Name: El examen de Drosophila Larvas células traqueales de terminales por microscopía de luz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Aprende a analizar células traqueales terminales en larvas de Drosophila mediante microscopía de luz y GFP. Este método rápido permite cuantificar morfologías celulares y estudiar mutaciones en desarrollo traqueal.

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Damos las gracias a Gillian Stanfield los comentarios sobre el manuscrito. TAJ con el apoyo de la Universidad de Utah Genética Formación subvención T32-GM007464 del NIH NIGMS.

1. Generación Mosaico <ol><li> Cruz genética w FRT 19A bañera: GAL80 FLP 122 / Y; BTL-GAL4, UAS-GFP (machos) * X FRT 19A / Bal (hembras), donde * representa el mutante a ser examinado. Nota: Configure cruzar por lo menos un día antes de experimentar, ya que esto permite a los animales se aparean correctamente. </li><li> Pre-lay: Centro de transferencia de viales volar de comida con una pequeña mancha de pasta de levadura fresca colocada en los medios de comunicación. Permitir a sentar durante 1 hora a 25 ° C. </li><li> Lay: Transferencia de animales de vial pre-sentar a un vial fresco con una pequeña mancha de pasta de levadura fresca. Permitir a sentar durante 6 horas a 25 ° C. </li><li> Transferencia de adultos de vuelta a vial pre-sentar para su almacenamiento y su uso en experimentos posteriores. Inmediatamente choque de calor el vial laico que contiene 0-6 hr embriones durante 45 min a 38 ° C, en un baño de agua circulante. Nota: La superficie de los alimentos debe estar por debajo del nivel del agua para verificar toda laembriones están debidamente choque térmico. </li><li> Incubar viales calor conmocionado a 25 ° C durante 4-5 días hasta que las larvas comienzan a divagar. </li></ol> 2. Pantalla de mosaico Animales <ol><li> Usando unas pinzas finas recoger suavemente errante larvas de tercer estadio de los lados del vial y colocarlos en refrigerada glicerol 100% en una pequeña placa de plástico. </li><li> Examine larvas utilizando un microscopio de disección alta magnificación-equipada con óptica fluorescentes. Identificar las larvas con la expresión mosaico de células traqueales marcados con fluorescencia. Típicamente, esto se puede hacer en 10-20X. </li></ol> 3. Fijación de calor <ol><li> Con unas pinzas finas recoger cuidadosamente animales mosaico del plato y coloque en una gota de agua dulce 100% de glicerol en mm blanco vidrio portaobjetos de 75x25x1. Nota: múltiples animales pueden ser colocados en la gota (Figura 1A). Los animales también se pueden colocar en una gota de glicerol directamente sobre un cubreobjetos,pero se debe tener cuidado durante la fijación (paso 3.2), ya que los animales se calientan muy rápidamente y pueden llegar a ser sobre-fija. </li><li> Colocar el portaobjetos de vidrio a 70 ° C del bloque de calor hasta que los animales sólo dejan de moverse, no más de 20 segundos para una diapositiva, y 10 seg para una hoja de cubierta (Figura 1B). Los animales se retuercen al principio, pero detenerse y volverse rígida y alargada, una vez muerto. Nota: La exposición demasiado larga al calor puede dañar ramas terminales y lúmenes, así como hacer la señal de GFP tenue y difusa. Para una eficacia óptima, se recomienda tener el bloque de calor en la habitación con los microscopios. </li><li> Usando unas pinzas finas orientar cuidadosamente todas las larvas del menú en una sola dirección, de tal manera que todas las larvas en la diapositiva son orientadas en paralelo el uno al otro (Figura 1C). </li><li> Coloque con cuidado la cubierta de vidrio micro 18x18mm en la parte superior de las larvas (o invertir el cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio) y evitar la formación de burbujas (Figura 1D). Nota: cubreobjetos no puede estar exactamenteplana sobre larvas, esto no es un problema. </li><li> Larvas de imagen dentro de 30 min. Células terminales fijos de calor se degradarán y la señal de GFP se convertirán en muy difusa. </li></ol> 4. Imágenes in vivo de las células traqueales de terminales <ol><li> Coloque la diapositiva en el escenario