Name: Optogenética perturbación de la actividad neuronal con la iluminación láser en semi-intacta Drosophila Las larvas in Motion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Aprende a manipular la actividad motoneuronal mediante optogenética en larvas semi-intactas de Drosophila utilizando iluminación láser. Este método permite analizar la dinámica de circuitos motores en tiempo real.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por una subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica en áreas innovadoras &quot;Mesoscopic neurocircuitry&quot; (N º 22115002) y &quot;Red de Ciencia del Cerebro Integral&quot; (No. 221S0003) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia, y Tecnología de Japón para la AN y subvención-en-Ayudas a Jóvenes Científicos (B) (N º 21700344), de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSP) de Hong Kong

1. Preparación larvas <ol><li> Mantener volar líneas de OK6-Gal4, UAS-ChR2 o OK6-Gal4, UAS-NpHR2 en frascos de plástico que contienen los alimentos marcha estándar. </li><li> Levadura Spread pasta que contiene todo-trans retinal (ATR) en concentraciones adecuadas (1 mM de ChR2, 10 mM de NpHR2 (&quot;NpHR&quot; para abreviar) en una placa de agar jugo de manzana. </li><li> Recoge 2 ª o 3 ª instar larvas de los viales y los puso en el plato ATR que contiene. </li><li> Criarlos a 25 ° C en la oscuridad durante un período adecuado de tiempo (1 día para ChR2, 2 días para NpHR.) </li></ol> 2. Configuración Microscopio <ol><li> Conecte una cámara CCD (XCD-V60, Sony) a un microscopio confocal convencional (en nuestro caso, FV1000, Olympus) con un accesorio de montaje C (ampliación 0.35x). </li><li> Si hay una obturación a lo largo de la trayectoria de la luz de la lente del objetivo a la cámara CCD, que se cierra durante el escaneo láser, quitar con cuidado. Como este paso depende de los microsfrente de configuración, póngase en contacto con el fabricante del microscopio para el apoyo técnico, si es necesario. </li></ol> 3. Disección <ol><li> Enjuague las larvas ATR-alimentados con agua para eliminar restos de alimentos del cuerpo. </li><li> Ponga la larva en un plato recubierto Sylgard, lado dorsal hacia arriba (el lado dorsal tiene dos tubos traqueales que ejecutan longitudinalmente, uno a cada lado de la línea media dorsal). El espesor de la Sylgard es de aproximadamente 5 mm. </li><li> Inserte un pasador de insectos (patas de insectos Austerlitz, Φ0.10mm, acero) en la cola entre los tubos traqueales con forceps (# 5 Inox, FST por Dumont, Suiza). Los pasadores, unos 10 mm de largo, se deben doblar o cortar para ser lo suficientemente corto (~ 2 mm de largo) para evitar golpear y dañar la superficie de la lente del objetivo. A continuación, poner el segundo pasador de insectos en la cabeza de la larva cerca del gancho de la boca, negro garra-como la estructura en el extremo anterior. </li><li> Añadir Ca 2 + solución salina libre normal (NaCl 140 mM, KCl 2 mM, MgCl2 6 mM, HEPES-NaOH 5 mM,Sacarosa 36 mM (pH 7,1)) para mantener la larva húmedo. </li><li> Haga una pequeña incisión cerca de la cola con unas tijeras micro (MB-50-7, Napox, Japón). </li><li> A partir de la incisión, hacer un corte longitudinal a lo largo de la línea media dorsal hacia la cabeza. Tenga cuidado de no dañar el cordón nervioso ventral (VNC) y axones. </li><li> Haga una pequeña incisión en la cabeza lateralmente. </li><li> Coloque 4 clavijas en cada esquina de la bodywall diseccionado. La pared del cuerpo se debe estirar lo suficiente para visualizar un patrón segmentario de la pared del cuerpo, pero no tanto como para impedir movimiento peristáltico. </li><li> Eliminar los órganos internos, excepto para el cerebro y el VNC y enjuagar la muestra con solución salina normal Ca 2 +-libre. </li><li> Ajuste la orientación del cordón nervioso ventral al ser bilateralmente simétrico mediante el cambio de la posición y orientación de los pins de insectos en la pared del cuerpo. Para fijar la posición del cordón nervioso ventral, insertar un pasador a través del tejido entre el cerebro y la boca hacia abajo para enganchar el Sylgard. </li> &lt;li&gt; Reemplazar el buffer con 2 mM Ca 2 + solución de Ringer (NaCl 130 mM, KCl 5 mM, MgCl 2 2 mM, CaCl2 2 mM, HEPES-NaOH 5 mM, sacarosa 36 mM (pH 7,3)). </li></ol> 4. De imágenes con láser de