Caracterización De Las Respuestas Inflamatorias Durante La Colonización Intranasal Con Streptococcus pneumoniae

Este procedimiento implica la colonización del nasofaringe murino con Streptococcus pneumoniae y la posterior extracción de bacterias colonizadoras, así como de células adheridas o reclutadas. Esto se logra primero preparando un inóculo bacteriano de la cepa de S. pneumoniae de interés.

A continuación, se administra la bacteria viva por vía intranasal a ratones anestesiados mientras se encuentran en un aparato de sujeción. Después del tiempo deseado de colonización, los ratones se sacrifican y se realizan lavados nasales mediante la canulación de sus tráqueas expuestas y el lavado del contenido a través de la nariz. La cantidad de bacterias presente en los lavados nasales puede cuantificarse utilizando técnicas microbiológicas. Alternativamente, las respuestas inmunitarias pueden evaluarse mediante técnicas de citometría de flujo para determinar el fenotipo de las células reclutadas o mediante técnicas de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR).

Para medir los niveles de ARNm expresado de interés antes de comenzar, deberá preparar sujetadores para ratones para la parte de colonización intranasal del procedimiento y agujas canuladas para los lavados nasales. Un sujetador para ratones puede prepararse simplemente cortando la punta cónica de un tubo cónico de 50 mililitros. Una vez que haya creado la abertura, asegúrese de usar tijeras para suavizar cualquier extremo afilado.

Para la preparación de agujas canuladas, necesitará el siguiente tubo de polietileno PE 20 con un diámetro interno de 0,38 milímetros. Una jeringa de un mililitro está provista de agujas biseladas de calibre 26 y tres octavos, un par de tijeras iris finas y afiladas, y un par de pinzas. Corte el tubo PE 20 con las tijeras finas en trozos de aproximadamente 2,5 centímetros o una pulgada de longitud, asegurándose de que cada extremo tenga una punta biselada.

Con las pinzas, deslice cuidadosamente uno de estos fragmentos sobre la punta de su aguja. Las agujas canuladas, evitando perforar el lado del tubo, pueden guardarse en etanol al 70 % hasta su uso y deben enjuagarse con PBS inmediatamente antes de usar. Para la colonización intranasal de ratones con S. pmo, recomendamos utilizar una concentración de 10 a la novena unidades formadoras de colonias por mililitro, administradas en 10 microlitros.

Para una dosis final de 10 a la siete UFC, mantenga el inóculo sobre hielo hasta justo antes de su uso y asegúrese de agitarlo entre cada colonización. Además del inóculo, también necesitará una pipeta P 10 o P 20, puntas de pipeta esterilizadas y su sujetador de ratón. Aísle un ratón individual por la cola y sujételo colocándolo en el aparato sujetador de ratón previamente preparado.

Si tiene dificultades para guiar al ratón hacia el sujetador, puede ser útil colocarlo delante y encima del animal, permitiendo que este suba por sí mismo. Una vez que el ratón esté dentro del sujetador, fíjelo por la base de su cuerpo empujándolo suavemente hacia arriba, de modo que su nariz sobresalga por el extremo estrecho del sujetador. Utilizando una pipeta P 10 o P 20, inocule a cada ratón depositando 10 microlitros de la cultura preparada, distribuyéndolos uniformemente entre ambas fosas nasales.

Permita que el inóculo gotee dentro de la nariz pulsando gradualmente la inoculación, tomando el tiempo necesario para que el ratón inhale el inóculo. Es posible que el ratón estornude y expulse parte del inóculo por la nariz, lo cual es esperado. Tenga en cuenta que los ratones deben estar anestesiados durante este procedimiento para asegurar que las bacterias permanezcan localizadas en la nasofaringe y no se diseminen al tracto respiratorio inferior.

Para los fines de esta demostración, estamos inoculando con PBS, pero cada vez que se trabaje con bacterias vivas, asegúrese de realizar el procedimiento de acuerdo con las directrices aprobadas por el instituto. Por ejemplo, la mayoría de los institutos exigirán que la colonización se realice dentro de una cabina de seguridad biológica de nivel dos. Si utiliza indicadores de peso como parte de su método de monitoreo del punto final, después de la colonización, monitoree los ratones cada 12 a 24 horas en busca de síntomas clínicos, incluyendo letargo, pelaje erizado y pérdida de peso.

Una vez que los ratones están colonizados, manténgalos durante el tiempo deseado. Al final de este período, los ratones serán sacrificados y se realizará una lavado nasal, ya que la dislocación cervical puede dañar potencialmente la tráquea. Este método de eutanasia debe evitarse.

Antes de realizar lavados nasales, asegúrese de tener a mano lo siguiente: agujas canuladas previamente preparadas, etanol acuoso al 70 %, un par de pinzas, un par de tijeras finas de iris afiladas, solución salina tamponada con fosfato, tampón de lisis de ARN y tubos de un mililitro. Una vez que esté listo para comenzar, coloque al animal plano sobre su espalda y, utilizando etanol acuoso al 70 %, esterilice la parte frontal de su pelaje, particularmente la zona del cuello.

