Name: Microscopia intravital de la microcirculación en el músculo de ratón Cremaster para el análisis de la migración de la célula madre periféricas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Aprende microscopía intravital para analizar la migración de células madre en la microcirculación del músculo cremaster de ratón. Este método permite visualizar interacciones célula-endotelio en tiempo real.

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Todo el protocolo después de aislamiento de células tarda aproximadamente 2 horas. 1. Preparación microquirúrgica <ol><li> Realizar el aislamiento de células madre de la médula ósea del donante y etiquetado fluorescente de la subpoblación aislada de acuerdo con protocolos 9,12 permitir que las células descansan durante el tiempo que se realiza la operación de los animales estandarizados. Para el marcaje fluorescente recomendamos CFDA (succinimidiléster diacetato de carboxifluoresceína). </li><li> Anestesiar a un ratón macho 20-25 g de peso con ketamina (75 mg / kg) y xilazina (2.5 mg / kg). A lo largo de los procedimientos quirúrgicos y protocolos experimentales, la anestesia debe ser mantenida por los suplementos (10% de la inyección inicial, ip), según sea necesario (por lo general cada 30 a 60 min). </li><li> Afeitarse suavemente la cara anterior del escroto derecho, así como el muslo derecho y la ingle. Recoge todos pierden el cabello con un bastoncillo de algodón humedecido. Coloque el lado ventral del ratón hacia arriba en un escenario de visualización de plexiglás y fijar la cuotat usando cortina elástica. Está hecho a medida La etapa, que consiste en una placa base y una segunda placa en el borde caudal de la placa base para la elevación de las dos piernas y el escroto. Coloque el escenario en una almohadilla térmica para mantener la temperatura del cuerpo a 37 ° C. Después de la fijación en el escenario, colocar al animal en un microscopio de funcionamiento y realice los siguientes pasos de la operación usando 10 - a la ampliación de 16 veces. </li><li> Hacer la incisión inicial con unas tijeras de la piel en el muslo derecho, justo por delante de los vasos femorales de la rodilla hasta la ingle. </li><li> Identificar la arteria femoral y seguirla en dirección proximal, la movilización de la arteria de los tejidos blandos circundantes. Identificar y cortar una rama grande al testículo izquierdo con termocauterio. A partir de entonces colocar una sutura estancia superficialmente en el testículo izquierdo. Tracción suave facilitará aún más la movilización proximal de la arteria femoral. </li><li> Después de la terminación de la movilización proximal, identificar y cortar una rama grande corriendo medially en el muslo por termocauterio. A partir de entonces ligar la arteria femoral en la parte distal del muslo derecho. Tracción suave sobre la ligadura ayudará más preparación. </li><li> Girar la atención ahora a la arteria femoral proximal de nuevo y colocar una sutura alrededor de la arteria como proximalmente como sea posible. Preparar un nudo, pero no lo ate abajo todavía. Aplicar una suave tracción a la sutura y crear un retorcimiento arterial. </li><li> Después de establecer el retorcimiento, haga una incisión de la arteria está utilizando cuidadosamente un microscissor. Tenga especial cuidado de no dañar la vena femoral. </li><li> Insertar un microcatéter preparado (diámetro interior 0,28 mm) a través de la incisión. El catéter debe ser desaireado (cloruro de sodio 0,9%, NaCl) y conectado a una inserción antes de jeringa de 1 ml. </li><li> Después de la inserción exitosa del catéter, aflojar cuidadosamente el acodamiento con el fin de facilitar el paso del catéter. El flujo de sangre arterial debe ser inmediatamente visible dentro del catéter. Avanzar suavemente el catéter de pocos milímetross más allá del retorcimiento anterior. A partir de entonces, la corbata por la ligadura preparado para la fijación del catéter. </li><li> Enjuague suavemente el catéter (0,9% NaCl) y aspirar para confirmar la posición correcta. Utilice un trozo de cinta adhesiva para asegurar aún más el catéter para la etapa de operación. </li><li> Después de la fijación adecuada, coloque el catéter a un lado para los siguientes pasos de preparación del músculo cremáster. Aplicar el lavado regular y aspiración del catéter cada 5-10 minutos con el fin de prevenir la formación de coágulos. </li><li> Gire ahora la atención en el escroto derecho y hacer una incisión cortando la piel y la fascia por encima de la cara ventral del escroto derecho. Tenga cuidado de no tocar el tejido subyacente con ningún instrumento. </li><li> Extender