de un microscopio estereoscópico compuesto. El uso de un objetivo de 5X localizar los dos troncos de dorsales paralelas que van de anterior a posterior en la superficie dorsal del animal (Figura 1F). Localice las dos células terminales dorsal, directamente entre los dos troncos de dorsales. Esto ayuda a identificar el segmento apropiado para el análisis. </li><li> Una vez orientado, rotar a los animales para agrandar las células terminales deseados. Para hacer esto, empuje con cuidado el cubreobjetos en el borde con las pinzas perpendiculares al eje largo de las larvas, rodando lentamente las larvas debajo del cubreobjetos (Figuras 1E y 1G). </li><li> Selección de las células terminales apropiados es fundamental para obtener resultados consistentesy las comparaciones entre los mutantes. Células terminales La rama de grasa corporal (PC) se encuentran fácilmente al lado del tronco dorsal, lateral a la línea media. Las células terminales del grupo G laterales (LG) son fáciles de encontrar y están situadas justo lateral de la línea media ventral (Figura 1H). Nota: en los segmentos más anteriores (Tr1) y posterior (Tr10) la disposición de la célula terminal es divergente de otros segmentos. Nosotros sólo analizamos las células terminales en los segmentos Tr2-TR9. Células terminales dorsales tienen un patrón de ramificación más estereotipado que otras células traqueales de terminales. Esto puede depender de las señales autónomas adicionales, no celulares, y esto debe ser considerado al momento de decidir si se debe incluir en el análisis. </li><li> Una vez que una célula terminal del interés ha sido identificado, la captura de una imagen con el tamaño deseado, normalmente 10X o 20X es mejor (Figura 2A). Nota: debido a los patrones de ramificación variables, tratar de capturar imágenes que incluyan tantas ramas y puntas de las ramas como sea posible. </li><li> Sin mover el escenario, apagar la fluorescencia y encienda la luz transmitida para capturar una imagen de campo claro de la misma célula y el plano focal (Figura 2B). El lumen se puede visualizar como contrasta en color oscuro en el espacio celular terminal. Si planeas cuantificar ramas terminales celulares y lúmenes, recoge varias imágenes en múltiples planos focales de cada célula terminal. </li></ol> 5. Análisis y cuantificación de Morfología Celular Terminal Utilizando ImageJ <ol><li> Abra las imágenes fluorescentes y campo claro mediante el ImageJ ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ) plug-in NeuronJ ( <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/" target="_blank">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</a> ). </li><li> Utilizando el &quot;Add trazados&quot; herramienta rastrear manualmente las ramas y el lumen de la célula entera terminal. </li><li> Con la herramienta &quot;trazados Label&quot;, cambiar el nombre y la reColor asignar cada línea de la traza de una denominación específica. </li><li> Con la herramienta &quot;parámetros de Set&quot;, ajustar el ancho de línea 6-10 512x512 píxeles (para imágenes obtenidas por la cámara digital conectada al microscopio compuesto. Para cámaras de mayor resolución o menor, el ancho de píxel debe escalarse apropiadamente), utilizando todos los otros valores predeterminados y seleccione &quot;OK&quot;. A continuación, utilice la función &quot;Hacer foto&quot; para tomar una imagen. Seleccione la opción &quot;Dibujar trace&quot; para obtener una instantánea de la traza que se puede mostrar de lado a lado con el original. </li><li> Seleccione la herramienta &quot;Medir trazados&quot; y seleccionar el tipo de trazado (es decir, que se ramifica a medida basada en las denominaciones específicas asignadas en el paso 5.3). A continuación, seleccione &quot;Mostrar las mediciones de rastreo&quot; y &quot;Borrar las mediciones anteriores&quot; y luego haga clic en &quot;Ejecutar&quot;. Esto producirá una hoja de cálculo que contiene el nombre, la etiqueta, la longitud (en píxeles), y otros datos para la imagen. Estos datos se pueden guardar como una hoja de cálculo Microsoft Excel para su posterior estadísticaanálisis. </li></ol>

