Caracterización De Las Respuestas Inflamatorias Durante La Colonización Intranasal Con Streptococcus pneumoniae

Este procedimiento implica la colonización de la nasofaringe murna con neumonía por estreptococo y la posterior extracción de bacterias colonizadoras, así como de células adherentes o reclutadas. Esto se logra preparando primero un inóculo bacteriano de la neumonía S. Cepa de interés.

Luego, las bacterias vivas se administran por vía intranasal a ratones anestesiados mientras están en un aparato de restricción. Después de la duración deseada de la colonización, los ratones son sacrificados y se realizan lavados nasales canulando sus tráqueas expuestas y enjuagando el contenido a través del nas. El número de bacterias presentes en los lavados nasales se puede cuantificar mediante técnicas microbiológicas. Alternativamente, las respuestas inmunitarias se pueden analizar utilizando técnicas de citometría de flujo para fenotipar las células reclutadas o técnicas de PCR cuantitativa.

Para medir los niveles de ARNm expresados de interés antes de comenzar, deberá preparar retenedores de ratón para la parte de colonización intranasal del procedimiento y agujas canuladas para los lavados nasales. Un retenedor de ratón se puede preparar simplemente cortando la punta cónica de un tubo de halcón de 50 mililitros. Una vez que hayas creado la apertura, asegúrate de usar unas tijeras para pulir los extremos afilados.

Para la preparación de agujas canuladas, necesitará el siguiente tubo de polietileno PE 20 con un diámetro interior de 0,38 milímetros. Una jeringa de mil está tapada con 26 agujas biseladas y tres de calibre ocho, un par de iris afilados y finos, tijeras y un par de pinzas. Corta el tubo de PE 20 con las tijeras finas en pedazos de aproximadamente 2,5 centímetros o una pulgada de largo, asegurándote de que cada extremo tenga una punta biselada.

Con las pinzas, deslice con cuidado una de estas piezas en la punta de la aguja. Evitando perforar el lado del tubo, las agujas canuladas pueden mantenerse en etanol al 70% hasta que se necesiten y enjuagarse con PBS directamente antes de su uso. Para la colonización intranasal de ratones con S pmo, recomendamos utilizar una concentración de 10 a las nueve unidades formadoras de colonias por mil, administradas en 10 microlitros.

Para una dosis final de 10 a las siete UFC, mantenga el inóculo en hielo hasta justo antes de usarlo y asegúrese de agitar entre cada colonización. Además del inóculo, también necesitará una pipeta P 10 o P 20 con puntas de pipeta esterilizadas y su protector de ratón. Aísle a un ratón individual por la cola y sujételo colocándolo en su aparato de restricción de ratones previamente preparado.

Si tiene problemas para dirigir al ratón hacia el sujetador, puede ser útil colocarlo delante y por encima del ratón, permitiendo que el animal se arrastre hacia arriba. Una vez que el ratón esté dentro del sujetador, asegúrelo por la base de su cuerpo empujándolo suavemente hacia arriba para que su nariz salga del extremo cónico del restricción. Con una pipeta P 10 o P 20 inocular a cada ratón depositando 10 microlitros del cultivo preparado, distribuyéndolo uniformemente entre ambos. Nares.

Deje que el inóculo gotee en la nariz pulsando la inoculación gradualmente, tomando el tiempo necesario para que el ratón inhale el inóculo. El ratón puede estornudar parte del inóculo por la nariz, lo cual es de esperar. Tenga en cuenta que los ratones deben ser anestesiados para este procedimiento para garantizar que las bacterias permanezcan localizadas en la nasofaringe y no se propaguen al tracto respiratorio inferior.

A los efectos de esta demostración, estamos inoculando con PBS, pero siempre que trabaje con bacterias vivas, asegúrese de realizar el procedimiento de acuerdo con las pautas aprobadas por el instituto. Por ejemplo, la mayoría de las instituciones requerirán que la colonización se lleve a cabo en un nivel de bioseguridad dos. Si utiliza indicadores de peso como parte de su forma de monitoreo de puntos finales, MA inmediatamente después de la colonización, monitoree a los ratones cada 12 a 24 horas para detectar síntomas clínicos que incluyen letargo, pelaje erizado y pérdida de peso.

Una vez que los ratones estén colonizados, manténgalos durante el tiempo deseado. Al final de este período, los ratones serán sacrificados y se realizará un lavado nasal, ya que la luxación cervical puede dañar la tráquea. Este método de eutanasia debe evitarse.

Antes de realizar lavados nasales, asegúrese de tener a mano lo siguiente. Agujas canuladas previamente preparadas, etanol acuoso al 70%, un par de pinzas, un par de tijeras de iris finas y afiladas, fosfato, solución salina tamponada, tampón de lisis de ARN y tubos de un milésimo de pulgada. Una vez que esté listo para comenzar, coloque al animal boca arriba y, con etanol acuoso al 70%, esterilice la parte delantera de su pelaje, particularmente el área del cuello.

Teniendo cuidado de evitar que el etanol acceda a las fosas nasales. Haz un solo corte longitudinal a lo largo de la línea media del cuello del animal, permitiéndote crear una abertura para visualizar la tráquea. Retire con cuidado la piel hacia atrás a ambos lados, revelando el tejido del cuello que se encuentra debajo.