la incisión hasta el pliegue inguinal y caudalmente hasta el extremo distal del escroto. </li><li> Tejido cuidadosamente separada subyacente suave y conectivo encima del saco cremáster, sin tocarlo. Identifique el extremo distal del cremáster, y colocar una sutura estancia aquí para slightly extender el músculo. Resecar ahora el tejido blando restante debajo del saco muscular tirando suavemente el músculo caudal y anterior. </li><li> Después de la separación completa a partir de tejido conectivo, abrir el saco cremáster en un punto en el borde craneal con unas tijeras. Extender la incisión de esta abertura hacia abajo hasta el extremo distal del músculo. </li><li> Selle la pequeña embarcación que conecta el testículo y el cremáster usando termocauterio, después cortar los contactos que persisten entre el músculo y el testículo con unas tijeras. </li><li> Deja a un lado del testículo, fuera del campo de la microscopía. </li><li> El cremáster abierto ahora está plano en el escenario. Coloque cuatro puntos de Prolene 6-0 estancia en los bordes de los tejidos y fijarlas con cortina elástica con el fin de extender el tejido del músculo cremáster. A partir de ahora humedecer continuamente el tejido con solución salina tamponada con fosfato (PBS) usando una jeringa de 1 ml (Figura 1). </li><li> Autorizar ahora la preparación reposar 15 min. A partir de entonces inyectar0,05-0,1 ml de 1% de rodamina-dextrano a través de la arteria femoral izquierda para la mejora de contraste de la microvasculatura. Si se planifican las quimiocinas o agentes inflamatorios para su aplicación, ahora debería humedecer tópicamente el músculo con el respectivo reactivo usando una jeringa de 1 ml. En el caso de un experimento de control, continuar humedeciendo con PBS. </li></ol> 2. Microscopia intravital <ol><li> Mantenga el ratón fijada en la etapa de operación y moverse bajo un microscopio de fluorescencia modificado para epi-iluminación y conectado a un CCD (dispositivo de carga acoplada) de la cámara de vídeo. Tenga especial cuidado de no dislocar el catéter en la arteria femoral. </li><li> Llevar a cabo experimentos utilizando un objetivo de inmersión en agua. </li><li> Después de ajustar el objetivo para la visualización suficiente de la microcirculación cremáster y antes de la inyección de células, definir estocásticamente seis vénulas post-capilares para su posterior análisis de la firma de la adhesión de células madre. </li><li> Administrar las células madre fluorescentes que llevan la etiqueta,disuelto en 200 l de PBS, a 0,4 x 10 6 células por inyección, con un total de cinco inyecciones consecutivas utilizando el catéter en la arteria femoral y una jeringa de 1 ml. Sacudir cuidadosamente la muestra de células antes de la primera inyección. </li><li> Células madre disco de los Rolling inmediatamente después de la inyección de células, definiendo de este modo &quot;rodar&quot; como una reducción de más del 50% de la velocidad de la célula a lo largo del revestimiento endotelial en combinación con típico celular &quot;palo y liberar&quot; movimientos. Lleve a cabo el recuento de las células madre de rodadura y todas las células madres que pasan una distancia predefinida venular durante 1 min de la observación después de cada inyección única. La cantidad de laminación de células madre se expresa como porcentaje de todas las células que pasan. No contar las células que exhiben fenómenos inmovilización breves aleatorios como células de rodadura. </li><li> Después de la última inyección de células determinar el número de células madre firmemente adherentes contando y expresar la cantidad en relación a la superficie endotelial calculado de the seis vénulas predefinidos (diámetro x largo x π) como células adherentes / mm 2. Adherencia firme se considera cuando hay movimiento celular es detectable durante 30 segundos. </li><li> Después de la terminación de la microscopía intravital retirar con cuidado el músculo cremáster y almacenarlo en correspondencia con el análisis posterior (inmunohistoquímica o biología molecular). Sacrificio del animal por dislocación cervical. El análisis de las grabaciones de microscopía intravital para la cuantificación de la laminación de células madre y firme adhesión endotelial, así como la hemodinámica microvasculares, tales como la velocidad de la sangre de glóbulos rojos (mm / s), la eslora del buque (m), el diámetro del vaso (m), tasa de cuota de pared (s-1); se debe realizar fuera de línea por un investigador ciego para el tratamiento respectivo tejido experimental que utiliza un software de procesamiento de imágenes. </li></ol>

