Name: Caracterización De Las Respuestas Inflamatorias Durante La Colonización Intranasal Con Streptococcus pneumoniae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Aprende a colonizar el nasofaringe murino con Streptococcus pneumoniae y extraer bacterias y células inmunes mediante lavados nasales. Este método permite cuantificar la carga bacteriana y analizar respuestas inflamatorias in vivo.

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Los autores desean agradecer al Dr. Jeffery Weiser de la Universidad de Pennsylvania por su regalo de las cepas clínicas de Streptococcus pneumoniae. Este trabajo fue financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud. CV fue financiado por una beca M. G. DeGroote y una beca de la Sociedad Torácica Canadiense. Este trabajo fue financiado por la Asociación de Pulmón de Ontario y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR). El trabajo en el laboratorio Bowdish es apoyado en parte por el Michael G. DeGroote Centre for Infectious Disease Research y el McMaster Immunology Research Centre.

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<li>van Rossum, A., Lysenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+and+bacterial+factors+contributing+to+the+clearance+of+colonisation+by+Streptococcus+pneumoniae+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Host and bacterial factors contributing to the clearance of colonisation by Streptococcus pneumoniae in a murine model.</a> Infect. Immun. 73, 7718-7726 (2005).</li>
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<li>Wu, H. Y., Virolainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+Streptococcus+pneumoniae+nasopharyngeal+colonization+model+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice.</a> Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).</li>
<li>Southam, D. S., Dolovich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+intranasal+instillations+in+mice%3A+effects+of+volume%2C+time%2C+body+position%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position.</a> Lung Physiol. 282, 833-839 (2002).</li>
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<li>Briles, D. E., Novak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+Colonization+with+Streptococcus+pneumoniae+includes+subpopulations+of+surface+and+invasive+pneumococci%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Nasal Colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci.</a> Infect. Immun. 73 (10), 6945-6951 (2005).</li>
<li>Wu, H. -Y., Virolainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+Streptococcus+pneumoniae+nasopharyngeal+colonization+model+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice.</a> Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).</li>
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<li>Briles, D. E., Novak, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+colonization+with+Streptococcus+pneumoniae+includes+subpopulations+of+surface+and+invasive+pneumococci%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Nasal colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci.</a> Infect. Immun. 73, 6945-6951 (2005).</li>
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<li>Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+contributions+against+invasive+Streptococcus+pneumoniae+pneumonia+of+antibody+and+Th17-Cell+responses+to+nasopharyngeal+colonisation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation.</a> PLoS One. 6 (10), (2011).</li>
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<li>Lanie, J. A., Ng, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+Avery%27s+virulent+serotype+2+strain+D39+of+Streptococcus+pneumoniae+and+comparison+with+that+of+unencapsulated+laboratory+strain+R6%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of Avery's virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6.</a> J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).</li>
<li>Robertson, G. T., Ng, W. L., Foley, J., Gilmour, R., Winkler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+transcriptional+analysis+of+clpP+mutations+of+type+2+Streptococcus+pneumoniae+and+their+effects+on+physiology+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Global transcriptional analysis of clpP mutations of type 2 Streptococcus pneumoniae and their effects on physiology and.</a> 184, 3508-3520 (2002).</li>
<li>Orihuela, C. J., Gao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+contributions+of+pneumococcal+virulence+factors+to+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis.</a> J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).</li>
<li>Orihuela, C. J., Gao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+models+of+Streptococcus+pneumoniae+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Infect.+D%22%5BJournal%5D)">Organ-specific models of Streptococcus pneumoniae disease.</a> Scand. J. Infect. D. 35, 647-652 (2003).</li>
<li>Swirski, F. K., Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+splenic+reservoir+monocytes+and+their+deployment+to+inflammatory+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites.</a> Science. 325, 612-616 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este estudio se presentaron métodos detallados para la colonización intranasal de ratones utilizando una cepa aislada clínica de Streptococcus pneumoniae y el posterior aislamiento y caracterización de las células inmunes reclutadas a la nasofaringe en respuesta a las bacterias. Demostramos cómo un inóculo bacteriano puede ser cultivado en medios ricos en nutrientes y utilizado para establecer un evento de colonización en ratones, que inicialmente se restringe a la nasofaringe. Luego mostramos cómo los tipos ...

