Determinación de los ácidos grasos tolerables y Concentraciones toxina del cólera El uso de células epiteliales intestinales humanas y de ratón BALB / c Macrófagos

El objetivo general de este procedimiento es determinar las concentraciones tolerables de ácidos grasos y de toxina del cólera que no influyan negativamente en la supervivencia celular. Esto se logra primero cultivando el tipo adecuado de células. El segundo paso consiste en incubar las células con distintas concentraciones de los tres ácidos grasos que se van a probar o con la toxina del cólera.

Después de 24 horas, se evalúa la supervivencia celular mediante un ensayo de MTT. En última instancia, los datos de espectrometría del ensayo de MTT muestran las concentraciones óptimas de ácidos grasos y toxina del cólera con las que se pueden tratar las células sin una reducción significativa en la supervivencia. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la prevención de las infecciones por cólera, ya que las vacunaciones no siempre son exitosas.

Se utilizarán macrófagos de Mus musculus procedentes de ratones C57BL/6 para todas las determinaciones de co toxina y para la determinación a mayor escala de la concentración de ácidos grasos. Las células se cultivan en uno de los dos medios siguientes: DMEM con L-glutamina, suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de antibiótico-antimicótico, o medio base RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal, 5% de L-glutamina y 1% de antibiótico-antimicótico. Para este protocolo, crezca las células C57BL/6 en matraces Corning de 75 centímetros cuadrados con tapas ventiladas a 37 grados Celsius, 95% de aire y 5% de dióxido de carbono. Para la determinación de concentración de ácidos grasos a pequeña escala, utilice células epiteliales intestinales humanas cultivadas en matraces Corning de 75 centímetros cuadrados con tapas ventiladas en medio HyperCRO, suplementado con 10% de suero humano AB (FBS) y 30 nanogramos por mililitro.

El EGF humano no utiliza reactivos antibióticos antimicóticos según las instrucciones del fabricante; incubar a 37 grados Celsius, 95 % de aire y 5 % de dióxido de carbono. Pase a subcultivo todas las células de uno a tres cuando alcancen aproximadamente un 70 % de confluencia, dependiendo del tipo de células. Por lo general, se realiza el subcultivo cada dos a cinco días antes del tratamiento con ácidos grasos. Prepare primero los ácidos grasos: transfiera los ácidos oleico, linoleico y linolénico desde los ampollas de vidrio proporcionadas por la empresa a viales de vidrio esterilizados. A continuación, transfiera cada ácido graso a un tubo de einor esterilizado separado.

Disuelva cada ácido graso en etanol al 100 % en una dilución de uno a seis, seguido de la adición de RPMI 1640. Medios incompletos hasta una concentración final de 10 microgramos por microlitro. Agite cada solución mediante vortex y transfiéralas a viales de vidrio para su almacenamiento en la placa del congelador a menos 20 grados Celsius.

Células epiteliales intestinales humanas a 2.500 células por pocillo en placas de cultivo tisular de 96 pocillos; añadir el medio completo apropiado para llevar el volumen total de cada pocillo a 200 microlitros. Incubar las células a 37 grados Celsius, 95 % de aire y 5 % de dióxido de carbono durante 24 horas.

Después del período de proliferación de 24 horas, retire el medio. Añada las concentraciones adecuadas de cada ácido graso que se va a probar en los pocillos como control positivo. Incube las células con medio completo como control negativo e incube las células con etanol al 70%.

A continuación, agregue medio completo para llevar el volumen total de cada pocillo a 200 microlitros. Incube las placas tratadas durante 24 horas antes de comenzar el ensayo de MTT para preparar la toxina del cólera para los tratamientos celulares. Disuelva la toxina del cólera en PBS a una concentración de un miligramo por mililitro.

Aliquotar la solución en viales criogénicos y almacenar a dos a ocho grados Celsius antes de los tratamientos celulares. Diluir la toxina uno a cien en PBS esterilizado o DMEM incompleto para obtener una concentración de trabajo final de un nanogramo por microlitro por placa. Macrófagos a 2.500 células por pocillo en 96.