<ol><li>Manning, G., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+Tracheal+System%5BTitle%5D)+AND+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila Tracheal System.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).</li>
<li>Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+regulation+of+airway+branching+in+Drosophila+is+mediated+by+branchless+FGF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF.</a> Cell. 99 (2), 211-220 (1999).</li>
<li>Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+interactions+among+epithelial+cells+during+tracheal+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis.</a> Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).</li>
<li>Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Zpr1+%28Zinc+Finger+Protein+1%29+Is+Required+Downstream+of+Both+EGFR+And+FGFR+Signaling+in+Tracheal+Subcellular+Lumen+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45649(2012).</li>
<li>Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+screen+for+tube+morphogenesis+and+branching+genes+in+the+Drosophila+tracheal+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002087(2011).</li>
<li>Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonal+genetic+screen+for+mutants+causing+defects+in+larval+tracheal+morphogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila.</a> Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).</li>
<li>Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whacked+and+Rab35+polarize+dynein-motor-complex-dependent+seamless+tube+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth.</a> Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).</li>
<li>Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+talin+and+integrin+genes+are+required+for+maintenance+of+tracheal+terminal+branches+and+luminal+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization.</a> Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).</li>
<li>Jones, T. A., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+function+for+the+PAR+complex+in+subcellular+morphogenesis+of+tracheal+terminal+cells+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).</li>
<li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li>
<li>Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+GFP%2F%C3%9F-galactosidase+fusion+protein+as+a+marker+for+morphogenesis+in+living+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">A nuclear GFP/ß-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila.</a> Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).</li>
<li>Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li>
<li>Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+autonomy+of+HIF+effects+in+Drosophila%3A+tracheal+cells+sense+hypoxia+and+induce+terminal+branch+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting.</a> Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen ningún interés financiero en competencia.

La técnica de fijación por calor descrito aquí es una herramienta rápida y conveniente para las larvas células terminales traqueales imágenes Drosophila. Aquí, nosotros usamos esta técnica para examinar la ramificación y el patrón de luz de las células de tipo salvaje. Células traqueales que expresan GFP, dirigido por el promotor específico traqueal sin aliento, se pueden visualizar fácilmente a través de la cutícula larval después de la fijación de calor. Los patrones de ramificación específicas de la...

