Digital Inline holográfica Microscopía (MHDL) de sujetos débilmente dispersión de

El objetivo general del siguiente experimento es reconstruir la posición 3D en geometría de una cadena de células bacterianas nadadoras. Esto se logra cultivando primero células bacterianas a la concentración correcta para proporcionar una muestra adecuada para la obtención de imágenes. Como segundo paso, la fuente de luz LED se configura y alinea, lo que permite obtener imágenes holográficas.

A continuación, se utiliza el software de reconstrucción para obtener las coordenadas 3D de una cadena de células bacterianas. Los resultados muestran la capacidad de reconstruir la posición y configuración 3D de las células bacterianas a partir de imágenes holográficas. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la microscopía confocal, es que es posible obtener imágenes volumétricas sin etiquetas a altas velocidades de fotogramas.

Para comenzar a inocular, 10 mililitros de medios KTY con cristales de hielo de una reserva congelada de estreptococos cepa V 4 0 5 1 1 97 incuban el cultivo iniciador en un agitador giratorio durante la noche a 35 grados Celsius y 150 RPM. Una vez que haya crecido, inocule 10 mililitros de medio KTY fresco con 500 microlitros del cultivo iniciador saturado. Incubar durante 3,5 horas a 35 grados Celsius y 150 RPM hasta que las células alcancen una densidad óptica a una longitud de onda de 600 nanómetros de 0,8 a 1,0.

Esto representa aproximadamente cinco veces 10 a la octava celda por mililitro. A continuación, diluya las células de uno a 400 en medios frescos para obtener la concentración final de aproximadamente 1 millón de células por mililitro. A continuación, llene una jeringa con vaselina y haga un anillo de grasa de un milímetro de altura en un portaobjetos de microscopio.

A continuación, coloque una gota de la solución de muestra en el centro. Coloque suavemente un cubreobjetos sobre la muestra y presione ligeramente el vaso para sellar los bordes, asegurándose de que el líquido esté en contacto tanto con el portaobjetos como con el cubreobjetos. La cámara de muestra resultante debe terminar entre 100 y 200 micrómetros de profundidad.

Gire una lente de inmersión en aceite de 60 x en su lugar y agregue una gota de aceite. A continuación, coloque la cámara de muestras en la platina del microscopio con el cubreobjetos hacia abajo. Asegúrese de que no se formen burbujas de aire entre el cubreobjetos de vidrio y la lente.

Concéntrese en la superficie inferior de la cámara de muestras y, a continuación, enfoque el condensador. A continuación, apague la iluminación estándar y coloque el cabezal LED detrás de la apertura del condensador del microscopio. Asegúrese de que el condensador esté configurado en modo de campo brillante y configure la fuente de alimentación LED a la salida máxima.

A continuación, cierre la apertura del condensador al máximo y empuje el LED en su montura hasta que la iluminación se centre en la apertura de la lente del objetivo. Encienda la computadora y luego redirija la ruta de la luz al puerto de la cámara del microscopio. Ajuste la velocidad de fotogramas a 30 fotogramas por segundo y el tamaño de la imagen a cinco 12 por cinco 12 píxeles en el software de adquisición de imágenes.

Compruebe un histograma de intensidad de imagen para asegurarse de que ninguna parte de la imagen esté saturada o subexpuesta. El tiempo de exposición del encuadre debe ser lo más corto posible y mantener un buen contraste. Si las células se acumulan cerca de una interfaz, vuelva a enfocar el microscopio para que las células bacterianas se desenfoquen ligeramente.

Las células deben estar a una distancia aproximada de 10 a 30 micras del plano focal para una reconstrucción óptima. Después de volver a enfocar, adquiera una serie de fotogramas de vídeo y guárdelos como un archivo VI sin comprimir. A continuación, inicie el software DIHM disponible para su descarga gratuita para convertir un fotograma de vídeo en una pila de imágenes reenfocada numéricamente.

Con el software se proporcionan fotogramas de ejemplo para comenzar la reconstrucción. Introduzca el marco de interés y su fondo como archivos de imagen separados en los cuadros. La imagen de fondo representa fielmente el fondo del vídeo en ausencia del holograma y se utilizará para suprimir cualquier ruido de patrón fijo que pueda interferir con la localización y el análisis holográficos.

