Name: Determinación de los ácidos grasos tolerables y Concentraciones toxina del cólera El uso de células epiteliales intestinales humanas y de ratón BALB / c Macrófagos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprende a determinar concentraciones tolerables de ácidos grasos y toxina del cólera en células epiteliales intestinales humanas y macrófagos BALB/c mediante ensayos MTT. Este método ayuda a investigar la viabilidad celular y prevención de infecciones.

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Agradecemos a Paula Cobos y el Dr. Evros Vassiliou de asistencia de laboratorio y la prestación de los macrófagos de ratón, respectivamente. También agradecemos a nuestro director de laboratorio Richard Criasia de orientación y ayuda con los materiales. Por último, los autores agradecen Ramanpreet Kaur en busca de ayuda a la producción de video.

1. Cultivo de Tejidos <ol><li> Usa los macrófagos Mus musculus (ratones BALB / c) para las determinaciones de la toxina del cólera. Inicialmente, la cultura toda M. células musculus siguiendo las instrucciones del proveedor. </li><li> Propagar BALB / c las células de ratones en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco con L-glutamina completado con 10% de suero fetal bovino, y 1% 1.640 medios de comunicación de base de antibiótico / antimicótico o el medio RPMI completado con 10% de suero bovino fetal, 5% de L-glutamina, y 1 % de reactivo de antibiótico / antimicótico. </li><li> Se cultivan las células en 75 cm 2 frascos con tapas de ventilación corning a 37 ° C, 95% de aire y 5% de CO 2. </li><li> Llevar hasta las células epiteliales intestinales humanas dentro de las 24 horas de la entrega según las instrucciones del fabricante para la determinación de las determinaciones de ácidos grasos. </li><li> Propagar las células epiteliales intestinales humanas en 75 cm 2 frascos de corning con tapas de ventilación en HybriCare medios completado con 10% de SFB y 30 ng / ml EGF humano a 37 º C. No use antibióticosReactivos / antimicóticos como por las instrucciones del fabricante. </li><li> Dividir todas las células (01:03) en aproximadamente 70% de confluencia. </li><li> Congelar y abrir todas las células de todo el estudio el uso de protocolos estándar de congelación. </li><li> Nota: Para la determinación de la concentración de mayor escala de los ácidos grasos, utilice el crecimiento más rápido, más fácil de mantener, los macrófagos de ratón inicialmente. Para la determinación de la concentración de ácidos grasos escala fina, utilice las células epiteliales humanas. Utilice los macrófagos de ratón para todos los tratamientos de toxina del cólera (véase el debate). </li></ol> 2. Ácidos grasos y Tratamientos toxina del cólera <ol><li> Transferir los ácidos oleico, linoleico y linolénico desde proporcionado por la compañía ampollas de vidrio a viales de vidrio esterilizados. </li><li> Transferir cada ácido graso a un tubo Eppendorf esterilizado por separado y se disuelven primero en etanol al 100% a una dilución de 1:06, y luego en medio RPMI 1640 incompleto para una concentración final de 10 g / l. </li><li> Vortex cada solución y transfer a viales de vidrio para el almacenamiento en el congelador (-20 ° C). </li><li> Células de la placa en células 2500 / pocillo en 96 placas de cultivo de tejidos. </li><li> Agregue los medios completos necesarias para que el volumen total de 200 l para el tratamiento de las células con ácidos grasos en la preparación de ensayos de MTT. </li><li> Después de un período de proliferación de 24 horas, eliminar los medios de comunicación y reemplazarlo con medio fresco. </li><li> Añadir las concentraciones adecuadas de cada ácido graso a ensayar a los pozos (ver resultados). Añadir medio completo para llevar el volumen total y de 200 l. </li><li> Incubar las placas tratadas durante 24 horas antes de comenzar el ensayo MTT. </li><li> Disolver la toxina del cólera en PBS a una concentración de 1 mg / ml de alícuota de la solución y en crioviales y almacenar los crioviales a 2-8 ° C. </li><li> Para los tratamientos de células, diluir la toxina 1:100 en PBS esterilizado (pH 7,4) o incompleta DMEM para una concentración de trabajo final de 1 ng / l. </li><li> Para el tratamiento de las células con la toxina del cólera enpreparación para ensayos de MTT, las células de la placa como se describe anteriormente. </li><li> Después de un período de proliferación de las 24 horas, agregue las concentraciones adecuadas de la toxina del cólera (por nuestras concentraciones, ver resultados) a ensayar a los pozos siguiendo los procedimientos que se utilizan en aplicaciones de ácidos grasos (arriba). </li><li> Incubar las placas tratadas durante 24 horas antes de comenzar el ensayo MTT. </li><li> Como (c positivo en todo el documento) positivo y el control negativo (negativo c), tanto para el ácido graso y tratamientos de la toxina del cólera, las células se incuban con medio completo y etanol al 70%, respectivamente. </li><li> Para todas las muestras y los tratamientos utilizan un mínimo de tres repeticiones (n = 3), con más repeticiones para los controles positivos (n = 6 en este estudio). </li></ol> 3. Ensayo de MTT <ol><li> Hacer una solución madre de MTT a una concentración de 2,5 mg / ml. </li><li> Retirar la solución en cada pocillo de la placa de 96 pocillos a ser probado y reemplazarla con 200 l de solución de los medios de comunicación completo fresco. </li><li> Anunciod 10 l de la solución de MTT a cada pocillo. </li><li> Incubar la placa a 37 ° C durante 3-4 horas. </li><li> Descartar la solución de los medios de comunicación y añadir 100 ml de HCl 0,04 M en isopropanol a cada pocillo. </li><li> Incubar la placa a temperatura ambiente durante cinco minutos. </li><li> Transferir la solución de cada pocillo a un nuevo tubo de centrífuga. </li><li> Centrifugar a 20.000 xg, a temperatura ambiente, durante 1 min, o hasta que se formó un precipitado. </li><li> La transferencia entre 20-40 l de cada muestra a un lector de microplacas. </li><li> Leer la absorbancia a 570 nm utilizando un espectrofotómetro. </li></ol>