La forma celular es crítica para la función de las células individuales dentro de un organismo, así como las células que funcionan como parte de un tejido u órgano. Utilizamos Drosophila células terminales traqueales, un componente del sistema respiratorio del insecto, para investigar los mecanismos moleculares que participan en el control de dos tipos conservadas de morfología celular: Bifurcaciones y formación del tubo (lumenogenesis). Células de terminales se encuentran en la punta de una red de tubos ramificados que funciona para suministrar oxígeno a los tejidos internos 1 y tienen una morfología ramificada elaborado que depende de una vía de señalización de FGF que es controlada por los niveles de oxígeno locales dentro de los tejidos de destino 2. Ramas de células de terminales son tubos delgados, con un llenas de gas lumen subcelulares se ejecutan a través de cada rama. Las arquitecturas celulares distintos de las células terminales, junto con la facilidad con la que el análisis genético puede llevarse a cabo en Drosophila, hacen que estas células un modelo excelente fo la investigación de los mecanismos de derivación celular, ramificación y formación del tubo intracelular. Células de terminales han demostrado ser un modelo útil para entender algunas de las vías de señalización que conducen a la diferenciación celular ramificado, carnosidad, y la maduración 2-4. El uso de este sistema imparcial, se han realizado las pantallas adelante genéticos para la morfogénesis de células mutantes, dando ideas sobre los mecanismos que controlan la forma celular 5,6. Por ejemplo, estas pantallas han puesto de manifiesto que es necesario un RabGAP específica para la polaridad del citoesqueleto y el tráfico de vesículas en la formación del lumen y de posicionamiento 7; que se requiere la adhesión mediada por la integrina para la estabilidad rama 8, y que las proteínas PAR-polaridad epiteliales regular el tráfico de membrana polarizada requerido tanto para la ramificación y la formación del lumen 9. Otros estudios realizados en células de terminales han demostrado que se requiere la acumulación de actina asimétrica y organización de los microtúbulos para la elongación celular y lumenogenesis <shasta&gt; 10. Por lo tanto, diversos mecanismos biológicos celulares conservadas, contribuyen a la morfogénesis celular terminal. A continuación, se describe un método para solucionar rápidamente intacta tercer estadio las larvas de Drosophila para el análisis de células ramificación terminal y la formación del lumen. Este protocolo también puede llevarse a cabo tanto en primero y segundo instar animales. La clave de esta técnica es la posibilidad de visualizar las células terminales que están etiquetados genéticamente mediante la expresión de la proteína fluorescente directamente a través de la cutícula larval de los animales intactos. Dado que este procedimiento no requiere ninguna manipulación posteriores a la fijación, tales como la tinción de anticuerpos, para observar las células, que es muy adecuado para análisis de alto rendimiento, incluyendo la investigación genética o drogas. Expresión de la proteína fluorescente revela la estructura de las ramas citoplásmicamente llenas. La formación de tubos se puede controlar en paralelo usando microscopía de campo claro para identificar el lumen lleno de gas, lo que contrasta con el entorno de fluido llenetejidos ed. Incluido en este protocolo es el método para la generación de mosaicos genéticos basados ​​en el sistema MARCM 11, para producir células mutantes homocigotos terminales marcadas con proteínas fluorescentes en animales no marcados de otro modo. Esto es necesario, ya que las células terminales sólo elaboran sus estructuras complejas relativamente tarde en el desarrollo; mosaicos genéticos permiten la derivación de los requisitos de genes en anteriores en el desarrollo de otros tejidos. . Para generar clones MARCM, la tráquea se etiquetan con el controlador específico de respiración traqueal (BTL) 12 describe aquí es el protocolo para el cromosoma X de Drosophila; para otros cromosomas, un procedimiento similar se puede utilizar, con reactivos genéticos apropiados para el cromosoma ser examinado. Aquí, la tráquea se etiquetan mediante la expresión de una GFP citoplasmática localizada, pero el procedimiento funciona igualmente bien con la expresión de otras proteínas fluorescentes, tales como DsRed. Además, hemos incluido un método para cuantificar los patrones de ramificación y la formación del lumen de las células terminales, con base en los métodos desarrollados para caracterizar los patrones de ramificación neuronal 13. Este tipo de datos cuantitativos puede ser crítico para discernir el papel preciso de los genes en el proceso de ramificación o lumenogenesis, así como para permitir comparaciones directas entre los diferentes mutantes 9.

<table><tbody><tr><td>Pinza para estudiantes Dumont #5</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección Leica MZ16 (o equivalente)</td>Microscopio compuesto <td>Leica</td><td>MZ16</td><td></td></tr><tr><td>AxioImager M1 (o equivalente)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Equipado con AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Juego de filtros 38HE</td></tr><tr><td>100% glicerol</td><td>BioExpress</td><td>M152-4L</td><td></td></tr><tr><td>Genotipo de la culata</td><td></td><td></td> de mosca<td>: w FRT19A tub: GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A</td></tr><tr><td>Stock</td><td></td><td></td> de mosca <td>Genotipo: y w FRT19A</td></tr></tbody></table>

el examen de<em&gt; drosophila</em&gt; larvas células traqueales de terminales por microscopía de luz

