Name: Microscopia intravital de la microcirculación en el músculo de ratón Cremaster para el análisis de la migración de la célula madre periféricas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Aprende microscopía intravital para analizar la migración de células madre en la microcirculación del músculo cremaster de ratón. Este método permite visualizar interacciones célula-endotelio en tiempo real.

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Todo el protocolo después de aislamiento de células tarda aproximadamente 2 horas. 1. Preparación microquirúrgica <ol><li> Realizar el aislamiento de células madre de la médula ósea del donante y etiquetado fluorescente de la subpoblación aislada de acuerdo con protocolos 9,12 permitir que las células descansan durante el tiempo que se realiza la operación de los animales estandarizados. Para el marcaje fluorescente recomendamos CFDA (succinimidiléster diacetato de carboxifluoresceína). </li><li> Anestesiar a un ratón macho 20-25 g de peso con ketamina (75 mg / kg) y xilazina (2.5 mg / kg). A lo largo de los procedimientos quirúrgicos y protocolos experimentales, la anestesia debe ser mantenida por los suplementos (10% de la inyección inicial, ip), según sea necesario (por lo general cada 30 a 60 min). </li><li> Afeitarse suavemente la cara anterior del escroto derecho, así como el muslo derecho y la ingle. Recoge todos pierden el cabello con un bastoncillo de algodón humedecido. Coloque el lado ventral del ratón hacia arriba en un escenario de visualización de plexiglás y fijar la cuotat usando cortina elástica. Está hecho a medida La etapa, que consiste en una placa base y una segunda placa en el borde caudal de la placa base para la elevación de las dos piernas y el escroto. Coloque el escenario en una almohadilla térmica para mantener la temperatura del cuerpo a 37 ° C. Después de la fijación en el escenario, colocar al animal en un microscopio de funcionamiento y realice los siguientes pasos de la operación usando 10 - a la ampliación de 16 veces. </li><li> Hacer la incisión inicial con unas tijeras de la piel en el muslo derecho, justo por delante de los vasos femorales de la rodilla hasta la ingle. </li><li> Identificar la arteria femoral y seguirla en dirección proximal, la movilización de la arteria de los tejidos blandos circundantes. Identificar y cortar una rama grande al testículo izquierdo con termocauterio. A partir de entonces colocar una sutura estancia superficialmente en el testículo izquierdo. Tracción suave facilitará aún más la movilización proximal de la arteria femoral. </li><li> Después de la terminación de la movilización proximal, identificar y cortar una rama grande corriendo medially en el muslo por termocauterio. A partir de entonces ligar la arteria femoral en la parte distal del muslo derecho. Tracción suave sobre la ligadura ayudará más preparación. </li><li> Girar la atención ahora a la arteria femoral proximal de nuevo y colocar una sutura alrededor de la arteria como proximalmente como sea posible. Preparar un nudo, pero no lo ate abajo todavía. Aplicar una suave tracción a la sutura y crear un retorcimiento arterial. </li><li> Después de establecer el retorcimiento, haga una incisión de la arteria está utilizando cuidadosamente un microscissor. Tenga especial cuidado de no dañar la vena femoral. </li><li> Insertar un microcatéter preparado (diámetro interior 0,28 mm) a través de la incisión. El catéter debe ser desaireado (cloruro de sodio 0,9%, NaCl) y conectado a una inserción antes de jeringa de 1 ml. </li><li> Después de la inserción exitosa del catéter, aflojar cuidadosamente el acodamiento con el fin de facilitar el paso del catéter. El flujo de sangre arterial debe ser inmediatamente visible dentro del catéter. Avanzar suavemente el catéter de pocos milímetross más allá del retorcimiento anterior. A partir de entonces, la corbata por la ligadura preparado para la fijación del catéter. </li><li> Enjuague suavemente el catéter (0,9% NaCl) y aspirar para confirmar la posición correcta. Utilice un trozo de cinta adhesiva para asegurar aún más el catéter para la etapa de operación. </li><li> Después de la fijación adecuada, coloque el catéter a un lado para los siguientes pasos de preparación del músculo cremáster. Aplicar el lavado regular y aspiración del catéter cada 5-10 minutos con el fin de prevenir la formación de coágulos. </li><li> Gire ahora la atención en el escroto derecho y hacer una incisión cortando la piel y la fascia por encima de la cara ventral del escroto derecho. Tenga cuidado de no tocar el tejido subyacente con ningún instrumento. </li><li> Extender