<ol><li>Franceur, M. L., Golden, G. M., Potts, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oleic+Acid%3A+Its+effects+on+stratum+corneum+in+relation+to+%28trans%29+dermal+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Oleic Acid: Its effects on stratum corneum in relation to (trans) dermal drug delivery.</a> Pharm Res. 7 (6), 621-627 (1990).</li>
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</ol>

Los autores de este estudio tienen ningún interés financiero de los resultados de este estudio. Los fondos para este estudio fue proporcionado a FT por la Universidad de Kean, sin embargo, FT es actualmente un empleado de Kingsborough Community College.

Sugerencia de la concentración de los ácidos grasos y la toxina del cólera Aunque el mecanismo exacto de cómo los ácidos grasos mejoran la inmunidad de la mucosa es desconocida, varios estudios han tratado de investigar sus efectos beneficiosos. Nuestro estudio tiene como objetivo proporcionar metodología para determinar la concentración máxima de ácidos grasos que las células pueden tolerar, así como la máxima concentración de la toxina del cólera que las células pueden tolerar sin una influen...

Los beneficios para la salud de los ácidos grasos, como el ácido oleico, linoleico y linolénico han sido y continúan siendo documentado. Por ejemplo, el ácido oleico ayuda a facilitar la penetración de los fármacos lipófilos en el 1,2 cuerpo, reduce la enfermedad cardiaca coronaria en un 24% cuando se sustituyen para los ácidos grasos saturados 3, y se utiliza para tratar enfermedades metabólicas tales como la adrenoleucodistrofia 4 que es una X-vinculados desorden genético del metabolismo de los ácidos grasos. . Mientras que un precursor necesario para el ácido araquidónico en los mamíferos, el ácido linoleico (a diferencia del ácido oleico) no es sintetizada por el cuerpo y debe ser obtenido a través de fuentes externas, tales como por el consumo de semilla de lino 5 Los estudios muestran varios efectos beneficiosos para la salud de ácido linoleico, tales como: propiedades anti-envejecimiento para la piel; 6 propiedades anti-inflamatorias, 7 reducción de la proliferación de células de carcinoma de colon y de próstata; 8 y la capacidad de luchar contra la obesidad y la promoción o. f salud cardiovascular 9 ácido linolénico juega un papel en la reducción de la inflamación periodontal, tromboxano 10 y la modulación y la biosíntesis de prostaciclina. 11 Arpita 12 estudió la influencia de los ácidos grasos biliares y el colesterol en V. expresión cholerae &#39;s de factores de virulencia y la motilidad. Yamasaki 13 indica que el extracto de metanol de chiles rojos, y otros compuestos extraídos naturalmente, lo que potencialmente puede reducir la producción de la toxina del cólera. Es concebible que considerar el uso de los productos alimenticios que son ricos en los ácidos grasos anteriores (tales como semillas de lino) en la prevención y el alivio de una enfermedad infecciosa, como el cólera a través de proporcionar inmunidad de la mucosa. Hemos llevado a cabo investigaciones para solubilizar los ácidos grasos y para determinar, mediante ensayos de proliferación celular, la concentración máxima de ácidos grasos que las células epiteliales intestinales humanos pueden tolerar sin efectos perjudiciales sobre la ceviabilidad ll. La hipótesis de que los ácidos oleico, linoleico y linolénico proporcionan un efecto beneficioso sobre la viabilidad celular a concentraciones más bajas, pero que a concentraciones más altas que a ser tóxico para las células. También se solubiliza la toxina del cólera y se determinó la concentración máxima de la toxina del cólera que BALB / C macrófagos de ratón pueden tolerar sin una disminución significativa en la viabilidad celular. Planteamos la hipótesis de un efecto tóxico de la toxina del cólera en la viabilidad celular, incluso a muy bajo nivel. El método de solubilización de una toxina del cólera y su uso