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

La forma celular es crítica para la función celular. Sin embargo, a pesar de la importancia de la morfología de las células, se sabe poco sobre cómo las células individuales generan formas específicas. Células terminales traqueal de Drosophila se han convertido en un modelo genético de gran alcance para identificar y aclarar el papel de los genes necesarios para la generación de morfologías celulares. Células de terminales son un componente de una red tubular ramificada, el sistema traqueal que funciona para suministrar oxígeno a los tejidos internos. Células de terminales son un excelente modelo para la investigación de las cuestiones de forma de la célula, ya que poseen dos arquitecturas celulares distintos. En primer lugar, las células terminales tienen una morfología ramificada elaborada, similar a las neuronas complejas; segundo, ramas de células terminales se forman como tubos delgados y contienen un lumen intracelular unida a la membrana. El análisis cuantitativo del número de rama terminal de las células, la organización y la forma de rama rama individual, se puede utilizar para proporcionar información sobre el papel de los mecanismos genética específicamos en la fabricación de una célula ramificada. Análisis de la formación del tubo en estas células puede revelar los mecanismos conservadas de tubulogénesis comunes a otras redes tubulares, tales como la vasculatura del vertebrado. Aquí se describen las técnicas que se pueden utilizar para fijar rápidamente, imagen, y analizamos los dos patrones de ramificación y la formación del tubo en las células terminales dentro de las larvas de Drosophila. Estas técnicas se pueden utilizar para analizar las células terminales en los animales de tipo salvaje y mutante, o mosaicos genéticos. Debido a la alta eficiencia de este protocolo, también es muy adecuado para el genético, basado en RNAi, o pruebas de drogas en el sistema traqueal de Drosophila.

Los resultados se muestran en la Figura 2. Un grupo lateral única (LG) celular terminal muestra extensa ramificación subcelular (visualizado por las buenas prácticas agrarias, A) y un gas llenos de luz subcelulares que atraviesan cada una de las ramas (visualizaron por microscopía de campo claro, B). Estas imágenes se obtuvieron de un mosaico L3 larva, generado usando el sistema de MARCM descrito en las secciones 1 y 2, y el calor y la imagen fija, tal como se describe en las secciones 3 y 4. Los panele...

A continuación, presentamos un método para el análisis de microscopía de luz de las células traqueales de terminales<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas. Este método permite el examen rápido de la rama y la morfología del lumen en los animales enteros y sería útil para el análisis de mutantes o pantallas para las mutaciones que afectan el desarrollo de células de terminales individuales.

El examen de<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas células traqueales de terminales por microscopía de luz

