Tripsina Protocolo Resumen Para analizar la vasculatura de la retina de un modelo de ratón

El objetivo general de este procedimiento es aislar la red vascular de la retina. Esto se logra realizando primero una serie de lavados con agua en la retina aislada. En el segundo paso, la retina se digiere en tripsina a 37 grados centígrados durante aproximadamente una a una hora y media, dependiendo del tamaño de la retina.

A continuación, se aísla la vasculatura mediante lavados con agua adicionales y se disecciona bajo un microscopio. En última instancia, se pueden visualizar cambios vasculares patológicos como microaneurismas, degeneración capilar y una proporción anormal de células endoteliales a parásitos. Por lo tanto, la principal ventaja de probar y digerir sobre los métodos existentes, como la preparación de monturas planas de retina, es que toda la red vascular se puede resaltar con gran claridad.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque es técnicamente desafiante y difícil de realizar de manera consistente. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos del aislamiento vascular son difíciles de aprender solo con palabras. Esta es una herramienta muy valiosa en cualquier laboratorio que esté realizando estudios de biología vascular de la retina como algunas enfermedades como la retinopatía diabética, demostrando esta técnica Jonathan Chow, un talentoso estudiante de medicina de mi laboratorio.

Después de fijar el ojo de ratón enucleado y la formina tamponada al 10% neutro durante 24 horas, coloque el ojo en una placa de Petri y cúbralo con una pequeña cantidad de agua. Comience la disección usando un par de tijeras de disección para hacer cuidadosamente un corte inicial en la córnea. Luego, mientras sostiene el área de corte con pinzas rectas, use un par de tijeras para cortar a lo largo del borde de la córnea y la esclerótica que retira la córnea.

A continuación, utilice pinzas finas, curvas y rectas. Despegar lenta y cuidadosamente la esclerótica y la coroides de la retina hacia el nervio óptico. A continuación, retira el cristalino y el exceso de iris y residuos de la retina para ayudar a separar las capas neurales de la retina de los vasos sanguíneos.

A aproximadamente 500 microlitros de agua filtrada de 45 micrómetros a una placa de 24 pocillos y coloque la retina en un pocillo y luego agite suavemente durante cuatro a cinco horas a temperatura ambiente, cambiando el agua cada 30 a 60 minutos. Continúe lavando la retina en agua durante la noche agitando suavemente a temperatura ambiente al día siguiente, retire el agua y al 3% de tripsina, verifique bajo un microscopio para asegurarse de que no se encuentren residuos en el pozo. Para evitar que la vasculatura se adhiera a él, incube el tejido a 37 grados centígrados agitándolo suavemente o sin agitarlo durante una a una hora y media.

Cuando el tejido comience a mostrar signos de desintegración, coloque la placa en la etapa del microscopio y luego evite la retina. Retire con cuidado la tripsina para separar la vasculatura. Primero, agregue agua filtrada a la retina con fórceps.

Despegue la membrana limitante interna, que aparece como una capa delgada y transparente. Agite el plato con una agitación suave. Después de cinco minutos, vuelva a colocar la placa en la platina del microscopio y reemplace el agua con cuidado, evitando dañar la retina para ayudar a liberar la red de vasos del tejido retiniano adherido.

Lave la retina como se acaba de demostrar hasta que queden pocos o ningún residuo en el agua después del último lavado. Por lo general, la extirpación de todo el tejido no vascular es la parte más complicada del procedimiento. Las siguientes técnicas se pueden utilizar en secuencia o individualmente: Para facilitar el aislamiento de la red vascular, un consejo importante es sumergir todas las herramientas y la tripsina antes de manipular la retina.

Esto puede ayudar a evitar que un pañuelo se adhiera al equipo. Cubra una punta de micropipeta de 200 microlitros con la tripsina reservada y, a continuación, pipetee cuidadosamente el agua hacia arriba y hacia abajo, adyacente y soplando hacia los vasos de la retina, provocando una suave agitación. Si el tejido no vascular sigue siendo resistente al centro, una micropipeta recubierta de tripsina puntea en el nervio óptico y pipetea cuidadosamente toda la red de vasos hacia arriba y hacia abajo para ayudar a descomponer el tejido no vascular.

Finalmente, está bien. Las pinzas se pueden utilizar para levantar suavemente la vasculatura fuera del agua para desalojar cualquier componente no vascular de la adherencia. El resultado final debería ser una red de vasculatura retiniana intacta y libre de residuos.

Para visualizar la vasculatura, primero coloque una gota de agua en un portaobjetos limpio. A continuación, transfiera los recipientes digeridos al agua bajo una verificación de alcance. Si el soporte de la solapa del VA está plegado o desplegado, los recipientes plegados conducen a una mala visibilidad.

Cuando esté manchado, si el pañuelo está doblado, agregue agua adicional y agite suavemente el portaobjetos para facilitar el desdoblado. A continuación, utilice una micropipeta para eliminar lentamente el exceso de agua. El producto final de un procedimiento exitoso es un montaje plano de toda la red de la vasculatura de la retina del ratón con la arquitectura mantenida y teñida con hemat, toin y eoin.

Como se muestra aquí, como se ve en esta imagen, se puede observar una clara diferenciación entre las células endoteliales y los pericitos en la retina. Los núcleos de las células endoteliales, como lo indica la flecha blanca, son ovalados o alargados y se encuentran completamente dentro de la pared del vaso. Los núcleos del parásito se indican con la flecha negra son pequeños, densamente manchados esféricamente y generalmente tienen una posición protuberante a lo largo de la pared capilar.

La tripsina y la digestión es un procedimiento común utilizado para analizar la patología vascular en modelos animales diabéticos. Esta imagen muestra un ejemplo de degeneración capilar indicada por la flecha blanca observada en un ratón DB DB, un modelo para la diabetes tipo dos. Aunque este procedimiento se ha optimizado para retinas de ratón, también se pueden obtener resultados similares en retinas de rata.

Es importante tener en cuenta que las retinas de rata, como se muestra en estas imágenes, son más grandes que las retinas de ratón y requieren placas de 12 en lugar de 24. La red vasculatura de la retina de la rata también es menos frágil que la del ratón. Es extremadamente crucial extirpar la mayor cantidad posible de tejido no vascular.

Cualquier remanente dará lugar a una tinción inespecífica y a una mala visualización de la vasculatura. En esta imagen, por ejemplo, se puede observar una extirpación infructuosa de todo el tejido no vascular. Del mismo modo, también es importante que la retina esté desplegada durante el montaje para mejorar la visualización de la vasculatura.

Esta imagen muestra un despliegue fallido de la montura plana vascular. Después de dominar este procedimiento técnicamente difícil. Los viajes y las digestiones pueden ser un método extremadamente valioso que permite una visualización detallada de toda la red vascular.

Al mejorar esta técnica en el ojo del ratón, los investigadores pueden aprovechar los ratones manipulados genéticamente para estudiar varias vías que pueden tomar el control de la vasculatura de la retina y permitirnos comprender la fisiopatología de diversas enfermedades de la retina. Como resultado de esto, podemos mejorar nuestra comprensión de patologías patológicas como la retinopatía diabética. Mediante el estudio de modelos de ratones como el ratón DVDB, esto puede permitir en última instancia la oportunidad de encontrar nuevas intervenciones terapéuticas potenciales dirigidas a la vasculatura de la retina.