iluminación <ol><li> Adjuntar una lente objetivo seco 4x (UPlanSApo 4x, NA 0.16, Olympus, Japón) en el microscopio confocal y establecer la preparación larva en el escenario. </li><li> Obtener una imagen de transmisión de la preparación disecada con un láser rojo (633 nm) para localizar el cordón nervioso ventral mediante microscopio confocal. Para este análisis, asegúrese de no utilizar un láser de 488nm o 559nm, que induce la estimulación no deseada de ChR2 o NpHR, respectivamente. </li><li> Definir la región de interés (ROI) en la imagen de transmisión. Modo zoom podría ser útil para la determinación detallada de la ROI. </li><li> Cambiar el conjunto de filtros del microscopio para iluminar con la luz 488nm o 559nm. </li><li> Ilumine la preparación con una lámpara halógena para visualizar la pared del cuerpo. Thpreparación de correo puede ser controlado con una cámara CCD adjunta al microscopio confocal. </li><li> Registre el movimiento de la pared del cuerpo y conmutar el haz de láser dentro y fuera mientras se monitoriza el movimiento. </li></ol>

<ol><li>Cattaert, D., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+the+central+generator+of+locomotor+rhythm+by+noncompetitive+NMDA+receptor+antagonists+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila larvae.</a> J. Neurobiol. 48, 58-73 (2001).</li>
<li>Fox, L. E., Soll, D. R., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+and+modulation+of+locomotion+pattern+generators+in+Drosophila+larvae%3A+effects+of+altered+biogenic+amine+levels+by+the+tyramine+beta+hydroxlyase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coordination and modulation of locomotion pattern generators in Drosophila larvae: effects of altered biogenic amine levels by the tyramine beta hydroxlyase mutation.</a> J. Neurosci. 26, 1486-1498 (2006).</li>
<li>Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+TRP+channel+NompC+in+Drosophila+larval+and+adult+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion.</a> Neuron. 67, 373-380 (2010).</li>
<li>Gomez-Marin, A., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+sensation+during+orientation+behavior+in+the+Drosophila+larva%3A+more+sense+than%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than.</a> Curr. Opin. Neurobiol. , (2011).</li>
<li>Gershow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+airborne+cues+to+study+small+animal+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Controlling airborne cues to study small animal navigation.</a> Nat. Methods. , (2012).</li>
<li>Suster, M. L., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+assembly+of+a+central+pattern+generator+without+sensory+input%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input.</a> Nature. 416, 174-178 (2002).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+in+neural+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71, 9-34 (2011).</li>
<li>Miesenbock, G., Kevrekidis, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+and+control+of+genetically+designated+neurons+in+functioning+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical imaging and control of genetically designated neurons in functioning circuits.</a> Annu. Rev. Neurosci. 28, 533-563 (2005).</li>
<li>Schroll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).</li>
<li>Hwang, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li>
<li>Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+dynamics+of+neuronal+activation+by+Channelrhodopsin-2+and+TRPA1+determine+behavioral+output+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae.</a> J. Neurophysiol. 101, 3075-3088 (2009).</li>
<li>Pulver, S. R., Hornstein, N. J., Land, B. L., Johnson, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+in+the+teaching+laboratory%3A+using+channelrhodopsin-2+to+study+the+neural+basis+of+behavior+and+synaptic+physiology+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Physiol.+Educ%22%5BJournal%5D)">Optogenetics in the teaching laboratory: using channelrhodopsin-2 to study the neural basis of behavior and synaptic physiology in Drosophila.</a> Adv. Physiol. Educ. 35, 82-91 (2011).</li>