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

El objetivo general de este procedimiento es fijar rápidamente larvas de Drosophila intactas para poder observar la morfología de las ramificaciones y los tubos en las células terminales traqueales. Esto se logra primero generando células terminales homocigóticas marcadas con proteína fluorescente en animales genéticamente mosaicós. El segundo paso del procedimiento consiste en recolectar larvas mosaicós y fijarlas mediante calor. El tercer paso consiste en obtener imágenes de células terminales marcadas en animales fijados, utilizando la expresión de GFP para observar las ramificaciones y microscopía de campo brillante para observar los tubos. El paso final es cuantificar las morfologías de las células terminales. En última instancia, los resultados pueden utilizarse para distinguir y clasificar las distintas morfologías celulares de las células terminales de tipo silvestre y mutantes.La simple ventaja de esta técnica frente a las técnicas existentes, como la fijación química, es que este método es extremadamente rápido, por lo que puede utilizarse para el análisis de alto rendimiento de células terminales traqueales. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque seleccionar larvas L3 y fijarlas rápidamente para preservar su morfología requiere atención y cuidado. Para generar moscas mosaic.Utilice la técnica de Mark M con hembras que porten la mutación que se va a examinar. Realice los cruces en viales con puesta previa que contengan una pequeña cantidad de pasta de levadura fresca, y permita que las moscas pongan huevos durante una hora a 25 grados Celsius. Luego, transfiera las moscas del vial de puesta previa a un vial nuevo con pasta de levadura fresca y permita que pongan durante seis horas a 25 grados Celsius.Después de seis horas, transfiera los adultos de nuevo a los viales de preoviposición para su almacenamiento y úselos inmediatamente en experimentos posteriores. Someta los viales recolectados de oviposición a un choque térmico en un baño de agua circulante durante 45 minutos a 38 grados Celsius; la superficie del medio debe estar por debajo del nivel del agua para asegurar que todos los embriones reciban adecuadamente el choque térmico. A continuación, incube los viales sometidos al choque térmico a 25 grados Celsius durante cuatro a cinco días hasta obtener larvas de tercer estadio.Comience a moverse usando pinzas finas. Tome suavemente larvas de tercer estadio en movimiento desde los lados del vial y colóquelas en glicerol al 100% enfriado en una placa de plástico pequeña. Examine las larvas utilizando un microscopio estereoscópico de alta magnificación equipado con óptica fluorescente a 10 x o 20 x de magnificación.Identifique las larvas con expresión mosáica de células traqueales marcadas con fluorescencia. Luego, utilizando pinzas finas, seleccione cuidadosamente esos animales y colóquelos en una gota de glicerol fresco al 100 % sobre un portaobjetos de vidrio blanco. Se pueden colocar varios animales en la misma gota dentro del mismo cuarto del microscopio.Coloque el portaobjetos sobre un bloque calefactor a 70 grados Celsius hasta que los animales dejen de moverse, lo cual ocurre dentro de los 20 segundos. Inicialmente, los animales se retuercen, pero luego se vuelven rígidos y alargados. Una vez muertos, la exposición prolongada provoca daño térmico en las ramas terminales, así como daño en las luz de los conductos.La señal de GFP se vuelve tenue y difusa. El momento de la fijación por calor es crítico porque una fijación excesiva puede dañar las células, lo que lleva a un análisis engañoso o difícil. Por lo tanto, las muestras deben colocarse en el bloque térmico y fijarse hasta que apenas dejen de moverse, pero no más tiempo.Ahora, utilizando pinzas finas, oriente cuidadosamente todas las larvas fijadas de forma paralela entre sí. Luego, coloque suavemente un cubreobjetos micro sobre las larvas y evite formar burbujas. Es posible que el cubreobjetos no quede completamente plano, pero esto no representa un problema.Dentro de los próximos 30 minutos, capture imágenes de las larvas. Las células terminales fijadas por calor se degradan rápidamente y las señales de GFP se vuelven muy difusas. A continuación, coloque el portaobjetos sobre la platina de un microscopio estereoscópico compuesto.Utilizando un objetivo de cinco x, localice los dos troncos dorsales paralelos que corren de anterior a posterior en la superficie dorsal del animal. A continuación, localice las dos células terminales dorsales directamente entre los dos troncos dorsales. Esto ayuda a identificar el segmento adecuado para el análisis.Una vez orientados, gire los animales para visualizar las células terminales deseadas empujando cuidadosamente el borde del cubreobjetos con pinzas. Hacerlo perpendicular al eje largo del animal hace rodar lentamente las larvas. La selección de las células terminales adecuadas es fundamental para obtener resultados consistentes y comparaciones