<ol><li>Madlambayan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+stem+and+progenitor+cell+contribution+to+neovasculogenesis+is+dependent+on+model+system+with+SDF-1+as+a+permissive+trigger%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger.</a> Blood. 114, 4310-4319 (2009).</li>
<li>Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+stem+cells+find+their+way+home%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">How do stem cells find their way home?</a> Blood. 106, 1901-1910 (2005).</li>
<li>Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+leukocyte+interaction+with+platelets+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells.</a> Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).</li>
<li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research%3A+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li>
<li>Leister, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peritoneal+cavity+chamber+for+intravital+microscopy+of+the+liver+under+conditions+of+pneumoperitoneum%5BTitle%5D)+AND+%22Surg.+Endosc%22%5BJournal%5D)">A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum.</a> Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).</li>
<li>Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+bone+marrow-derived+mast+cells+roll+on+P-selectin+under+conditions+of+flow+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo.</a> Lab Invest. 74, 634-643 (1996).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li>
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<li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMGB-1+induces+c-kit%2B+cell+microvascular+rolling+and+adhesion+via+both+toll-like+receptor-2+and+toll-like+receptor-4+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells.</a> J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).</li>
<li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+intravascular+administration+of+mesenchymal+stem+cells+safe%3F+Mesenchymal+stem+cells+and+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy.</a> Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).</li>
<li>Donndorf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+migratory+properties+of+human+CD+133%28%2B%29+stem+cells+in+vivo+after+intraoperative+sternal+bone+marrow+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation.</a> Cell Transplant. , (2012).</li>
</ol>

Todos los experimentos con animales, llevados a cabo por este manuscrito han sido aprobados por el comité local de cuidado y uso de animales. Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

<html> Microscopía de fluorescencia intravital permite la visualización directa y el análisis cuantitativo de la madre de las interacciones célula-endotelio. El modelo de músculo cremáster es particularmente útil, ya que la exposición de microcirugía y técnicas de visualización intravital han sido bien establecido durante la investigación sobre las interacciones entre leucocitos y endotelio diversos componentes químicos se puede aplicar selectivamente al tejido diana mediante la técnica de superfusión sencilla. Debido a ...