<li>Inada, K., Kohsaka, H., Takasu, E., Matsunaga, T., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+dissection+of+neural+circuits+responsible+for+Drosophila+larval+locomotion+with+halorhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optical dissection of neural circuits responsible for Drosophila larval locomotion with halorhodopsin.</a> PLoS One. 6, e29019(2011).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+genes+and+cells+in+the+nervous+system+of+the+fruit+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly.</a> Neuron. 72, 202-230 (2011).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13940-13945 (1073).</li>
<li>Hildebrand, E., Dencher, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+photosystems+controlling+behavioural+responses+of+Halobacterium+halobium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Two photosystems controlling behavioural responses of Halobacterium halobium.</a> Nature. 257, 46-48 (1975).</li>
<li>Takahashi, T., Mochizuki, Y., Kamo, N., Kobatake, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+the+long-lifetime+photointermediate+of+s-rhodopsin+is+a+receptor+for+negative+phototaxis+in+Halobacterium+halobium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Evidence that the long-lifetime photointermediate of s-rhodopsin is a receptor for negative phototaxis in Halobacterium halobium.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 127, 99-105 (1985).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446, 633-639 (2007).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J. Vis. Exp. (24), e1107(2009).</li>
<li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+application+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The development and application of optogenetics.</a> Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Perturbación temporal y local de la actividad neuronal es una técnica muy valiosa para el análisis de la dinámica de la red de circuitos neuronales. En este protocolo, se presenta un método para manipular la actividad neuronal mediante la optogenética utilizando un láser. Alta direccionalidad del láser permite la estimulación optogenética más localizada que la estimulación de campo amplio uso de mercurio o la lámpara de xenón. Aunque iluminaciones láser ya se han aplicado a la optogenética en los estudios anteriores, las configuraciones especiales tales como fibra de vidrio, micromanipulador, y la fuente de láser, se requieren en la mayoría de estudios anteriores. En este protocolo, se utiliza un microscopio confocal convencional para la iluminación local. Dado que el sistema de microscopio confocal es ampliamente utilizado, este método se abrirá la oportunidad de aplicar la optogenética de mayor resolución en muchos laboratorios. El protocolo tiene dos puntos críticos: la disección de larvas y la potencia del láser. En primer lugar, si el cerebro, el cordón nervioso ventral o un nervio motor está dañado duridisección ng, las larvas presentan menos o ninguno movimiento peristáltico espontánea. Por lo tanto, la precisión es esencial, especialmente cuando se hace una incisión en el lado dorsal con tijeras de primavera y la eliminación de los órganos internos con fórceps. Detalles acerca de la disección se ha informado anteriormente 21. En segundo lugar, si la estimulación es suficiente para ser logrado, una potencia de láser de alrededor de 0,1 ~ 1 mW / mm 2 para ChR2 o 1 se requiere ~ 10 mW / mm 2 para NpHR. Se evaluó la potencia del láser como la potencia total de la luz por debajo de una lente de objetivo dividido por una superficie estimada de iluminación. Se midió la potencia total de la luz usando un medidor de potencia (mobiken, Sanwa MI Technos, Japón). Se estimó la superficie de iluminación que circular la constante del cuadrado de la longitud de onda del láser, que más o menos da área iluminada en límite de difracción. Poder eficaz de la iluminación en la muestra se puede ajustar no sólo por la potencia de la salida del láser, sino también por el cambio de la velocidad de exploración y entumecidoer de repeticiones. Se examinaron láser con 20-100 microsegundos / pixel de 63 veces. Además, el nivel de expresión de la optogenética proteína y la cantidad de ATR también son críticas para la eficiencia de la estimulación. En consecuencia, si las larvas no mostró respuesta optogenética, los siguientes puntos deben ser revisados ​​y corregidos: 1) la potencia del láser (mediante la optimización de sistema de microscopio), 2) el nivel de expresión de la proteína