para determinar la cantidad máxima de la toxina que las células pueden tolerar sin una disminución significativa en la supervivencia proporciona una ventaja para futuros estudios. Por ejemplo, una combinación de las metodologías anteriores se puede utilizar para determinar si los ácidos grasos proporcionan células con inmunidad de la mucosa contra las infecciones de cólera. A lo mejor de nuestro conocimiento, esta metodología racional y no ha sido explorado. Nos discuss cómo nuestros datos preliminares pueden ser utilizados en investigaciones posteriores para determinar si los ácidos oleico, linoleico y linolénico proporcionan células con inmunidad de la mucosa contra la infección por el cólera.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><Células>fuertes/Reactivo</td></tr><tr><td>Mus musculus macrófagos</td><td>ATCC</td><td>ATCC RAW 264.7</td><td></td></tr><tr><td>Medio de águila modificado de Dulbecco</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>ATCC</td><td>30-2115</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino </td><td>Bio-west</td><td>S0250</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico/ Hipona antimicótica </td><td></td><td>SV3007901</td><td></td></tr><tr><td>células epiteliales intestinales humanas </td><td>ATCC</td><td>ATTC CCL-241</td><td></td></tr><tr><td>HybriCare medios </td><td>ATCC</td><td>46-X</td><td></td></tr><tr><td>Ácido oleico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1008</td><td></td></tr><tr><td>Ácido linoleico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-1376</td><td></td></tr><tr><td>Ácido linolénico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2376</td><td></td></tr><tr><td>Toxina del cólera</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>BD Falcon Placas de cultivo celular de 96 pocillos</td><td>BD Biosciences</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro con software Dynex Revelations 4.22</td><td>Dynex</td><td>91000101</td><td></td></tr></tbody></table>

determinación de los ácidos grasos tolerables y concentraciones toxina del cólera el uso de células epiteliales intestinales humanas y de ratón balb / c macrófagos

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

El papel positivo de los ácidos grasos en la prevención y alivio de enfermedades no humanos y humanos han sido y siguen siendo ampliamente documentada. Estos papeles incluyen influencias sobre las enfermedades infecciosas y no infecciosas, incluyendo la prevención de la inflamación, así como inmunidad de la mucosa a las enfermedades infecciosas. El cólera es una enfermedad intestinal aguda causada por la bacteria Vibrio cholerae. Se produce en los países en desarrollo y si no se trata, puede causar la muerte. Si bien existen vacunas para el cólera, que no siempre son eficaces y son necesarios otros métodos preventivos. Nos pusimos en marcha para determinar las concentraciones tolerables de tres ácidos grasos (ácidos oleico, linoleico y linolénico) y la toxina del cólera a través del ratón BALB / C macrófagos y células epiteliales intestinales humanas, respectivamente. Se solubilizan los ácidos grasos anteriores y ensayos de proliferación de células utilizadas para determinar los intervalos de concentración y las concentraciones específicas de los ácidos grasos que no sont perjudiciales para la viabilidad de las células del epitelio intestinal humano. Se solubiliza la toxina del cólera y lo usamos en un ensayo para determinar los intervalos de concentración y las concentraciones específicas de la toxina del cólera que no disminuya la viabilidad celular estadísticamente en BALB / C macrófagos. Encontramos las concentraciones de ácidos grasos óptimas para ser entre 1-5 ng / l, y que la toxina del cólera que ser &lt;30 ng por tratamiento. Estos datos pueden ayudar a futuros estudios que tienen como objetivo encontrar un papel mucosa protectora para los ácidos grasos en la prevención o alivio de las infecciones por cólera.