El propósito del presente artículo es describir la técnica de microscopía intravital (IVM) aplicado sobre la microcirculación cremáster ratón para la observación directa y el análisis de médula ósea periférica migración de células madre. La regeneración de tejidos y de órganos El concepto actual de células madre basado implica el homing de las células madre derivadas de la médula ósea al tejido lesionado 1. Un paso crucial para el éxito de la migración de células madre incluye la interacción de células madre con el endotelio local dentro del órgano lesionado, seguido de la migración transendotelial y, finalmente, el injerto de órganos 2. Análisis intravital de estas células madre - interacciones de células endoteliales se forma un parámetro ideal para la cuantificación de una respuesta regenerativa de células madre basada en diferentes contextos fisiopatológicos in vivo. Además, parece concebible, que, en el futuro, el análisis intravital de la capacidad migratoria de p específico de células madreopulations dentro de los entornos de la microcirculación estandarizadas, podrían aplicarse antes de avanzar en estas poblaciones de más pruebas clínicas. Microscopía intravital se ha desarrollado inicialmente para la observación y cuantificación de la interacción célula-endotelial de leucocitos in vivo en el campo de la investigación inflamatoria 3. Primeras grabaciones exitosas de estudios de microscopía intravital fueron reportados por Cohnheim ya en el siglo 19, el estudio de las lenguas y entresijos de rana con un microscopio de luz 4. Desde su primer uso IVM ha experimentado un enorme desarrollo técnico y en la actualidad ciertos componentes esenciales formen requisitos previos para llevar a cabo IVM cuantitativa: (i) preparaciones de tejidos que permiten el acceso óptico, (ii) sondas moleculares que pueden ser detectadas por un microscopio, (iii ) un microscopio conectado a un sistema de detección y (iv) los sistemas de análisis basados ​​en ordenador que puede extraer parámetros de interés a partir de los datos de imagenestablecer 4. Una variedad de preparaciones de tejidos se ha introducido para los estudios de MIV incluyendo los entresijos y el hígado del ratón y de rata 5, las cámaras de los pliegues cutáneos dorsal de ratón 6 y el hámster, la oreja del conejo y de la bolsa de la mejilla del hámster por nombrar algunos. Sin embargo, en lo que sigue nos centraremos en el músculo cremáster ratón, lo que representa un tejido ideal para las observaciones intravitales, como la preparación y la visualización son posibles mediante un procedimiento quirúrgico bien estandarizados, y en general no se producen problemas de artefactos de movimiento. La preparación del músculo cremáster abierto se llevó a cabo por primera vez en la década de 1970 por Báez y sus colegas 7. Originalmente descrito para ratas, se ha adoptado con éxito también para el ratón 8. Después de los estudios anteriores se habían centrado principalmente en la interacción de leucocitos con la pared del vaso, nuestro grupo ha presentado recientemente la preparación Cremáster ratón como valoraciónble herramienta para la visualización directa y el análisis cuantitativo de la madre de las interacciones célula-endotelio dentro de un microambiente definido 9. Varios subpoblaciones de células madre se han estudiado utilizando este modelo, incluyendo las células madre mesenquimales de c-kit murino + de células madre de médula ósea y, así como de CD humano células madre de la médula ósea 133 + 10-12. Tras el aislamiento de células de donante de médula ósea y etiquetado fluorescente para la visualización, las células madre se aplican selectivamente en la microcirculación cremáster la utilización de una inyección arterial a través de la arteria femoral, evitando de este modo cualquier atrapamiento de células dentro de los órganos remotos. Además, el modelo de músculo cremáster es particularmente útil, ya que diversas quimiocinas potencialmente que median la migración de células madre local dentro de los ajustes respectivos, se pueden aplicar tópicamente al tejido diana mediante la técnica de superfusión sencilla.

<table><tbody><tr><td>Diacetato de carboxifluoresceína succinimidylester (CFDA)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine 6 G (1%)</td><td>Sigma-Aldrich, Munich, Alemania</td><td>83697</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin (Ketanest)</td><td>Pfizer, Berlín, Alemania</td><td>no disponible</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina (Rompun)</td><td>Bayer, Leverkusen, Alemania</td><td>no disponible</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Dulbecco - solución salina tamponada (PBS)</td><td>PAN Biotech, Aidenbach, Alemania</td><td>P04-36500</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopia intravital de la microcirculación en el músculo de ratón cremaster para el análisis de la migración de la célula madre periféricas

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

En la era de los protocolos de aplicación de células intravasculares en el contexto de la terapia celular regenerativa, los mecanismos subyacentes de la migración de células madre de tejido nonmarrow no han sido completamente aclarados. Se describe aquí la técnica de microscopía intravital aplicado a la microcirculación cremáster ratón para el análisis de médula ósea periférica migración de células madre in vivo. Microscopía intravital de la M. cremáster se ha introducido previamente en el campo de la investigación inflamatoria para la observación directa de la interacción de leucocitos con el endotelio vascular. Desde madre periféricas suficiente y la migración de células progenitoras incluye los pasos iniciales similares de rodar a lo largo de y la adhesión firme en el revestimiento endotelial es concebible aplicar el modelo M. cremáster para la observación y cuantificación de la interacción de las células madre administrados intravasculary con el endotelio. Como diversos componentes químicos pueden ser aplicados selectivamente a la diana Tproblema mediante técnicas de superfusión simples, es posible establecer condiciones previas esenciales microambientales, para el reclutamiento de células madre inicial que tendrá lugar en un organismo que vive fuera de la médula ósea.

En general, la interacción de directamente inyectado células madre o progenitoras con el endotelio vascular dentro de la microcirculación músculo cremáster es un evento raro y se produce exclusivamente en las vénulas postcapilares (diámetro: 30-80 micras). Debido a la fluorescencia de etiquetado de rodadura y las células madre firmemente adherentes pueden ser claramente cuantificados en la separación de leucocitos circulantes endógenas en las vénulas observadas (Figura 2). L...

