Tripsina Protocolo Resumen Para analizar la vasculatura de la retina de un modelo de ratón

El objetivo general de este procedimiento es aislar la red vascular retiniana. Esto se logra primero realizando una serie de lavados con agua en la retina aislada. En el segundo paso, la retina se digiere en tripsina a 37 grados Celsius durante aproximadamente una hora a una hora y media, dependiendo del tamaño de la retina.

A continuación, se aísla la vasculatura mediante lavados adicionales con agua y disección bajo microscopio. En última instancia, pueden visualizarse cambios vasculares patológicos como microaneurismas, degeneración capilar y relación anormal entre células endoteliales y parásitos. Por lo tanto, la principal ventaja del método de digestión enzimática frente a métodos existentes, como la preparación de montajes planos de retina, es que permite resaltar toda la red vascular con gran claridad.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque es técnicamente desafiante y difícil de realizar de manera consistente. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de aislamiento vascular son difíciles de aprender únicamente con palabras. Esta es una herramienta muy valiosa en cualquier laboratorio que realice estudios de biología vascular retiniana, como en ciertas enfermedades tales como la retinopatía diabética. Jonathan Chow, un destacado estudiante de medicina de mi laboratorio, será quien demuestre esta técnica.

Después de fijar el ojo enucleado de ratón en formaldehído tamponado neutro al 10 % durante 24 horas, coloque el ojo en una placa de Petri y cúbralo con una pequeña cantidad de agua. Comience la disección haciendo un corte inicial con un par de tijeras de disección en la córnea. Luego, mientras sostiene la zona cortada con pinzas rectas, use un par de tijeras para cortar a lo largo del borde entre la córnea y la esclerótica, retirando así la córnea.

A continuación, utilice pinzas finas, curvas y rectas para desprender lentamente y con cuidado la esclerótica y la coroides de la retina hacia el nervio óptico. Luego, retire el cristalino y cualquier exceso de iris y restos de la retina para ayudar a separar las capas retinianas neuronales de los vasos sanguíneos.

Añada aproximadamente 500 microlitros de agua filtrada de 45 micrómetros a una placa de 24 pocillos y coloque la retina en un pocillo; luego agite suavemente durante cuatro a cinco horas a temperatura ambiente, cambiando el agua cada 30 a 60 minutos. Continúe lavando la retina en agua durante la noche con agitación suave. Al día siguiente, a temperatura ambiente, retire el agua y añada tripsina al 3 %; revise al microscopio para asegurarse de que no haya restos en el pocillo. Para evitar que la vasculatura se adhiera a ella, incube el tejido a 37 grados Celsius con agitación suave o sin agitación durante una a una hora y media.

Cuando el tejido comience a mostrar signos de desintegración, coloque la placa sobre la platina del microscopio y luego evite la retina. Retire cuidadosamente la tripsina para separar la vasculatura. Primero, agregue agua filtrada a la retina utilizando pinzas.

Retire la membrana limitante interna, que aparece como una capa delgada y transparente. Agite la placa con agitación suave. Después de cinco minutos, coloque la placa nuevamente sobre la platina del microscopio y reemplace cuidadosamente el agua, evitando dañar la retina para ayudar a liberar la red de vasos del tejido retiniano adherido.

Lave la retina tal como se acaba de demostrar hasta que quede poco o ningún residuo en el agua después del último lavado. Por lo general, eliminar todo el tejido no vascular es la parte más complicada del procedimiento. Las siguientes técnicas pueden utilizarse en secuencia o individualmente para facilitar el aislamiento de la red vascular; un consejo importante es sumergir todas las herramientas y la tripsina antes de manipular la retina.

Esto puede ayudar a evitar que un tejido se adhiera al equipo. Recubra la punta de una micropipeta de 200 microlitros con tripsina reservada y luego pipetee agua hacia arriba y hacia abajo, adyacente a los vasos retinianos y soplando en su dirección, provocando una agitación suave. Si el tejido no vascular aún es resistente en el centro, use una punta de micropipeta recubierta con tripsina en el nervio óptico y pipetee cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo toda la red vascular para ayudar a descomponer el tejido no vascular.

Finalmente, se pueden utilizar fórceps finos para levantar suavemente la vasculatura fuera del agua y desprender cualquier componente no vascular adherido. El resultado final debe ser una red vascular retiniana intacta y libre de desechos.

Para visualizar la vasculatura, coloque primero una gota de agua sobre un portaobjetos limpio. Luego, transfiera los vasos digeridos al agua bajo control microscópico. Si el montaje del soporte de vasos está plegado o desplegado, los vasos plegados provocan una mala visibilidad.

Una vez teñido, si el tejido está plegado, agregue agua adicional y agite suavemente la laminilla para facilitar el desdoblado. Luego, utilice una micropipeta para retirar lentamente cualquier exceso de agua. El producto final de un procedimiento exitoso es una preparación plana de toda la red de la vasculatura retiniana del ratón, con la arquitectura mantenida y teñida con hemat, toin y eoin.

Como se muestra aquí, como se observa en esta imagen, se puede apreciar una clara diferenciación entre las células endoteliales y las pericitas en la retina. Los núcleos de las células endoteliales, indicados por la flecha blanca, son ovalados o alargados y se sitúan completamente dentro de la pared del vaso. Los núcleos del parásito, indicados por la flecha negra, son pequeños, esféricos, se tiñen intensamente y generalmente presentan una posición sobresaliente a lo largo de la pared del capilar.

La tripsinización y digestión es un procedimiento común utilizado para analizar la patología vascular en modelos animales de diabetes. Esta imagen muestra un ejemplo de degeneración capilar indicada por la flecha blanca, tal como se observa en un ratón DB DB, un modelo para diabetes tipo dos. Aunque este procedimiento ha sido optimizado para retinas de ratón, también se pueden obtener resultados similares en retinas de rata.

Es importante tener en cuenta que las retinas de rata, como se muestra en estas imágenes, son más grandes que las de ratón y requieren placas de 12 en lugar de 24 pocillos. La red vascular de la retina de rata también es menos frágil que la de ratón. Es extremadamente crucial eliminar la mayor cantidad posible del tejido no vascular.

Cualquier resto provocará una tinción inespecífica y dará lugar a una mala visualización de la vasculatura. En esta imagen, por ejemplo, puede observarse una eliminación incompleta de todo el tejido no vascular. Asimismo, también es importante que la retina esté desplegada al montarla, con el fin de mejorar la visualización de la vasculatura.

Esta imagen muestra un despliegue fallido del preparado plano vascular. Tras dominar este procedimiento técnicamente difícil, los viajes y digestiones pueden ser un método extremadamente valioso que permite una visualización detallada de toda la red vascular.

Al mejorar esta técnica en el ojo del ratón, los investigadores pueden aprovechar los ratones genéticamente modificados para estudiar diversas vías que puedan controlar la vasculatura retiniana y permitirnos comprender la fisiopatología de diversas enfermedades retinianas. Como resultado, podemos mejorar nuestro entendimiento de las patologías de enfermedades como la retinopatía diabética. Al estudiar modelos de ratones como el ratón DVDB, esto puede permitir finalmente la oportunidad de encontrar nuevas intervenciones terapéuticas potenciales dirigidas a la vasculatura retiniana.