<table><tbody><tr><td>Anti-Ratón Ly6C FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553104</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratón Ly6G PE</td><td>BD Pharmingen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratón CD45.1 eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0453-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratón F4/80 Antígeno APC</td><td>eBioscience</td><td>17-4801-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratón CD11c PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratón CD11b PE-Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratón CD3 Alexa Fluor 700</td><td>eBioscience</td><td>56-0032-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratón CD4 eFluor 605NC</td><td>eBioscience</td><td>93-0041-42</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Polietileno Intramedic - PE20</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 ml Jeringa</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>BD 26 G 3/8 Bisel intradérmico</td><td>Becton Dickinson</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>Tampón RLT Tampón de lisis</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar de soja tríptico</td><td>Becton Dickinson</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>Sangre de oveja desfibrinada</td><td>PML Microbiológicos</td><td>A0404</td><td></td></tr><tr><td>RNAacuoso-Micro Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>M-MuLV Transcriptasa inversa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0253L</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6001</td><td></td></tr></tbody></table>

caracterización de las respuestas inflamatorias durante la colonización intranasal con streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

La colonización nasofaríngea por Streptococcus pneumoniae es un requisito previo para la invasión a los pulmones o al torrente sanguíneo1. Este organismo es capaz de colonizar la superficie mucosa de la nasofaringe, donde puede residir, multiplicarse y eventualmente superar las defensas del huésped para invadir a otros tejidos del huésped. El establecimiento de una infección en las vías respiratorias normalmente más bajas da lugar a pulmonía. Alternativamente, las bacterias pueden diseminarse en el torrente sanguíneo causando bacteriemia, que se asocia con altas tasas de mortalidad2,o bien conducir directamente al desarrollo de meningitis neumocócica. La comprensión de la cinética de, y las respuestas inmunes a, colonización nasofaríngea es un aspecto importante de los modelos de la infección de los pneumoniae del S.
Nuestro modelo murino de colonización intranasal está adaptado de los modelos humanos3 y ha sido utilizado por múltiples grupos de investigación en el estudio de las respuestas huésped-patógeno en la nasofaringe4-7. En la primera parte del modelo, utilizamos un aislado clínico de S. pneumoniae para establecer una colonización bacteriana autolimitada que es similar a los eventos de transporte en adultos humanos. El procedimiento detallado aquí implica la preparación de un inóculo bacteriano, seguido por el establecimiento de un evento de colonización con la entrega del inóculo vía una ruta intranasal de la administración. Los macrófagos residentes son el tipo de célula predominante en la nasofaringe durante el estado estacionario. Típicamente, hay pocos linfocitos presentes en ratones no infectados8,sin embargo, la colonización de la mucosa conducirá a una inflamación de bajo a alto grado (dependiendo de la virulencia de la especie bacteriana y la cepa) que resultará en una respuesta inmune y el posterior reclutamiento de células inmunes del huésped. Estas células pueden ser aisladas por un lavado del contenido traqueal a través de las narinas, y correlacionadas con la densidad de las bacterias de colonización para comprender mejor la cinética de la infección.

La figura 1 representa un esquema general que resume los pasos principales del protocolo. Las figuras 2-3 proporcionan una visualización de la metodología microbiológica inherente a los protocolos aquí descritos. La Figura 4 representa el posicionamiento adecuado de un ratón para realizar una colonización intranasal, mientras que la Figura 5 representa típicamente los cambios en el peso de los ratones colonizados con S. pneumoniae cepa P1547. <s...

La colonización del nasopharynx murine con pneumoniae del estreptococo y la extracción subsecuente de células adherentes o reclutadas se describe. Esta técnica consiste en enjuagar la nasofaringe y la recolección del líquido a través de las narinas y es adaptable para varias lecturas, incluyendo la cuantificación celular diferencial y el análisis de la expresión de ARNm in situ.

Caracterización De Las Respuestas Inflamatorias Durante La Colonización Intranasal Con Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Este procedimiento implica la colonización del nasofaringe murino con Streptococcus pneumoniae y la posterior extracción de bacterias colonizadoras, así como de células adheridas o reclutadas. Esto se logra primero preparando un inóculo bacteriano de la cepa de S. pneumoniae de interés.A continuación, se administra la bacteria viva por vía intranasal a ratones anestesiados mientras se encuentran en un aparato de sujeción. Después del tiempo deseado de colonización, los ratones se sacrifican y se realizan lavados nasales mediante la canulación de sus tráqueas expuestas y el lavado del contenido a través de la nariz. La cantidad de bacterias presente en los lavados nasales puede cuantificarse utilizando técnicas microbiológicas. Alternativamente, las respuestas inmunitarias pueden evaluarse mediante técnicas de citometría de flujo para determinar el fenotipo de las células reclutadas o mediante técnicas de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR).Para medir los niveles de ARNm expresado de interés antes de comenzar, deberá preparar sujetadores para ratones para la parte de colonización intranasal del procedimiento y agujas canuladas para los lavados nasales. Un sujetad

characterization-inflammatory-responses-during-intranasal

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video demuestra el establecimiento de una infección pulmonar en un modelo de roedor inmunocompetente a través de la intubación y la instalación de suspensiones bacterianas en los lóbulos pulmonares. Este modelo permite realizar estudios de eficacia antibacteriana en animales inmunocompetentes.