Microscopía intravital del cremáster microcirculación ratón M. ofrece un único y bien estandarizada-modelo in vivo para el análisis de médula ósea periférica migración de células madre en.

Microscopia intravital de la microcirculación en el músculo de ratón Cremaster para el análisis de la migración de la célula madre periféricas

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar las interacciones entre células madre y células endoteliales in vivo. Esto se logra primero introduciendo un catéter en la arteria femoral de un animal sedado para obtener acceso intraarterial. En el segundo paso, el músculo crural se prepara quirúrgicamente para la microscopía de fluorescencia intravital.A continuación, se inyecta la población de células madre de interés mediante un catéter en la arteria femoral. En última instancia, pueden visualizarse y cuantificarse las interacciones entre las células madre transferidas adoptivamente y el endotelio de la microcirculación muscular principal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina regenerativa, como por ejemplo cómo se regula la migración de las células madre aplicadas terapéuticamente dentro de un organismo vivo?Antes de comenzar la microcirugía, prepare un catéter conectado a una jeringa de un mililitro con cloruro de sodio al 0,9%. Luego, afeite suavemente la cara anterior del escroto derecho, así como el muslo derecho e ingle de un ratón macho anestesiado de 20 a 25 miligramos. Recopile todo el vello suelto con un hisopo humedecido y, a continuación, coloque al ratón con la cara ventral hacia arriba sobre una plataforma de visualización hecha a medida de plexiglás, compuesta por una placa base y una segunda placa en el borde cóncavo de la placa base para elevar ambas patas traseras y el escroto.Después de fijar las patas con un campo elástico, coloque la plataforma sobre una almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura corporal del animal a 37 grados Celsius. Luego, utilizando un aumento de 10 a 16 veces, use un microscopio de disección y un par de tijeras para realizar una incisión inicial en el muslo derecho, justo anterior a los vasos femorales, desde la rodilla hasta la ingle. Identifique la arteria femoral y siga su trayecto en dirección proximal, liberando la arteria del tejido blando circundante.Luego, mediante cauterización térmica, identifique y corte una rama arterial grande que conduce al testículo izquierdo. Coloque una sutura de retención de prolene 6-0 superficialmente en el testículo izquierdo. A continuación, identifique y cauterice térmicamente la rama arterial grande que discurre medialmente en el muslo.A continuación, utilizando tracción suave, ligue la arteria femoral en la parte distal del muslo derecho y luego coloque una sutura alrededor de la arteria femoral proximal lo más cerca posible al centro del animal. Ahora, coloque un nudo suelto alrededor de la arteria femoral, pero no lo ate. Luego aplique tracción suave sobre la sutura para crear un plegamiento arterial.Después de establecer el quiebre, use un par de tijeras microquirúrgicas para seccionar cuidadosamente la arteria, teniendo especial cuidado de no dañar la vena femoral. A continuación, inserte el microcatéter previamente preparado dentro de la incisión. Afloje cuidadosamente el quiebre para facilitar el paso del catéter.El flujo sanguíneo arterial debe ser visible inmediatamente dentro del catéter. Avance lentamente el catéter unos pocos milímetros más allá del doblez anterior. Luego ate la ligadura preparada para fijar el catéter.Ahora, enjuague suavemente el catéter con cloruro de sodio y luego aspire la solución para confirmar la posición correcta del catéter. Utilice un trozo de cinta adhesiva para asegurar aún más el catéter a la plataforma quirúrgica. Una vez que el catéter haya sido fijado adecuadamente y desplazado hacia un lado, corte la piel y la fascia por encima del aspecto ventral del escroto derecho.Teniendo cuidado de no tocar el tejido subyacente con ningún instrumento. Extienda la incisión hasta el pliegue inguinal y proximalmente hasta el extremo distal