la incisión hasta el pliegue inguinal y caudalmente hasta el extremo distal del escroto. </li><li> Tejido cuidadosamente separada subyacente suave y conectivo encima del saco cremáster, sin tocarlo. Identifique el extremo distal del cremáster, y colocar una sutura estancia aquí para slightly extender el músculo. Resecar ahora el tejido blando restante debajo del saco muscular tirando suavemente el músculo caudal y anterior. </li><li> Después de la separación completa a partir de tejido conectivo, abrir el saco cremáster en un punto en el borde craneal con unas tijeras. Extender la incisión de esta abertura hacia abajo hasta el extremo distal del músculo. </li><li> Selle la pequeña embarcación que conecta el testículo y el cremáster usando termocauterio, después cortar los contactos que persisten entre el músculo y el testículo con unas tijeras. </li><li> Deja a un lado del testículo, fuera del campo de la microscopía. </li><li> El cremáster abierto ahora está plano en el escenario. Coloque cuatro puntos de Prolene 6-0 estancia en los bordes de los tejidos y fijarlas con cortina elástica con el fin de extender el tejido del músculo cremáster. A partir de ahora humedecer continuamente el tejido con solución salina tamponada con fosfato (PBS) usando una jeringa de 1 ml (Figura 1). </li><li> Autorizar ahora la preparación reposar 15 min. A partir de entonces inyectar0,05-0,1 ml de 1% de rodamina-dextrano a través de la arteria femoral izquierda para la mejora de contraste de la microvasculatura. Si se planifican las quimiocinas o agentes inflamatorios para su aplicación, ahora debería humedecer tópicamente el músculo con el respectivo reactivo usando una jeringa de 1 ml. En el caso de un experimento de control, continuar humedeciendo con PBS. </li></ol> 2. Microscopia intravital <ol><li> Mantenga el ratón fijada en la etapa de operación y moverse bajo un microscopio de fluorescencia modificado para epi-iluminación y conectado a un CCD (dispositivo de carga acoplada) de la cámara de vídeo. Tenga especial cuidado de no dislocar el catéter en la arteria femoral. </li><li> Llevar a cabo experimentos utilizando un objetivo de inmersión en agua. </li><li> Después de ajustar el objetivo para la visualización suficiente de la microcirculación cremáster y antes de la inyección de células, definir estocásticamente seis vénulas post-capilares para su posterior análisis de la firma de la adhesión de células madre. </li><li> Administrar las células madre fluorescentes que llevan la etiqueta,disuelto en 200 l de PBS, a 0,4 x 10 6 células por inyección, con un total de cinco inyecciones consecutivas utilizando el catéter en la arteria femoral y una jeringa de 1 ml. Sacudir cuidadosamente la muestra de células antes de la primera inyección. </li><li> Células madre disco de los Rolling inmediatamente después de la inyección de células, definiendo de este modo &quot;rodar&quot; como una reducción de más del 50% de la velocidad de la célula a lo largo del revestimiento endotelial en combinación con típico celular &quot;palo y liberar&quot; movimientos. Lleve a cabo el recuento de las células madre de rodadura y todas las células madres que pasan una distancia predefinida venular durante 1 min de la observación después de cada inyección única. La cantidad de laminación de células madre se expresa como porcentaje de todas las células que pasan. No contar las células que exhiben fenómenos inmovilización breves aleatorios como células de rodadura. </li><li> Después de la última inyección de células determinar el número de células madre firmemente adherentes contando y expresar la cantidad en relación a la superficie endotelial calculado de the seis vénulas predefinidos (diámetro x largo x π) como células adherentes / mm 2. Adherencia firme se considera cuando hay movimiento celular es detectable durante 30 segundos. </li><li> Después de la terminación de la microscopía intravital retirar con cuidado el músculo cremáster y almacenarlo en correspondencia con el análisis posterior (inmunohistoquímica o biología molecular). Sacrificio del animal por dislocación cervical. El análisis de las grabaciones de microscopía intravital para la cuantificación de la laminación de células madre y firme adhesión endotelial, así como la hemodinámica microvasculares, tales como la velocidad de la sangre de glóbulos rojos (mm / s), la eslora del buque (m), el diámetro del vaso (m), tasa de cuota de pared (s-1); se debe realizar fuera de línea por un investigador ciego para el tratamiento respectivo tejido experimental que utiliza un software de procesamiento de imágenes. </li></ol>

