Recoja todo el pelo suelto con un hisopo de algodón humedecido y luego coloque el ratón con el lado ventral hacia arriba en una plataforma de visualización de plexiglás hecha a medida que consta de una placa base y una segunda placa en el borde de la placa base para la elevación de ambas patas traseras y el escroto.

Después de fijar las patas con una cortina elástica, coloque el escenario sobre una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal del animal a 37 grados centígrados. Luego, usando un aumento de 10 a 16 veces, use un microscopio de disección y un par de tijeras para hacer una incisión inicial en el muslo derecho, justo antes de los vasos femorales desde la rodilla hasta la ingle. Identifique la arteria femoral y sígala proximalmente, movilizando la arteria desde el tejido blando circundante.

Luego, usando termocauterización, identifique y corte una rama arterial grande que conduzca al testículo izquierdo. Colocar superficialmente una sutura de retención de seis pies de pulga en el testículo izquierdo. A continuación, identifique y termocauterice la rama arterial grande que corre medialmente hasta el muslo.

A continuación, con una tracción suave, ligar la arteria femoral en la parte distal del muslo derecho y, a continuación, colocar una sutura alrededor de la arteria femoral proximal lo más cerca posible del centro del animal. Ahora, coloque un nudo suelto alrededor de la arteria femoral, pero no lo ate. A continuación, aplique una suave tracción a la sutura para crear una torcedura arterial.

Después de establecer la torcedura, use un par de micro tijeras para dimensionar cuidadosamente la arteria, teniendo especial cuidado de no dañar la vena femoral. A continuación, inserte el microcatéter previamente preparado en la incisión. Aflojar con cuidado la torcedura para facilitar el paso del catéter.

El flujo sanguíneo arterial debe ser inmediatamente visible dentro del catéter. Avance lentamente el catéter unos milímetros más allá de la flexión anterior. A continuación, ate la ligadura preparada para la fijación del catéter.

Ahora enjuague suavemente el catéter con el cloruro de sodio y luego aspire la solución para confirmar la posición correcta del catéter. Use un pedazo de cinta adhesiva para asegurar aún más el catéter a la etapa de la operación. Una vez que el catéter se haya fijado y apartado adecuadamente, corte la piel y la fascia por encima de la cara ventral del escroto derecho.

Tenga cuidado de no tocar el tejido subyacente con ningún instrumento. Extienda la incisión hasta el pliegue inguinal y codcéntela hasta el extremo distal del escroto. A continuación, separe cuidadosamente los tejidos blandos y conectivos subyacentes por encima del saco cremaster sin tocar el tejido en sí.

A continuación, coloque una sutura de estancia de seis pies cuadrados en el extremo distal del cremaster para extender ligeramente el músculo. A continuación, tire suavemente del músculo hacia atrás y hacia delante para resecar el tejido blando restante debajo del saco muscular. Después de la separación completa del tejido conectivo, use un par de tijeras para abrir el saco maestro C en el borde craneal y extienda la incisión desde esta abertura hasta el extremo distal del músculo.

Después de cauterizar térmicamente el pequeño vaso que conecta el testículo en el cremaster, use unas tijeras para cortar las conexiones restantes entre el músculo y el testículo. El cremaster abierto ahora quedará plano en el escenario. Ahora coloque cuatro suturas de retención de seis pies en los bordes del tejido y fíjelas con el paño elástico.

Con el fin de esparcir el tejido muscular cremaster a partir de este punto, utilice una jeringa de un mililitro para humedecer continuamente el tejido con PBS. Después de que la preparación haya descansado durante 15 minutos, inyecte de 0,05 a 0,1 mililitros de rodina dextrina al 1% a través de la arteria femoral izquierda para mejorar el contraste de la microvasculatura. Ahora, mueva el mouse y el escenario debajo de un dispositivo de carga acoplada.

Microscopio de fluorescencia conectado a cámara de video, modificado para la iluminación epi, teniendo especial cuidado de no dislocar el catéter de la arteria femoral. Después de ajustar el objetivo de inmersión en agua para una visualización suficiente de la microcirculación de chma, se definieron estocásticamente seis CE postcapilares para un análisis posterior de la adherencia firme de las células madre. A continuación, cargue una jeringa de un mililitro con 200 microlitros de las células madre de médula ósea de donantes fluorescentes previamente marcadas.

Golpee suavemente la jeringa para resus, suspender la suspensión celular y luego administrar las células a través del catéter femoral en inyecciones de 40 microlitros para un total de cinco inyecciones consecutivas. Registre el rodaje de las células madre inmediatamente después de la inyección de células. Definiendo el balanceo como una reducción de más del 50% de la velocidad celular a lo largo del revestimiento endotelial en combinación con los movimientos típicos de punción y liberación celular.

Después de completar la microscopía intravital, retire con cuidado el músculo cremaster y guárdelo para su posterior análisis. En general, la interacción de las células madre o progenitoras inyectadas directamente con el endotelio vascular dentro de la microcirculación del músculo cremaster es un evento raro y ocurre exclusivamente en las células postcapilares debido al marcaje fluorescente. Las células rodantes, como lo indica la punta de flecha negra, y las células madre firmemente adheridas, como lo indican las flechas blancas, se pueden distinguir claramente de los leucocitos endógenos circulantes en el es.

Las condiciones microcirculatorias representadas por la velocidad del flujo sanguíneo y la velocidad de cizallamiento de la pared generalmente no difieren significativamente entre los respectivos grupos experimentales con diferentes tratamientos con quimiocinas. Tratamiento local del tejido muscular con diferentes quimiocinas o mediadores de la respuesta inflamatoria. Por ejemplo, el factor uno alfa derivado de células estromales o el factor de necrosis tumoral alfa es capaz de imitar condiciones microambientales específicas.

Tales condiciones mejoran las interacciones de las células madre endoteliales en diversos grados dependiendo de la quimiocina o mediador específico aplicado y la población de células madre inyectada. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo visualizar las interacciones de las células madre y las células in vivo a través de la microscopía intravital de la microcirculación muscular CreER.