del escroto. Luego, separe cuidadosamente los tejidos blandos y conectivos subyacentes por encima de la bolsa del cremáster sin tocar el tejido mismo.Luego, coloque una sutura de prolina de seis hilos en el extremo distal del cremástero para extender ligeramente el músculo. A continuación, tire suavemente del músculo hacia delante y anteriormente para resecar el tejido blando restante debajo de la bolsa muscular. Tras la separación completa del tejido conectivo, use un par de tijeras para abrir la bolsa del cremástero en el borde craneal y extender la incisión desde esta abertura hasta el extremo distal del músculo.Después de cauterizar térmicamente el pequeño vaso que conecta el testículo con el músculo cremaster, use tijeras para cortar las conexiones restantes entre el músculo y el testículo. El cremaster abierto quedará ahora plano sobre la plataforma. A continuación, coloque cuatro suturas de prolina seis-0 en los bordes del tejido y fíjelas con la cubierta elástica.Con el fin de extender el tejido del músculo cremasterio a partir de este momento, utilice una jeringa de un mililitro para humedecer continuamente el tejido con PBS. Después de que la preparación haya reposado durante 15 minutos, inyecte de 0,05 a 0,1 mililitros de dextrina al 1 % a través de la arteria femoral izquierda para mejorar el contraste de la microvasculatura. Ahora, mueva al ratón y la platina bajo un dispositivo de acoplamiento de carga.Cámara de video conectada a microscopio de fluorescencia, modificado para iluminación en epifluorescencia, teniendo especial cuidado de no desplazar el catéter arterial femoral. Después de ajustar el objetivo de inmersión en agua para lograr una visualización adecuada de la microcirculación del chma, se definieron aleatoriamente seis venulas poscapilares para el posterior análisis de la adhesión firme de células madre. A continuación, cargue una jeringa de un mililitro con 200 microlitros de las células madre de médula ósea del donante marcadas previamente con fluorescencia.Toque suavemente la jeringa para resuspender, suspender la suspensión celular y luego administrar las células a través del catéter femoral en inyecciones de 40 microlitros, para un total de cinco inyecciones consecutivas. Registre el desplazamiento de las células madre inmediatamente después de la inyección celular. Defina el desplazamiento como una reducción superior al 50 % de la velocidad celular a lo largo del revestimiento endotelial, en combinación con los movimientos típicos de adherencia y liberación celular.Después de finalizar la microscopía intravital, retire cuidadosamente el músculo cremaster y guárdelo para su análisis posterior. En general, la interacción de células madre o progenitoras inyectadas directamente con el endotelio vascular dentro de la microcirculación del músculo cremaster es un evento raro y ocurre exclusivamente en las venulas poscapilares debido al marcado fluorescente. Las células que rulan, indicadas por la flecha negra, y las células madre firmemente adheridas, indicadas por las flechas blancas, pueden distinguirse claramente de los leucocitos endógenos circulantes en el tejido.Las condiciones microcirculatorias representadas por la velocidad del flujo sanguíneo y la tasa de cizallamiento en la pared generalmente no difieren significativamente entre los respectivos grupos experimentales con diferentes tratamientos de quimiocinas. El tratamiento local del tejido muscular del ker máster con distintas quimiocinas o mediadores de la respuesta inflamatoria, por ejemplo, el factor de células estromales uno alfa o el factor de necrosis tumoral alfa, es capaz de imitar condiciones microambientales específicas.Dichas condiciones mejoran las interacciones entre células madre y células endoteliales en diversos grados, dependiendo del quimioatrayente o mediador específico aplicado y de la población de células madre inyectada. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar las interacciones entre células madre y células endoteliales in vivo mediante microscopía intravital de la microcirculación muscular CreER.