<ol><li>Madlambayan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+stem+and+progenitor+cell+contribution+to+neovasculogenesis+is+dependent+on+model+system+with+SDF-1+as+a+permissive+trigger%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger.</a> Blood. 114, 4310-4319 (2009).</li>
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<li>Donndorf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+migratory+properties+of+human+CD+133%28%2B%29+stem+cells+in+vivo+after+intraoperative+sternal+bone+marrow+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation.</a> Cell Transplant. , (2012).</li>
</ol>

Todos los experimentos con animales, llevados a cabo por este manuscrito han sido aprobados por el comité local de cuidado y uso de animales. Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

<html> Microscopía de fluorescencia intravital permite la visualización directa y el análisis cuantitativo de la madre de las interacciones célula-endotelio. El modelo de músculo cremáster es particularmente útil, ya que la exposición de microcirugía y técnicas de visualización intravital han sido bien establecido durante la investigación sobre las interacciones entre leucocitos y endotelio diversos componentes químicos se puede aplicar selectivamente al tejido diana mediante la técnica de superfusión sencilla. Debido a ...

El propósito del presente artículo es describir la técnica de microscopía intravital (IVM) aplicado sobre la microcirculación cremáster ratón para la observación directa y el análisis de médula ósea periférica migración de células madre. La regeneración de tejidos y de órganos El concepto actual de células madre basado implica el homing de las células madre derivadas de la médula ósea al tejido lesionado 1. Un paso crucial para el éxito de la migración de células madre incluye la interacción de células madre con el endotelio local dentro del órgano lesionado, seguido de la migración transendotelial y, finalmente, el injerto de órganos 2. Análisis intravital de estas células madre - interacciones de células endoteliales se forma un parámetro ideal para la cuantificación de una respuesta regenerativa de células madre basada en diferentes contextos fisiopatológicos in vivo. Además, parece concebible, que, en el futuro, el análisis intravital de la capacidad migratoria de p específico de células madreopulations dentro de los entornos de la microcirculación estandarizadas, podrían aplicarse antes de avanzar en estas poblaciones de más pruebas clínicas. Microscopía intravital se ha desarrollado inicialmente para la observación y cuantificación de la interacción célula-endotelial de leucocitos in vivo en el campo de la investigación inflamatoria 3. Primeras grabaciones exitosas de estudios de microscopía intravital fueron reportados por Cohnheim ya en el siglo 19, el estudio de las lenguas y entresijos de rana con un microscopio de luz 4. Desde su primer uso IVM ha experimentado un enorme desarrollo técnico y en la actualidad ciertos componentes esenciales formen requisitos previos para llevar a cabo IVM cuantitativa: (i) preparaciones de tejidos que permiten el acceso óptico, (ii) sondas moleculares que pueden ser detectadas por un microscopio, (iii ) un microscopio conectado a un sistema de detección y (iv) los sistemas de análisis basados ​​en ordenador que puede extraer parámetros de interés a partir de los datos de imagenestablecer 4. Una variedad de preparaciones de tejidos se ha introducido para los estudios de MIV incluyendo los entresijos y el hígado del ratón y de rata 5, las cámaras de los pliegues cutáneos dorsal de ratón 6 y el hámster, la oreja del conejo y de la bolsa de la mejilla del hámster por nombrar algunos. Sin embargo, en lo que sigue nos centraremos en el músculo cremáster ratón, lo que representa un tejido ideal para las observaciones intravitales, como la preparación y la visualización son posibles mediante un procedimiento quirúrgico bien estandarizados, y en general no se producen problemas de artefactos de movimiento. La preparación del músculo cremáster abierto se llevó a cabo por primera vez en la década de 1970 por Báez y sus colegas 7. Originalmente descrito para ratas, se ha adoptado con éxito también para el ratón 8. Después de los estudios anteriores se habían centrado principalmente en la interacción de leucocitos con la pared del vaso, nuestro grupo ha presentado recientemente la preparación Cremáster ratón como valoraciónble herramienta para la visualización directa y el análisis cuantitativo de la madre de las interacciones célula-endotelio dentro de un microambiente definido 9. Varios subpoblaciones de células madre se han estudiado utilizando este modelo, incluyendo las células madre mesenquimales de c-kit murino + de células madre de médula ósea y, así como de CD humano células madre de la médula ósea 133 + 10-12. Tras el aislamiento de células de donante de médula ósea y etiquetado fluorescente para la visualización, las células madre se aplican selectivamente en la microcirculación cremáster la utilización de una inyección arterial a través de la arteria femoral, evitando de este modo cualquier atrapamiento de células dentro de los órganos remotos. Además, el modelo de músculo cremáster es particularmente útil, ya que diversas quimiocinas potencialmente que median la migración de células madre local dentro de los ajustes respectivos, se pueden aplicar tópicamente al tejido diana mediante la técnica de superfusión sencilla.