Determinación de la concentración óptima de ácidos grasos La concentración óptima para los ácidos grasos se define como la concentración máxima a la que el crecimiento celular es comparable o superior a la de las células de control, con relativamente baja variabilidad en los resultados. Para determinar la concentración óptima de oleico, células de ácidos linoleico y linolénico se trataron inicialmente con concentraciones variables de cada ácido graso en incrementos grandes y más tarde con incre...

Nos pusimos en marcha para determinar las concentraciones tolerables de tres ácidos grasos (ácidos oleico, linoleico y linolénico) y la toxina de cólera que no significativa y adversamente afectan la supervivencia celular mediante la solubilización de los ácidos grasos y la toxina y su uso en ensayos de supervivencia celular.

Determinación de los ácidos grasos tolerables y Concentraciones toxina del cólera El uso de células epiteliales intestinales humanas y de ratón BALB / c Macrófagos

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

El objetivo general de este procedimiento es determinar las concentraciones tolerables de ácidos grasos y de toxina del cólera que no influyan negativamente en la supervivencia celular. Esto se logra primero cultivando el tipo adecuado de células. El segundo paso consiste en incubar las células con distintas concentraciones de los tres ácidos grasos que se van a probar o con la toxina del cólera.Después de 24 horas, se evalúa la supervivencia celular mediante un ensayo de MTT. En última instancia, los datos de espectrometría del ensayo de MTT muestran las concentraciones óptimas de ácidos grasos y toxina del cólera con las que se pueden tratar las células sin una reducción significativa en la supervivencia. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la prevención de las infecciones por cólera, ya que las vacunaciones no siempre son exitosas.Se utilizarán macrófagos de Mus musculus procedentes de ratones C57BL/6 para todas las determinaciones de co toxina y para la determinación a mayor escala de la concentración de ácidos grasos. Las células se cultivan en uno de los dos medios siguientes: DMEM con L-glutamina, suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de antibiótic

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Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aquí, le detallamos una metodología para el aislamiento rápido de las células dendríticas de ratones intestinales (DCS) y los macrófagos. Caracterización fenotípica de los países en desarrollo y los macrófagos intestinales se realiza utilizando varios colores, mientras que el flujo de análisis de citometría de enriquecimiento de bolas magnéticas seguido por la selección de células se utiliza para producir poblaciones de alta pureza para los estudios funcionales.

Aislamiento y caracterización de las células dendríticas y los macrófagos del intestino delgado de ratón

Un ensayo de alto rendimiento in vitro de Salmonella fenotipo u otra asociación bacteriana, invasión, y la replicación en las células fagocíticas con capacidad de alto rendimiento se ha desarrollado. Se empleó el método de evaluar las cepas mutantes de Salmonella gen knockout por sus implicaciones en la interacción huésped-patógeno.

Ensayo de alto rendimiento para Fenotipo Salmonella enterica Asociación Typhimurium, Invasión y replicación en macrófagos

Describimos la cuantificación de Salmonella typhimurium citosólica y vacuolar en macrófagos derivados de la médula ósea utilizando la permeabilización diferencial de digitonina.

Cuantificación de Citosólica vs. Vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; En macrófagos primarios por permeabilización diferencial

De la lipogénesis de novo y la oxidación de ácidos grasos β-constituyen vías metabólicas claves en los hepatocitos, las vías que son perturbados en varios trastornos metabólicos, incluyendo la enfermedad de hígado graso. Aquí se demuestra el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón y describimos cuantificación de la oxidación de ácidos grasos β-y la lipogénesis.