optogenética (marcando genotipo y temperatura de cría), y 3) la cantidad de ATR (mediante el ajuste de la concentración de ATR y período de alimentación). NpHR requiere mayor concentración de ATR que ChR2 hace por razones desconocidas 13. ChR2 funciona bien en larvas criadas en alimentos que contienen menor ATR (por ejemplo, 0,1 mm) que se describe aquí (1 mM). Como la alimentación de las larvas a 1 mM ATR es suficiente para hacer ChR2 foto-reactivo, se recomienda esta concentración para el primer juicio en ChR2 experimentos. La concentración de ATR posteriormente se puede titular por debajo de 1 mM. En cuanto a la duración de la exposición de ATR, le recomendamosla duración se describe aquí para el control de optogenético robusta. A menudo fallamos en observar la respuesta optogenetic cuando se alimentan las larvas de ATR de menor duración. En este protocolo, iluminación con láser y la adquisición de imágenes son operados por un equipo independiente. Por lo tanto, la detección clara del patrón espacio-temporal de iluminación láser por la cámara CCD es fundamental para el análisis de datos. Si el punto del láser o de la línea es tenue imagen CCD, usted debe optimizar la potencia de la lámpara halógena y el valor de la ganancia de la cámara CCD para visualizar la iluminación láser manteniendo pared del cuerpo visible. Iluminación Spatiotemporal muestra en este protocolo proporciona información sobre circuitos de motores de larvas, sin embargo, el método tiene algunas limitaciones. En cuanto al aspecto &quot;espacial&quot;, la ubicación de la iluminación se graba la imagen CCD de bajo aumento que se usa para grabar en vídeo los movimientos de la pared del cuerpo de. En consecuencia, el área de iluminación puede ser asignado a nivel de segmento, pero no a nivel celular. En cuanto a la &quot;temporal &quot;aspecto, lapso de tiempo entre el cambio en la exploración por láser microscopio confocal y la iluminación por láser depende del sistema de microscopio confocal de barrido y condiciones. Por consiguiente, se requiere algunas pruebas por prueba y error para ajustar la sincronización de iluminación. Desde el momento de la iluminación puede se determinará de imagen CCD de películas con el software adecuado como ImageJ, el factor crítico en la resolución temporal es la velocidad de fotogramas de la cámara de imagen CCD. Normalmente nos fijamos la velocidad de fotogramas de 7,5 a 15 fotogramas por segundo. Los avances en herramientas optogenetic nos dan la oportunidad de modificar este protocolo. Utilizamos 3 º estadio las larvas poseen OK6-Gal4 y UAS-ChR2 [H134R] o UAS-NpHR2. Otras herramientas optogenética en lugar de ChR2 [H134R] o NpHR2 como ChR2 [T159C/E123T], NpHR3 o Arch pueden aumentar la eficiencia de la actividad de control 22. Además, el uso de otras líneas Gal4 o analizar en otras etapas de desarrollo puede dar más información acerca de la circui motorts. En este protocolo, la actividad motora se controló por imágenes de transmisión de la contracción bodywall con una cámara CCD. La actividad de las neuronas motoras con moléculas fluorescentes sensibles al calcio (por ejemplo GCaMP) también se puede controlar directamente, mientras que la manipulación de la actividad neuronal con ChR2 o NpHR. En este caso, iluminación de luz azul en un área amplia y una cámara CCD de alta sensibilidad (por ejemplo, cámara EMCCD) se utiliza en lugar de una lámpara de halógeno y la cámara CCD normales se ha descrito anteriormente en este documento. Para mejorar la resolución espacial de la estimulación durante la monitorización movimiento bodywall, utilizando una lente de objetivo adicional puede ser un método más avanzado: iluminación del cordón nervioso ventral por una lente de objetivo de gran aumento (por ejemplo, 40x) de encima de la muestra y el seguimiento bodywall por la lente de bajo aumento (por ejemplo, 4x) debajo de la muestra. Este sistema de doble lente puede permitirnos para estimular el sistema nervioso de una mayor resolución espacial. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; El protocolo que se muestra aquí se puede aplicar a otros circuitos neuronales, herramientas optogenetic proporcionadas pueden ser expresados ​​en el sistema nervioso y preparación en la que luz suficiente puede ser entregado en el tejido neural se pueden establecer.