<table><tbody><tr><td>Diacetato de carboxifluoresceína succinimidylester (CFDA)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine 6 G (1%)</td><td>Sigma-Aldrich, Munich, Alemania</td><td>83697</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin (Ketanest)</td><td>Pfizer, Berlín, Alemania</td><td>no disponible</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina (Rompun)</td><td>Bayer, Leverkusen, Alemania</td><td>no disponible</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Dulbecco - solución salina tamponada (PBS)</td><td>PAN Biotech, Aidenbach, Alemania</td><td>P04-36500</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopia intravital de la microcirculación en el músculo de ratón cremaster para el análisis de la migración de la célula madre periféricas

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

En la era de los protocolos de aplicación de células intravasculares en el contexto de la terapia celular regenerativa, los mecanismos subyacentes de la migración de células madre de tejido nonmarrow no han sido completamente aclarados. Se describe aquí la técnica de microscopía intravital aplicado a la microcirculación cremáster ratón para el análisis de médula ósea periférica migración de células madre in vivo. Microscopía intravital de la M. cremáster se ha introducido previamente en el campo de la investigación inflamatoria para la observación directa de la interacción de leucocitos con el endotelio vascular. Desde madre periféricas suficiente y la migración de células progenitoras incluye los pasos iniciales similares de rodar a lo largo de y la adhesión firme en el revestimiento endotelial es concebible aplicar el modelo M. cremáster para la observación y cuantificación de la interacción de las células madre administrados intravasculary con el endotelio. Como diversos componentes químicos pueden ser aplicados selectivamente a la diana Tproblema mediante técnicas de superfusión simples, es posible establecer condiciones previas esenciales microambientales, para el reclutamiento de células madre inicial que tendrá lugar en un organismo que vive fuera de la médula ósea.

En general, la interacción de directamente inyectado células madre o progenitoras con el endotelio vascular dentro de la microcirculación músculo cremáster es un evento raro y se produce exclusivamente en las vénulas postcapilares (diámetro: 30-80 micras). Debido a la fluorescencia de etiquetado de rodadura y las células madre firmemente adherentes pueden ser claramente cuantificados en la separación de leucocitos circulantes endógenas en las vénulas observadas (Figura 2). L...

Microscopía intravital del cremáster microcirculación ratón M. ofrece un único y bien estandarizada-modelo in vivo para el análisis de médula ósea periférica migración de células madre en.

Microscopia intravital de la microcirculación en el músculo de ratón Cremaster para el análisis de la migración de la célula madre periféricas

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar las interacciones entre células madre y células endoteliales in vivo. Esto se logra primero introduciendo un catéter en la arteria femoral de un animal sedado para obtener acceso intraarterial. En el segundo paso, el músculo crural se prepara quirúrgicamente para la microscopía de fluorescencia intravital.A continuación, se inyecta la población de células madre de interés mediante un catéter en la arteria femoral. En última instancia, pueden visualizarse y cuantificarse las interacciones entre las células madre transferidas adoptivamente y el endotelio de la microcirculación muscular principal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina regenerativa, como por ejemplo cómo se regula la migración de las células madre aplicadas terapéuticamente dentro de un organismo vivo?Antes de comenzar la microcirugía, prepare un catéter conectado a una jeringa de un mililitro con cloruro de sodio al 0,9%. Luego, afeite suavemente la cara anterior del escroto derecho, así como el muslo derecho e ingle de un ratón macho anestesiado de 20 a 25 miligramos. Recopile todo el vello suelto con un hisopo humedecid

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Biología

Un método nuevo y versátil para la observación de la microcirculación se presenta. Se considera adecuado para observación a largo plazo, y para la combinación con intervenciones biológicas pharmacophysiological o molecular.

En vivo la micro-circulación de medición en el músculo esquelético de Intra-vital Microscopía

Microscopia intravital para seguir los acontecimientos hemodinámicos e inflamatorios temporal y espacial en la microcirculación pial.