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Investigación

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Biology

Biología

Un método nuevo y versátil para la observación de la microcirculación se presenta. Se considera adecuado para observación a largo plazo, y para la combinación con intervenciones biológicas pharmacophysiological o molecular.

En vivo la micro-circulación de medición en el músculo esquelético de Intra-vital Microscopía

Microscopia intravital para seguir los acontecimientos hemodinámicos e inflamatorios temporal y espacial en la microcirculación pial.

Microscopia intravital de la microcirculación del cerebro del ratón con una ventana craneal cerrado

A la preparación del tejido se describe para la visualización y la manipulación experimental de la microcirculación de vida. En los ratones macho anestesiado, el delgado y muy vascularizado músculo cremáster se prepararon para microscopía intravital para estudiar las redes microvasculares como las arteriolas, capilares y vénulas. Esta preparación se adapta fácilmente a las ratas y hámsters.

El ratón Cremaster preparación muscular for Imaging intravital de la microcirculación

Microiontophoresis implica movimiento de los iones a partir de una micropipeta en respuesta a una diferencia de potencial eléctrico entre el interior y el exterior de la micropipeta. Moléculas biológicamente activas así son liberados en proporción a la corriente eléctrica. Nos ilustran microiontophoresis acetilcolina en conjunto con micromanipulación para estudiar vasodilatación dependiente del endotelio en la microcirculación.

Microiontophoresis y micromanipulación de imagen intravital de fluorescencia de la microcirculación

Se describe un protocolo de la microscopía de campo claro intravital para medir la dinámica de los neutrófilos interacciones célula endotelial durante el reclutamiento de neutrófilos en respuesta a la fuente de un quimioatrayente de neutrófilos en vivo. Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración y la quimiotaxis transendotelial en tejido de ratón músculo cremáster se visualizan con la fotografía de vídeo de tiempo transcurrido y el seguimiento con ImageJ.

Seguimiento de Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración transendotelial y la quimiotaxis de los tejidos por microscopía de vídeo intravital

Digital microscopía intravital epifluorescencia de vénulas post-capilares de la microcirculación cremastérico es un método conveniente para obtener información sobre la interacción...

En tiempo real de imágenes digitales de los leucocitos del endotelio interacción en el daño por isquemia-reperfusión (IRI) del músculo cremáster Rata

Aquí se presenta una técnica experimental de microscopía intravital de fluorescencia para visualizar heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos. Esta tecnología microscópica será valiosa para estudiar el mecanismo molecular de la enfermedad vascular y para poner a prueba los agentes farmacológicos bajo condiciones fisiopatológicas.

Imágenes en tiempo real de heterotypic plaquetas neutrófilos Interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos

Esta aplicación simplificada de la microscopía intravital de las venas del mesenterio en ratones se puede utilizar en diferentes modelos de inflamación para observar las interacciones leucocito-endotelial y plaqueta-leucocito.

Interacciones intravital microscopía de leucocitos endoteliales y plaquetas de leucocitos en mesenterial venas en ratones

Los monocitos son importantes mediadores de la Arteriogénesis en el contexto de la enfermedad arterial periférica. Utilizando una matriz similar a la membrana del sótano y microscopia intravital, este protocolo investiga monocito recalada y relacionados con el tumor angiogénesis después de la inyección de monocitos en el modelo murino de la ligadura de la arteria femoral.

Microscopia intravital de monocito autoguiado hacia el blanco y la angiogénesis tumorales en un modelo murino de la enfermedad Arterial periférica

Aquí, mostramos cómo realizar la microscopía intravital en los ventosos post-capilares del músculo cremaestro del ratón. Comúnmente aplicados a diferentes modelos de inflamación y sepsis, particularmente los inducidos por quimioquinas y citoquinas, destacamos su relevancia en el estudio de las muscolopatías que implican una infiltración exagerada de leucocitos musculares.

Infiltración de leucocitos del músculo cremaestro en ratones evaluado por microscopía intravital

El reclutamiento de leucocitos y plaquetas constituye un componente esencial necesario para el crecimiento efectivo de las arterias colaterales durante la arteriogénesis. La microscopía multifotónica es una herramienta eficiente para rastrear la dinámica celular con alta resolución espacio-temporal in vivo y menos fototoxicidad para estudiar el reclutamiento y extravasación de leucocitos durante la arteriogénesis.

Imágenes intravitales multifotónicas para la monitorización del reclutamiento de leucocitos durante la arteriogénesis en un modelo de extremidades posteriores murinas

Aprende microscopía intravital para analizar la migración de células madre en la microcirculación del músculo cremaster de ratón. Este método permite visualizar interacciones célula-endotelio en tiempo real.

Microscopia intravital de la microcirculación en el músculo de ratón Cremaster para el análisis de la migración de la célula madre periféricas (Video) | JoVE Journal

Microscopia intravital de la microcirculación en el músculo de ratón Cremaster para el análisis de la migración de la célula madre periféricas

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