Optogenética perturbación de la actividad neuronal con la iluminación láser en semi-intacta
4 de julio de 2013
Aquí se describe un protocolo para la manipulación optogenética de la actividad motoneuronal mientras monitoriza los cambios en la salida del motor (contracción muscular) en semi-intacta Drosophila Larvas de uso de láser dentro de un microscopio confocal convencional. Esta técnica permite a los investigadores para lograr perturbación local de la actividad neuronal en algunas neuromeres para dilucidar la dinámica de circuitos de motor.
En este protocolo, comenzamos alimentando la larva del genotipo adecuado con alimento a base de E que contiene todo el trans A TR. Cada larva se fija y se diseca en una solución salina normal para sustituir la solución salina normal por una solución de Ringer con dos milimoles de calcio, y luego se coloca la preparación de LABA sobre la platina del microscopio. El movimiento de la preparación de LABA disecada se graba en video con una cámara CCD. Al iluminar localmente el sistema nervioso, podemos perturbar la actividad neuronal de un subconjunto de neuronas en un momento específico, mientras monitoreamos el movimiento de la misma preparación inerte.
Hola, soy Tega en el laboratorio del Dr. A. Hola, soy Hi Kosaka, también en el nivel Oph del laboratorio del Dr. A.
La locomoción es un sistema modelo útil para estudiar los circuitos motores. Debido a las técnicas genéticas altamente desarrolladas en este protocolo, realizaremos manipulación optogenética de neuronas motoras mientras monitoreamos el movimiento del nivel. Al utilizar láseres en el microscopio confocal, se puede estimular un subconjunto de neuronas y analizar las respuestas motoras a la perturbación espaciotemporal de las neuronas.
Así que comencemos. Mantenga líneas de moscas de K six G four US CHR two, o K six G four US NPHR en viales de plástico que contengan alimento vivo estándar. Añada una solución TL al alimento a base de levadura en las concentraciones apropiadas y mézclelo bien. Extienda el alimento a base de levadura sobre una placa de agar de jugo de manzana.
Tomar el segundo o tercer ejemplar de SLA de los viales. Colocar el vestíbulo en el medio aate con espacio de levadura que contenga un TR. Cubrir la placa con papel de aluminio para mantener el TR en la oscuridad. Incubar el vestíbulo a 25 grados C durante un período de tiempo adecuado.
Esta es una cámara CCD para la visualización de un laboratorio intacto. Conecte la cámara CCD a un microscopio confocal convencional con una desconexión SEMA. Tome el vestíbulo A TRA y enjuáguelo con agua.
Para eliminar los restos de alimento del cuerpo, coloque la larva en el plato frío con el lado dorsal del protector C hacia arriba. Sujete con alfileres entomológicos la cabeza y la cola. Añada solución salina normal sin calcio.
Realice una pequeña incisión cerca de la cola con tijeras microquirúrgicas a partir de la incisión. Haga un corte longitudinal a lo largo de la línea media dorsal. Tenga cuidado de no dañar el cordón nervioso ventral y los nervios periféricos.
Realice una pequeña incisión lateral del alfiler en cada esquina de la pared corporal diseccionada. Retire los órganos internos, excepto el cerebro y el cordón nervioso ventral. Sustituya la solución salina normal por solución de ringer con calcio modelo 2 millones.
Coloque un objetivo seco de potencia máxima en el microscopio confocal y coloque la preparación experimental sobre la platina del microscopio. Obtenga una imagen de transmisión de la preparación diseccionada mediante un láser rojo para localizar el cordón nervioso ventral utilizando el microscopio confocal. Defina la región de interés en la imagen de transmisión; el molde de zoom resulta útil para determinar la región específica de interés.
Cambie el conjunto de filtros del microscopio para iluminar con luz de 488 nanómetros o 559 nanómetros. Visualice la pared corporal iluminando la preparación con la lámpara de halógeno. Supervise la preparación con una cámara CCD conectada al microscopio confocal.
Recuerde el movimiento de la pared corporal e intercambie el haz láser solo temporalmente para manipular las actividades neuronales mientras se monitorea el movimiento peristáltico; este movimiento en la misma preparación intacta es observado y grabado por la cámara CCD. Este laboratorio expresa CHL dos en neuronas modernas. Al iluminar uno o dos segmentos del cordón nervioso ventral, se activan las neuronas modernas en esos segmentos, lo que a su vez induce la contracción muscular en los segmentos correspondientes de la pared corporal, estimulando así otros segmentos en el nervio ventral.
El frío induce la contracción de otros segmentos del cuerpo. NPHL se expresó en neuronas motoras cuando unos pocos segmentos del cordón nervioso ventral fueron estimulados con un láser amarillo. La onda propagada se detuvo en el segmento correspondiente de la pared corporal.
La onda luego se reinició desde el segmento detenido cuando se apagó la eliminación con láser. Este protocolo aclara el procedimiento para realizar una perturbación optogenética de la actividad neural con láseres en el mismo nivel circular inact en movimiento. El cordón nervioso ventral y el nervio periférico no deben dañarse durante esta disección para lograr una estimulación suficiente.