En este punto, la tráquea debe ser visible rodeada de músculos longitudinales a ambos lados. Córtelos con cuidado para proporcionar una vista clara de la tráquea misma, teniendo cuidado de no cortar la vasculatura circundante. En el caso de que corte accidentalmente la vasculatura y la sangre esté presente en la región antes de continuar.

Deje que el sangrado se detenga y luego limpie el área varias veces dispensando PBS estéril y usando gasa estéril para absorber suavemente el exceso de humedad. Una vez que la tráquea esté correctamente expuesta, haga un corte semilunar transversal en la tráquea aproximadamente a la mitad. Coloque PBS estéril en una jeringa canulada.

Inserte la cánula en la tráquea hacia la nariz, manteniendo el borde biselado apuntando hacia abajo para facilitar la inserción. Una vez que la cánula esté en su lugar, gírela a 180 grados y pruebe suavemente hacia arriba hasta que sienta una ligera resistencia. Coloque el tubo EEND DPH designado para la recolección de muestras justo debajo de la nariz del ratón.

Pruebe la colocación correcta de la cánula dispensando una cantidad mínima de líquido de lavado PBS. Después de esto, se formará una gota de líquido alrededor del NAS del ratón si la cánula se coloca correctamente. Si el PBS de prueba emerge directamente de la boca del animal, tire de la cánula hacia atrás y vuelva a colocarla sondeando suavemente hacia adelante hasta que sienta una resistencia muy leve.

Tenga cuidado de no empujar la cánula demasiado más allá de esta resistencia, ya que la moverá más allá del paladar nasal y a través de la cavidad oral. Una vez que confirme que la cánula está correctamente colocada, proceda a dispensar 200 microlitros de PBS rápidamente para ayudar a desplazar y recolectar la máxima cantidad de células. El contenido debe fluir a través de las narinas del ratón y hacia el tubo de recolección.

Coloque la muestra inmediatamente en hielo. Estas muestras pueden analizarse posteriormente para determinar la carga bacteriana y el reclutamiento celular. Para recolectar muestras para el análisis de ARN, use una aguja canulada separada que contenga 500 microlitros de tampón de lisis de ARN para realizar un lavado nasal secundario.

Tenga en cuenta que el tampón de lisis de ARN desnudará el epitelio y destruirá el tejido circundante. Por lo tanto, se debe tener cuidado de evitar el contacto con órganos como los pulmones. Si se desea retener estos tejidos para cuantificar la carga bacteriana nasofaríngea, necesitará lo siguiente.

Los tubos Epicor, placas microbiológicas que contienen tríptico de huevo de soja se complementan con un 5% de sangre de oveja. Un mezclador de vórtice, puntas de pipeta estériles PBS y pipetas P 20 y P 200. Primero trabajando en una campana BSL de dos campanas, prepare una serie de diluciones en serie para cada muestra de lavado nasal mirin.

En general, se puede esperar que las concentraciones de S. pneumoniae en la nasofaringe estén entre cero y 10 por las cuatro UFC. Por lo tanto, realice tres diluciones en serie de diez veces, agregue 10 microlitros de la muestra de lavado nasal limpia al primer tubo a una concentración de 10 por menos una UFC por mil, y continúe hacia abajo hasta que haya diluido tres muestras en un vórtice excesivo entre cada dilución. Tenga en cuenta que este video es solo para fines demostrativos.

Siempre se debe seguir la técnica de laboratorio adecuada, incluido el cambio de las puntas de pipeta entre diluidos. Con un rotulador, divídalo de nuevo a su placa lógica en cuadrantes y etiquete los cuadrantes con la dilución correspondiente que se colocará en él. Coloque tres gotas de muestras de 10 microlitros de cada una de sus diluciones en la placa de agar. Deje que se sequen durante 15 a 30 minutos sin tapar, luego cubra las placas y colóquelas boca abajo en una incubadora bacteriana con condiciones óptimas para el crecimiento neumocócico, generalmente 37 grados Celsius y 5% de CO2.

Incube estas placas durante 24 a 48 horas. Después de este período de tiempo, retire las placas y determine el número de bacterias colonizadoras promediando las colonias formadas en la placa. Para cada dilución, las colonias de animo se pueden identificar por su distintivo color beige, sus zonas de hemólisis alfa, que son pequeños halos alrededor de cada colonia, creados por la digestión bacteriana del suplemento sanguíneo en el agar.

Y por último, por pequeñas depresiones en el centro de cada colonia que le dan la apariencia de un eritrocito. Después de ver este video, debe tener una comprensión sólida de cómo establecer una PMO nasofaríngea, la colonización en un ratón, cómo aislar bacterias y células de la nasofaringe de un ratón después de la colonización, utilizando un lavado nasal y cómo cuantificar la carga bacteriana correspondiente mediante técnicas microbiológicas. Esperamos que los métodos descritos en este vídeo le animen a utilizar un modelo intranasal de colonización para estudiar las respuestas del huésped a los patógenos en el contexto de esta región poco estudiada.