Instilación intrabronquial de Streptococcus pneumoniae en modelos de roedores inmunocompetentes

Transporte Experimental neumocócica humanos ofrece un modelo natural de carro y un modelo potencial para su uso en el desarrollo de vacunas. Esta técnica es valiosa aún complejo y conlleva un riesgo clínico mediante la introducción de un agente patógeno en un ser humano. Hemos desarrollado un protocolo detallado.

Carriage Experimental neumocócica Humanos

Streptococcus pneumoniae es el patógeno que lleva causando neumonía adquirida en la comunidad grave y responsable de más de 2 millones de muertes en todo el mundo. El impacto de los factores bacterianos implicados en la aptitud o la virulencia se puede controlar en tiempo real en una neumonía o bacteriemia modelo agudo ratón utilizando bacterias bioluminiscentes.

Siguiendo en tiempo real el impacto de factores de virulencia neumocócica en un ratón de neumonía aguda modelo utilizando bacterias bioluminiscentes

La respuesta inmune del huésped a la infección por patógenos es un proceso estrechamente regulado. Utilizando un modelo de exposición de pulmón lipopolisacárido en los ratones, es posible llevar a cabo las evaluaciones de alta resolución de los complejos mecanismos asociados con la patogénesis de la enfermedad.

La utilización de la orofaringe Intratraqueal PAMP Administración y lavado broncoalveolar para evaluar el anfitrión respuesta inmune en ratones

Streptococcus pneumoniae forma lesiones microscópicas discretas no purulentas en el corazón. Se describe el protocolo para un modelo murino de formación de microlesiones cardíacas. Se proporciona instrucción sobre la visualización de microlesiones mediante microscopía, la discriminación entre microlesiones tempranas y tardías, y los métodos para detectar la remodelación cardíaca en el corazón de los animales convalecientes.

Visualización de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Dentro cardíacos microlesiones y la remodelación cardiaca posterior

Mientras que el estudio in vitro de las interacciones huésped-patógeno permite la caracterización de respuestas inmunes específicas, se requieren modelos in vivo para observar los efectos de respuestas complejas. Utilizando la exposición a Candida albicans seguida de una infección pulmonar mediada por Pseudomonas aeruginosa, establecimos un modelo murino de interacciones microbianas implicadas en la patogenicidad de la neumonía asociada a la ventilación.

El estudio de las comunidades microbianas<em&gt; En Vivo</em&gt;: Un Modelo de anfitrión mediada por la interacción entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; Y<em&gt; Pseudomonas Aeruginosa</em&gt; En las vías respiratorias

Demostramos el procedimiento para la inoculación intratraqueal de Haemophilus influenzae en las vías respiratorias inferiores de ratones. Se trata de una herramienta muy útil para estudiar las vías de señalización que regulan la inflamación de las vías respiratorias en modelos de ratón.

Administración intra-traqueal de<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; En modelos de ratón para estudiar las vías respiratorias inflamación

Varios métodos han sido descritos en la literatura para el modelado de la neumonía bacteriana en ratones. En este documento, se describe un método no invasivo, de bajo costo, rápida para inducir neumonía a través de aspiración (es decir, inhalación) de un inóculo bacteriano pipeteó en la orofaringe. métodos aguas abajo para la evaluación de la respuesta inmune innata pulmonar también se detallan.

Un método no invasivo y técnicamente no intensivos para la inducción y Fenotipificación Experimental de neumonía bacteriana en ratones

Haemophilus influenzae induce inflamación en el tracto respiratorio. Este artículo se centrará en el uso de la citometría de flujo y la microscopía confocal para definir las respuestas inmunes de fagocitos y linfocitos en respuesta a esta bacteria.

Evaluación de las respuestas inmunitarias respiratorias a Haemophilus influenzae

Este manuscrito describe el establecimiento de un modelo infeccioso de neumonía en ratones y la respectiva caracterización de la resolución de lesiones junto con métodos para el crecimiento de bacterias y la instilación intratraqueal. También se describe un enfoque novedoso que utiliza citometría de flujo de alta dimensión para evaluar el panorama inmunitario.

Modelo experimental para evaluar la resolución de la neumonía

Este artículo describe un nuevo modelo de ratón para la transición del neumococo de un colonizador asintomático a un patógeno causante de enfermedades durante la infección viral. Este modelo se puede adaptar fácilmente para estudiar las interacciones polimicrobianas y huésped-patógeno durante las diferentes fases de la progresión de la enfermedad y entre varios huéspedes.

Un modelo de ratón para la transición de Streptococcus pneumoniae de colonizador a patógeno tras la coinfección viral recapitula la enfermedad exacerbada por la edad

Aprende a colonizar el nasofaringe murino con Streptococcus pneumoniae y extraer bacterias y células inmunes mediante lavados nasales. Este método permite cuantificar la carga bacteriana y analizar respuestas inflamatorias in vivo.

Caracterización De Las Respuestas Inflamatorias Durante La Colonización Intranasal Con Streptococcus pneumoniae

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