Locomoción Delantero peristáltica en larvas de Drosophila se produce por la propagación de la contracción muscular de posterior a segmentos anteriores. Este movimiento se realiza por la activación secuencial de las neuronas motoras en el cordón nervioso ventral a lo largo del eje del cuerpo longitudinal. Para examinar el circuito detrás de esta actividad de propagación modelado, perturbaciones locales de la actividad neuronal podría ser un enfoque informativo. A pesar de ensayo farmacológico puede controlar sustancia específica, tales como neurotransmisores, en el tejido neural, el efecto de los fármacos farmacológicos puede ser similar entre los segmentos casi todos debido a que el cordón nervioso ventral larvas es estructura repetitiva compuesto de neuromeres similares a lo largo del eje longitudinal. Alternativamente, se podría expresar optogenético o moléculas de la sonda sensibles a la temperatura en un pequeño número de segmentos. Sin embargo, tales GAL4 líneas específicas son muy difíciles de generar. Aquí presentamos un método para manipular las neuronas en pocos segmentos utilizando iluminación láser. Tomando ventaja de la iluminación espacialmente confinados en microscopía confocal, se puede perturbar la actividad de las neuronas en un área local. Combinado con el patrón de expresión de la sonda por subconjuntos de GAL4 líneas específicos de neuronas, este método de iluminación con láser mejora en gran medida la resolución espacial de la perturbación. Y debido a que este método sólo requiere de un microscopio confocal convencional, la compra de equipo de laboratorio adicional no suele ser necesario. Usando esta técnica, se examinó el papel de la actividad neuronal del motor durante la propagación de la salida del motor 13. Mediante el bloqueo de la actividad de las neuronas motoras en algunos segmentos durante el movimiento peristáltico, hemos podido comprobar si es necesaria la actividad de las propias neuronas motoras para la propagación de la señal de salida del motor. Bloqueo local y transitoria de las neuronas motoras detenido la propagación del movimiento peristáltico. Después de retirar el bloqueo, propagation apareció en el segmento en el que la ola había sido detenido. Este fenómeno sugiere que sin la activación de las neuronas motoras, la onda de propagación no puede progresar a lo largo del cordón nervioso ventral más lejos, y por lo tanto es necesario para el movimiento peristáltico de la activación de las neuronas motoras. Hemos informado anteriormente de datos detallados y debates sobre este fenómeno en Inada et al. (2011) 13. Aquí, se describe el método para perturbar la actividad neuronal interactiva mientras se monitoriza el movimiento de las larvas diseccionado. Usando varias líneas GAL4 y series de patrones espacio-temporales para la manipulación de la actividad, se puede investigar la lógica de circuitos a través de las propiedades de respuesta de perturbación del circuito del motor.