La potencia de iluminación debe ajustarse modificando la potencia del láser, la velocidad de escaneo o el número de repeticiones en el microscopio confocal. Este es todo el protocolo. Gracias por verlo y buena suerte en sus experimentos.
Resumen
Este artículo describe un protocolo para la manipulación optogenética de la actividad de las motoneuronas en larvas de Drosophila semilentas. Mediante el uso de láseres en un microscopio confocal, los investigadores pueden monitorear las contracciones musculares y elucidar la dinámica de los circuitos motores.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Optogenética
- Circuitos motores
Antecedentes
- La optogenética permite un control preciso de la actividad neuronal.
- Las larvas de Drosophila sirven como modelo para estudiar circuitos motores.
- Comprender la salida motora es fundamental para obtener conocimientos sobre la dinámica neural.
- Esta técnica utiliza microscopía confocal para la monitorización en tiempo real.
Objetivo del estudio
- Manipular la actividad de las motoneuronas mediante optogenética.
- Observar los cambios en la contracción muscular en respuesta a perturbaciones neuronales.
- Analizar la dinámica de los circuitos motores en una preparación semientera.
Métodos Utilizados
- Preparación de larvas de Drosophila con modificaciones genéticas específicas.
- Diseción y montaje de larvas sobre la platina de un microscopio.
- Uso de láseres para estimular neuronas específicas mientras se monitorean las contracciones musculares.
- Grabación de respuestas motoras mediante una cámara CCD.
Resultados principales
- La iluminación local de la médula espinal indujo contracciones musculares.
- La perturbación de la actividad neuronal provocó cambios observables en la locomoción.
- Las respuestas variaron según el momento y la ubicación de la estimulación.
- El protocolo elucidó con éxito la dinámica de los circuitos motores.
Conclusiones
- Este protocolo proporciona un marco para estudiar los circuitos motores en Drosophila.
- La manipulación optogenética es eficaz para analizar la dinámica neuronal.
- Estudios futuros pueden basarse en este método para explorar interacciones neuronales más complejas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La perturbación optogenética precisa en larvas de Drosophila semilentas permite la elaboración de mapas de alta resolución de la función de los circuitos neuronales durante el comportamiento activo. Este enfoque mejora la confianza predictiva en la validación de objetivos al aislar el impacto causal de ensamblajes neuronales específicos sobre la salida motora. El método posibilita la reducción mecanicista de riesgos en la etapa inicial del descubrimiento, orientando las decisiones de cartera para el desarrollo de compuestos neuroactivos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación con resolución espacial y temporal de la función de circuitos neuronales en un sistema genéticamente accesible.
- Apoya la validación funcional de dianas neuronales candidatas mediante la vinculación de la actividad con salidas motoras cuantificables.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas al aislar los efectos de subconjuntos específicos de neuronas sobre el comportamiento.
- Mejora la confianza predictiva en la selección y triaje de dianas posteriores.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Establece una plataforma validada y reproducible para cuantificar las respuestas motoras a la perturbación neural.
- Permite la estandarización de los parámetros de estimulación optogenética para el desarrollo de ensayos.
- Proporciona lecturas cuantitativas basadas en video, adecuadas para análisis comparativo entre condiciones experimentales.
- Facilita la evaluación confiable de compuestos neuroactivos en un sistema controlado y semientero.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea la manipulación del circuito neuronal con fenotipos motores relevantes para la enfermedad, cuando sea aplicable.
- Permite la continuidad desde el descubrimiento genético hasta la validación preclínica funcional en un organismo modelo.
- Apoya el avance ajustado al riesgo de dianas neurobiológicas basado en datos de resultados funcionales.
- Proporciona conocimientos mecanicistas que orientan estrategias de biomarcadores traslacionales.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este protocolo optogenético se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la prueba inicial de hipótesis hasta la identificación de compuestos líder y la validación preclínica de dianas neuroactivas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya pruebas basadas en hipótesis de la función neuronal y el mapeo de vías en un sistema vivo y en movimiento.
- Selección: Proporciona datos cuantitativos y reproducibles de la actividad motora para la estandarización de ensayos y la selección de compuestos.
- Análisis: Permite la comparación estadística de las respuestas motoras bajo perturbaciones neuronales definidas.
- Investigación Traducional: Conecta la manipulación genética con la fenotipificación funcional relevante para modelos preclínicos.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma reutilizable para la validación iterativa de objetivos y estudios mecanicistas en diversos programas de neurobiología.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos neuronales.
- Valor operativo: Estandariza la perturbación optogenética y las lecturas conductuales cuantitativas para flujos de trabajo escalables.
- Valor estratégico: Informa las decisiones de avance o interrupción y mejora la eficiencia del capital al reducir los riesgos asociados a objetivos neurobiológicos en etapas tempranas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de programas de descubrimiento de agentes neuroactivos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en optogenética, genética de Drosophila y microscopía confocal.
- Necesita acceso a microscopía confocal con iluminación láser y captura de video de alta resolución.
- Exige una estandarización rigurosa entre equipos de los protocolos de disección, iluminación y grabación.
- Puede requerir adaptación para diferentes poblaciones neuronales o paradigmas conductuales.
- Depende del control preciso de los parámetros de iluminación y del manejo cuidadoso del tejido para evitar efectos confusos.