A continuación, introduzca los parámetros de la pila de salida en los cuadros de configuración global. En primer lugar, introduzca la posición axial del primer fotograma en el foco de inicio. A continuación, introduzca el número de sectores de la pila reconstruida en número de pasos y, por último, introduzca la distancia real entre cada sector de la pila en tamaño de paso.

Establezca el tamaño del paso para que sea el mismo que el espaciado lateral de píxeles para reconstruir objetos con las proporciones correctas utilizando los datos de ejemplo. Este valor debe ser 0,233 micrómetros. A continuación, introduzca la iluminación, la longitud de onda y el índice de refracción medio de la cámara, así como la frecuencia de muestreo lateral.

En el cuadro de píxeles por micra, la frecuencia de muestreo lateral de la cámara se puede encontrar dividiendo la ampliación de la lente del objetivo por el tamaño de píxel del sensor de la cámara. Usando los datos del ejemplo, el número sería 60 x dividido por 14 micrómetros igual a 4,29 píxeles por micra. Luego, si el centro del objeto está oscuro en el holograma, presione el botón de degradado Z de voltear.

Esto aplicará un filtro que extrae objetos por debajo del plano focal en la muestra original. A continuación, active el filtro de paso de banda, que es responsable de suprimir la contribución de píxeles ruidosos a la imagen. Se aplica a cada segmento de imagen inmediatamente después de la generación.

A continuación, verifique el estado de encendido y apagado del interruptor de salida intermedio y asegúrese de que estén encendidos. Cuando estos interruptores están encendidos, se crearán dos videos. La primera salida es la pila de reenfoque con un nombre de archivo que termina en pila a V.La segunda pila es la operación de gradiente real con un nombre de archivo que termina en degradado a VI.Idealmente, esta segunda pila contendrá el objeto de interés resaltado como un objeto brillante sobre un fondo oscuro.

Después de configurar todos los parámetros, presione ejecutar en la ventana principal para ejecutar los comandos. El fotograma seleccionado aparecerá en el cuadro principal del software. A continuación, utilice la herramienta de lupa que se encuentra en la barra de herramientas a la izquierda de la imagen para acercar y alejar.

Use la herramienta rectángulo para seleccionar una región de interés o ROI y capture la mayor cantidad posible de franjas de hologramas dentro del rectángulo para optimizar la reconstrucción. Finalmente, presione el botón de proceso para generar las dos pilas de imágenes separadas. Inspeccione las pilas resultantes utilizando la imagen J disponible en este sitio web.

Si el objeto de interés se puede ver claramente en la pila de imágenes de degradado, vaya a la sección de representación para extraer las coordenadas del objeto. Para comenzar a renderizar, presione el botón de extracción de características para habilitar la función de ubicación de coordenadas X, Y, Z. A continuación, introduzca una ruta y una extensión para el archivo de coordenadas de salida, seleccione Estilo de rayo POV en el cuadro de estilo de coordenadas de salida.

Esto hace que el programa escriba un archivo de objeto que se puede visualizar utilizando el paquete de software gratuito de trazado de rayos POV, que se puede obtener de este sitio web, reprocese las imágenes para extraer las coordenadas de los objetos. El programa proporcionará una serie de coordenadas X, Y, Z en el ROI seleccionado escrito en el nombre del archivo en el cuadro de cables de salida. La extracción de coordenadas de objetos tarda mucho más que la generación de pilas.

Asegúrese de que el archivo de rayos POV de muestra suministrado con el código de reconstrucción esté presente en la misma carpeta que el archivo de coordenadas de salida. Edite el archivo punto pov de muestra y reemplace el nombre del archivo entre comillas en la línea. Incluya mi archivo NC con el nombre del archivo de datos generado por el código de reconstrucción.

A continuación, personaliza la posición de la cámara, la iluminación, la textura y las opciones de renderizado en POV ray. Cuando termine, haga clic en el botón Ejecutar para renderizar una imagen de mapa de bits. Esta es una imagen de una cadena de bacterias estreptococos que se orientó momentáneamente.

Termina en el plano focal. Los objetos de esta configuración son difíciles de reconstruir y, por lo general, producen un blob cerca del plano focal. Aquí se muestra una imagen correctamente renderizada representativa de la mayoría de los fotogramas de esta serie en los que la cadena no está orientada directamente a lo largo del eje óptico.

La forma y la posición del objeto se reproducen fielmente en la representación como se ve en el panel de la derecha. Una vez que se ha dominado esta técnica, se puede hacer en minutos.