Determinación de la oxidación de ácidos grasos y la lipogénesis en el ratón hepatocitos primarios

Caco-2 pueden servir como modelo in vitro para estudiar el transporte de lípidos por parte de los enterocitos y fármacos/vitaminas liposolubles en lípidos. El sistema de membrana permeable separa el compartimento apical del basolateral, mientras que el sistema de expresión de lentivirus ofrece un método eficaz de sobreexpresión génica. El aislamiento de lipoproteínas está confirmado por TEM.

El uso de células Caco-2 para el Estudio de lípidos Transporte por el Intestino

Este protocolo se describe el modelo de ratón cefoperazona de la infección por Clostridium difficile (CDI), utilizando una cepa clínicamente relevante y genéticamente manejable, R20291. Énfasis en el seguimiento clínico de la enfermedad, C. difficile enumeración bacteriana, la citotoxicidad de la toxina, y los cambios histopatológicos en todo CDI en un modelo de ratón se detalla en el protocolo.

Cefoperazona tratados modelo de ratón clínicamente relevante<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; R20291 Strain

Aquí se presentan dos métodos para determinar la función de barrera intestinal. Un medidor epitelial (voltios/ohmios) se utiliza para la medición de la resistencia eléctrica transepitelial de epitelio cultivado directamente en los pocillos de cultivo de tejidos. En ratones, el método de sonda de FITC-los dextranos se utiliza para determinar la permeabilidad intestinal en vivo.

In Vitro e In Vivo métodos para determinar la permeabilidad de la célula epitelial Intestinal

Este protocolo describe un ensayo para la caracterización de la formación de gotas lipídicas (LD) en organoides intestinales humanos tras la estimulación con ácidos grasos. Discutimos cómo se utiliza este ensayo para la cuantificación de la formación de LD, y cómo se puede utilizar para la detección de alto rendimiento de medicamentos que afectan a la formación de LD.

Un ensayo basado en fluorescencia para la caracterización y cuantificación de la formación de gotas lipídicas en organoides intestinales humanos

La función epitelial intestinal desregulada de la barrera y las inmunorespuestas son sellos de la enfermedad de intestino inflamatoria que siguen siendo investigados mal debido a una carencia de modelos fisiológicos. Aquí, se describe un modelo de asa intestinal de ratón que emplea un segmento intestinal bien vascularizado y exteriorizado para estudiar la permeabilidad de la mucosa y el reclutamiento de leucocitos in vivo.

Evaluación Funcional De La Permeabilidad Intestinal Y La Migración Transepitelial Neutrófilo En Ratones Usando Un Modelo De Bucle Intestinal Estandarizado

Escherichia coli causa sepsis en neonatos que ingieren la bacteria alrededor del momento del nacimiento. El proceso involucrado en la capacidad de E. coli para viajar desde el tracto entérico al torrente sanguíneo es poco conocido. Este modelo in vitro evalúa la capacidad de las cepas de E. coli para viajar a través de las células epiteliales intestinales.

Evaluación de la transcitosis intestinal de aislados de bacteriemia neonatal por Escherichia coli

Aquí describimos la construcción de un sistema modelo básico tridimensional (3D) de líneas celulares intestinales y un protocolo de inclusión de parafina para la evaluación microscópica óptica de equivalentes intestinales fijos. La tinción de proteínas seleccionadas permite el análisis de múltiples parámetros visuales de un solo experimento para su uso potencial en estudios preclínicos de detección de fármacos.

Sistema Modelo Intestinal Tridimensional Básico (3D) con un Componente Inmune

Aprende a determinar concentraciones tolerables de ácidos grasos y toxina del cólera en células epiteliales intestinales humanas y macrófagos BALB/c mediante ensayos MTT. Este método ayuda a investigar la viabilidad celular y prevención de infecciones.

Determinación de los ácidos grasos tolerables y Concentraciones toxina del cólera El uso de células epiteliales intestinales humanas y de ratón BALB / c Macrófagos (Video) | JoVE Journal

Determinación de los ácidos grasos tolerables y Concentraciones toxina del cólera El uso de células epiteliales intestinales humanas y de ratón BALB / c Macrófagos

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