Microscopia intravital de la microcirculación del cerebro del ratón con una ventana craneal cerrado

A la preparación del tejido se describe para la visualización y la manipulación experimental de la microcirculación de vida. En los ratones macho anestesiado, el delgado y muy vascularizado músculo cremáster se prepararon para microscopía intravital para estudiar las redes microvasculares como las arteriolas, capilares y vénulas. Esta preparación se adapta fácilmente a las ratas y hámsters.

El ratón Cremaster preparación muscular for Imaging intravital de la microcirculación

Microiontophoresis implica movimiento de los iones a partir de una micropipeta en respuesta a una diferencia de potencial eléctrico entre el interior y el exterior de la micropipeta. Moléculas biológicamente activas así son liberados en proporción a la corriente eléctrica. Nos ilustran microiontophoresis acetilcolina en conjunto con micromanipulación para estudiar vasodilatación dependiente del endotelio en la microcirculación.

Microiontophoresis y micromanipulación de imagen intravital de fluorescencia de la microcirculación

Se describe un protocolo de la microscopía de campo claro intravital para medir la dinámica de los neutrófilos interacciones célula endotelial durante el reclutamiento de neutrófilos en respuesta a la fuente de un quimioatrayente de neutrófilos en vivo. Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración y la quimiotaxis transendotelial en tejido de ratón músculo cremáster se visualizan con la fotografía de vídeo de tiempo transcurrido y el seguimiento con ImageJ.

Seguimiento de Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración transendotelial y la quimiotaxis de los tejidos por microscopía de vídeo intravital

Digital microscopía intravital epifluorescencia de vénulas post-capilares de la microcirculación cremastérico es un método conveniente para obtener información sobre la interacción...

En tiempo real de imágenes digitales de los leucocitos del endotelio interacción en el daño por isquemia-reperfusión (IRI) del músculo cremáster Rata

Aquí se presenta una técnica experimental de microscopía intravital de fluorescencia para visualizar heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos. Esta tecnología microscópica será valiosa para estudiar el mecanismo molecular de la enfermedad vascular y para poner a prueba los agentes farmacológicos bajo condiciones fisiopatológicas.

Imágenes en tiempo real de heterotypic plaquetas neutrófilos Interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos

Esta aplicación simplificada de la microscopía intravital de las venas del mesenterio en ratones se puede utilizar en diferentes modelos de inflamación para observar las interacciones leucocito-endotelial y plaqueta-leucocito.

Interacciones intravital microscopía de leucocitos endoteliales y plaquetas de leucocitos en mesenterial venas en ratones

Los monocitos son importantes mediadores de la Arteriogénesis en el contexto de la enfermedad arterial periférica. Utilizando una matriz similar a la membrana del sótano y microscopia intravital, este protocolo investiga monocito recalada y relacionados con el tumor angiogénesis después de la inyección de monocitos en el modelo murino de la ligadura de la arteria femoral.

Microscopia intravital de monocito autoguiado hacia el blanco y la angiogénesis tumorales en un modelo murino de la enfermedad Arterial periférica

Aquí, mostramos cómo realizar la microscopía intravital en los ventosos post-capilares del músculo cremaestro del ratón. Comúnmente aplicados a diferentes modelos de inflamación y sepsis, particularmente los inducidos por quimioquinas y citoquinas, destacamos su relevancia en el estudio de las muscolopatías que implican una infiltración exagerada de leucocitos musculares.

Infiltración de leucocitos del músculo cremaestro en ratones evaluado por microscopía intravital

El reclutamiento de leucocitos y plaquetas constituye un componente esencial necesario para el crecimiento efectivo de las arterias colaterales durante la arteriogénesis. La microscopía multifotónica es una herramienta eficiente para rastrear la dinámica celular con alta resolución espacio-temporal in vivo y menos fototoxicidad para estudiar el reclutamiento y extravasación de leucocitos durante la arteriogénesis.

Imágenes intravitales multifotónicas para la monitorización del reclutamiento de leucocitos durante la arteriogénesis en un modelo de extremidades posteriores murinas

Aprende microscopía intravital para analizar la migración de células madre en la microcirculación del músculo cremaster de ratón. Este método permite visualizar interacciones célula-endotelio en tiempo real.

Microscopia intravital de la microcirculación en el músculo de ratón Cremaster para el análisis de la migración de la célula madre periféricas (Video) | JoVE Journal

Microscopia intravital de la microcirculación en el músculo de ratón Cremaster para el análisis de la migración de la célula madre periféricas

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