Teniendo cuidado de evitar que el etanol acceda a las fosas nasales. Realice un único corte longitudinal a lo largo de la línea media del cuello del animal, lo que le permitirá crear una abertura para visualizar la tráquea. Retire cuidadosamente la piel hacia ambos lados, exponiendo el tejido del cuello que se encuentra debajo.

En este momento, la tráquea debe ser visible, rodeada por músculos longitudinales a ambos lados. Corte cuidadosamente estos músculos para obtener una vista clara de la tráquea misma, teniendo cuidado de no seccionar la vasculatura circundante. En caso de que accidentalmente corte la vasculatura y haya sangre presente en la zona antes de continuar.

Deje que deje de sangrar y luego limpie el área varias veces dispensando PBS estéril y utilizando gasa estéril para absorber suavemente la humedad excesiva. Una vez que la tráquea esté adecuadamente expuesta, realice un corte semilunar transversal en la tráquea aproximadamente a la mitad de su altura. Coloque PBS estéril en una jeringa canulada.

Introduzca la cánula en la tráquea hacia la nariz, manteniendo el borde biselado orientado hacia abajo para facilitar la inserción. Una vez que la cánula esté en su lugar, gírela 180 grados y explore suavemente hacia arriba hasta sentir una ligera resistencia. Coloque el tubo DPH EEND designado para la recolección de muestras justo debajo de la nariz del ratón.

Compruebe la colocación correcta de la cánula dispensando una cantidad mínima de líquido de lavado de PBS. A continuación, si la cánula está colocada correctamente, debe formarse una gota de líquido alrededor de la abertura nasal del ratón. Si el PBS de prueba sale directamente por la boca del animal, retire ligeramente la cánula y colóquela nuevamente avanzando suavemente hasta sentir una resistencia muy leve.

Tenga cuidado de no avanzar demasiado la cánula más allá de esta resistencia, ya que podría desplazarla más allá del paladar nasal y hacia la cavidad oral. Una vez que confirme que la cánula está correctamente posicionada, proceda a dispensar rápidamente 200 microlitros de PBS para ayudar a desplazar y recolectar la máxima cantidad de células. El contenido debe salir a través de las fosas nasales del ratón y dirigirse al tubo de recolección.

Coloque la muestra inmediatamente en hielo. Estas muestras pueden analizarse posteriormente para determinar la carga bacteriana, así como el reclutamiento celular. Para recoger muestras para el análisis de ARN, utilice una aguja canulada separada que contenga 500 microlitros de tampón de lisis de ARN y realice una lavado nasal secundario.

Tenga en cuenta que el tampón de lisis de ARN eliminará el epitelio y destruirá los tejidos circundantes. Por lo tanto, debe tenerse cuidado para evitar el contacto con órganos como los pulmones. Si se desea retener estos tejidos para cuantificar la carga bacteriana nasofaríngea, necesitará lo siguiente.

Tubos Epicor, placas microbiológicas que contienen tripticasa de soya con huevo, suplementadas con 5% de sangre de oveja. Un mezclador de vórtice, puntas de pipeta estériles para PBS y pipetas P20 y P200. Primero, trabajando en una cabina de nivel de seguridad biológica dos, prepare una serie de diluciones seriadas para cada muestra de lavado nasal de mirin.

En general, se espera que las concentraciones de S pneumoniae en la nasofaringe estén entre cero y 10 a la cuatro UFC. Por lo tanto, realice tres diluciones seriadas diez veces, agregue 10 microlitros de la muestra directa de lavado nasal al primer tubo hasta una concentración de 10 a la menos uno UFC por mil y continúe descendiendo hasta que haya diluido tres muestras, agitando vigorosamente entre cada dilución. Tenga en cuenta que este video es solo con fines demostrativos.

Siempre se debe seguir la técnica adecuada de laboratorio, incluyendo el cambio de puntas de pipeta entre diluciones. Utilizando un rotulador, divida lógicamente la placa en cuadrantes y etiquete los cuadrantes con la dilución correspondiente que se va a sembrar en cada uno. Inocule tres gotas de 10 microlitros de cada una de sus diluciones sobre la placa de agar. Deje secar durante 15 a 30 minutos al aire libre, luego tape las placas y colóquelas boca abajo en una incubadora bacteriana con condiciones óptimas para el crecimiento de neumococos, típicamente 37 grados Celsius y 5 %CO2.

Incube estas placas durante 24 a 48 horas. Después de este período, retire las placas y determine el número de bacterias colonizantes promediando las colonias formadas en la placa. Para cada dilución, las colonias de animo pueden identificarse por su color beige distintivo y sus zonas de hemólisis alfa, que son halos pequeños alrededor de cada colonia, creados por la digestión bacteriana del suplemento de sangre en el agar.

Y finalmente, por pequeñas depresiones en el centro de cada colonia que le dan la apariencia de un eritrocito. Tras ver este video, debería tener una comprensión sólida de cómo establecer una colonización nasofaríngea por S. pneumoniae en un ratón, cómo aislar bacterias y células de la nasofaringe de un ratón tras la colonización, mediante una lavado nasal, y cómo cuantificar la carga bacteriana correspondiente utilizando técnicas microbiológicas. Esperamos que los métodos descritos en este video lo animen a utilizar un modelo de colonización intranasal para estudiar las respuestas del huésped frente a patógenos en el contexto de esta región poco estudiada.