Incubar placas de cultivo celular a 37 grados Celsius, 95 % aire y 5 % dióxido de carbono durante 24 horas. Después del período de proliferación de 24 horas, retirar el medio y añadir las concentraciones de prueba apropiadas de toxina del cólera a los pocillos. De forma similar a los tratamientos con ácidos grasos, incubar las células con medio completo como control positivo y etanol al 70 % como control negativo para todas las muestras y tratamientos.

Utilice un mínimo de tres réplicas, con más repeticiones para los controles positivos. Añada medio completo para llevar el volumen total de cada pocillo a 200 microlitros. Incube las placas tratadas con toxina del cólera durante 24 horas antes de comenzar el ensayo de MTT.

24 horas después de que las células hayan sido tratadas con ácidos grasos o colorante, la viabilidad celular se determina mediante el ensayo de MTT. Retire la solución de cada pocillo de la placa de 96 pocillos que se va a probar y sustitúyala por 200 microlitros de una solución fresca de medio completo.

Añada 10 microlitros de una solución de MTT recién preparada al 2,5 miligramos por mililitro a cada uno. Incube la placa a 37 grados Celsius durante tres a cuatro horas. Tras tres a cuatro horas, deseche la solución del medio y añada 100 microlitros de ácido clorhídrico 0,04 molar en isopropanol a cada uno.

Incube bien la placa a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, transfiera la solución de cada pocillo a un tubo de centrífuga y centrifugue a 20.000 ×g durante un minuto o hasta que se forme un precipitado. Transfiera entre 20 y 40 microlitros de cada muestra a un lector de microplacas y mida la absorbancia a 570 nanómetros utilizando un espectrofotómetro.

Esta figura muestra la supervivencia de la mayoría de los macrófagos representada como una función del control positivo para tratamientos con concentraciones crecientes de ácido oleico, ácido linoleico y ácidos linoleicos. Es evidente que las células no toleran concentraciones superiores a 100 nanogramos por microlitro para ninguno de los ácidos grasos. El experimento se repitió utilizando células epiteliales humanas con concentraciones inferiores a 100 nanogramos por microlitro en incrementos de 10 nanogramos por microlitro, hasta 70 nanogramos por microlitro.

Este gráfico muestra la supervivencia celular para cada concentración de ácido oleico. Un análisis de Inova indicó que una o más de las medias eran estadísticamente diferentes. Sin embargo, solo los tratamientos con concentraciones más altas produjeron medias estadísticamente diferentes a la del control positivo.

Curiosamente, las diferencias observadas se debieron a un aumento en la viabilidad celular con mayor variabilidad. Se obtuvieron resultados similares para los ácidos linoleico y linoleico. Una manera.

Inova indicó que ninguna de las medias de tratamiento fue estadísticamente diferente de la media del control positivo, pero la variabilidad parece aumentar en algunas de las concentraciones más altas, como 60 nanogramos por microlitro de ácido linoleico o ácido linoleico a partir de estos resultados. Las concentraciones óptimas de ácidos grasos al utilizar células epiteliales intestinales humanas parecen estar entre uno y cinco nanogramos por microlitro. También se evaluaron los efectos de concentraciones variables de toxina collar sobre la supervivencia de la mayoría de los macrófagos, con tratamientos a niveles de toxina en incrementos relativamente grandes.

Se observó una tendencia decreciente en la viabilidad celular, tal como se esperaba, ya que la viabilidad celular varió considerablemente para cada tratamiento. La gran variabilidad en la viabilidad resultó en ninguna diferencia significativa entre la media del control positivo y cualquiera de los tratamientos, lo que llevó a realizar más pruebas con niveles de toxina de 100 nanogramos o menores. Este gráfico muestra la viabilidad celular para los tratamientos con niveles más bajos de toxina.

La viabilidad celular es altamente variable para casi todas las concentraciones de toxina, aunque se observaron ligeros aumentos en la viabilidad como resultado de los tratamientos. Estos aumentos no son estadísticamente significativos para ninguno de los tratamientos en comparación con la media del control positivo. Con base en estos resultados.

La concentración recomendada de la toxina del color es inferior a 30 nanogramos por tratamiento al utilizar macrófagos de ratón de intestino C después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación del color exploraran si los ácidos grasos podrían potenciar la inmunidad contra la infección por vio colérico.