entre mutantes.Las células terminales de la rama del cuerpo graso se encuentran fácilmente adyacentes al tronco dorsal, laterales a la línea media. Las células terminales del grupo lateral G se localizan con facilidad y están situadas justo al lado lateral de la línea media ventral en los segmentos más anteriores y posteriores. La disposición de la célula terminal es divergente respecto a otros segmentos.Esos segmentos no deben examinarse, sino centrarse en cambio en las células y segmentos. Las células terminales dorsales TR dos a nueve presentan un patrón de ramificación más estereotipado que otras células terminales traqueales. Esto podría depender de señales adicionales no autónomas respecto a la célula, y esto debe tenerse en cuenta al decidir si se incluyen en el análisis.Una vez identificada una célula terminal de interés, capture una imagen utilizando un aumento de 10 x o 20 x debido a los patrones variables de ramificación. Intente capturar imágenes que incluyan tantas ramas y extremos de ramas como sea posible sin mover la platina. Apague la fluorescencia y encienda la luz transmitida.Para capturar una imagen de campo claro de la misma célula y plano focal, la luz será fuertemente contrastada dentro del espacio de la célula terminal. Para cuantificar las ramificaciones y luces de la célula terminal, recolecte múltiples imágenes en múltiples planos focales de cada célula terminal. Algunas células requieren una sola imagen para recolectar datos suficientes; sin embargo, otras pueden requerir hasta tres imágenes individuales en diferentes planos focales.Para capturar todas las ramas, abra las imágenes de campo brillante del extremo fluorescente en ImageJ con el plugin NeuronJ instalado. Utilizando la herramienta de trazado adicional, trace manualmente las ramas y el lumen de toda la célula terminal; luego, con la herramienta de etiquetado de trazados, cambie el nombre y el color para asignar a cada línea dentro del trazado una designación específica en cinco imágenes de 12 por cinco píxeles de 12. Utilice la herramienta de configuración de parámetros para ajustar el ancho de línea de seis a 10 píxeles.Escalone las imágenes de mayor o menor resolución según corresponda. Deje los demás ajustes en sus valores predeterminados y presione aceptar. Luego, utilice la herramienta de captura de imagen.Para tomar una imagen, elija dibujar Trazo para obtener una instantánea del trazo que se puede mostrar lado a lado con la imagen original. Seleccione la herramienta de mediciones de trazos y elija el trazo. Escriba las ramas a medir según las designaciones específicas.A continuación, seleccione mostrar las mediciones del trazado. Luego, elimine las mediciones anteriores y haga clic en ejecutar. Esto generará una hoja de cálculo que contiene el nombre, la etiqueta, la longitud en píxeles y otros datos de la imagen que se guardarán para el análisis estadístico.Se siguió el protocolo descrito para analizar células traqueales mutadas en larvas Mosaic L tres visualizadas mediante GFP. La célula terminal del grupo lateral único etiquetada como LG presenta una extensa ramificación subcelular en campo claro. Un lumen subcelular lleno de gas que atraviesa cada una de las ramas es evidente mediante Neuron J. Se realizó un trazado de las ramas, así como un trazado del lumen. En este animal no mosáico, se identifica la célula terminal del cuerpo graso FB.Tenga en cuenta que la GFP se expresa en todo el sistema traqueal. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fijar rápidamente imágenes y realizar análisis cuantitativo en células terminales traqueales intactas después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores utilicen las células terminales traqueales como un modelo fundamental para comprender aspectos de la morfogénesis celular utilizando células terminales traqueales.

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Investigación

JoVE Journal

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Biología

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Fuente: Jeong, S. Visualización del patrón de proyección axonal de las neuronas motoras embrionarias en Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Este video demuestra la visualización de proyecciones axonales en embriones de Drosophila. El inmunomarcaje de las neuronas motoras, la disección precisa para exponer las estructuras neuronales y la microscopía de contraste de interferencia diferencial revelan colectivamente una arquitectura neuronal detallada, enfatizando los patrones de proyección axonal.

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La sonicación-facilitado Inmunofluorescencia tinción de etapa tardía embrionario y larval<em&gt; Drosophila</em&gt; Tejidos<em&gt; In Situ</em

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Describimos un método para el rastreo retrógrado de las neuronas motoras embrionarias Drosophila utilizando colorantes fluorescentes lipofílicos.

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