<table><tbody><tr><td>Microscopio BX61WI</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>Fluoview FV1000 sistema confocal</td><td>Olympus Corporation</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Cámara CCD</td><td>Sony</td><td>XCD-V60</td><td></td></tr><tr><td>all-trans retinal</td><td>Sigma</td><td>R2500-500MG</td><td>200 mM stock en 95% EtOH</td></tr><tr><td>Silpot184</td><td>Dow Corning Toray</td><td>3255981</td><td></td></tr></tbody></table>

optogenética perturbación de la actividad neuronal con la iluminación láser en semi-intacta<em&gt; drosophila</em&gt; las larvas in motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Larvas de Drosophila locomoción es un sistema modelo espléndida en desarrollo y fisiológicos neurociencia, en virtud de la accesibilidad genética de los componentes neuronales subyacentes en los circuitos de 1-6. Aplicación de la optogenética 7,8 en el circuito neural larval nos permite manipular la actividad neuronal de manera estampadas espacial y temporalmente 9-13. Típicamente, las muestras son ampliamente iluminadas con una lámpara de mercurio o LED, por lo que la especificidad de las neuronas diana es controlado por binarios sistemas de expresión de genes tales como el sistema Gal4-UAS 14,15. En este trabajo, para mejorar la resolución espacial de &quot;resolución sub-genética&quot;, que localmente iluminados un subconjunto de neuronas en el cordón nervioso ventral utilizando láseres implementados en un microscopio confocal convencional. Mientras controla el movimiento de la pared del cuerpo de las larvas semi-intacta, que forma interactiva activada o inhibe la actividad neuronal con canalrodopsina 16,17 Or halorhodopsina 18-20, respectivamente. Por iluminación espacialmente y temporalmente restringida del tejido neural, podemos manipular la actividad de las neuronas específicas en el circuito en una fase específica de la conducta. Este método es útil para el estudio de la relación entre las actividades de un conjunto neuronal local en el cordón nervioso ventral y el patrón espacio-temporal de la salida del motor.

<html> Activación local y transitoria de las neuronas motoras con ChR2. Expresamos ChR2 en las neuronas motoras. Los axones de las neuronas motoras que salen de cada proyecto segmento VNC a un segmento correspondiente de la pared del cuerpo. Cuando estimulamos uno o dos segmentos de la VNC con un láser azul, los músculos en los segmentos correspondientes exhibieron contracciones (Figura 1). La inhibición local y transitoria de las neuronas motoras con NpHR. Expresamos NpHR en las neuronas motoras. Cuando estimulamos unos (1 ~ 2) segmentos de la VNC con un láser de color amarillo durante las contracciones musculares peristálticos, la onda de propagación fue detenido en los segmentos correspondientes de la pared del cuerpo (Figura 2). Luego la ola reinicia desde los segmentos detenidos cuando cambiamos la iluminación del láser 13. 50513fig1.jpg &quot;alt =&quot; Figura 1 &quot;fo: content-width =&quot; 5.5in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/50513/50513fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Activación local de las neuronas motoras con ChR2. A. Esquema de la activación local de la preparación de filetes. Mediante la iluminación de luz azul de algunos segmentos del cordón nervioso ventral ChR2 expresan en las neuronas motoras, los músculos de los segmentos correspondientes son contratados (cabeza de flecha). B. Las imágenes de transmisión de una larva diseccionado. Iluminación local del cordón nervioso ventral (cabezas de flecha) induce la contracción segmentaria de músculos de la pared del cuerpo (flechas). <img src="/files/ftp_upload/50513/50513fig2.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50513/50513fig2highres.jpg"/> Figura 2. La inhibición local de las neuronas motoras con NpHR. A. Esquema de la inhibición local de la preparación de filetes. Por amarillo-liluminación ight de algunos segmentos del cordón nervioso ventral NpHR expresan en las neuronas motoras, los músculos durante la contracción espontánea-producido movimiento peristáltico (punta de flecha en la parte superior) están relajados (punta de flecha en la parte inferior.) B. Transmisión de imágenes de una larva diseccionado . Iluminación Local del cordón nervioso ventral (puntas de flecha) relajó los segmentos de pared del cuerpo espontáneamente contratados (flechas).

Aquí se describe un protocolo para la manipulación optogenética de la actividad motoneuronal mientras monitoriza los cambios en la salida del motor (contracción muscular) en semi-intacta<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas de uso de láser dentro de un microscopio confocal convencional. Esta técnica permite a los investigadores para lograr perturbación local de la actividad neuronal en algunas neuromeres para dilucidar la dinámica de circuitos de motor.

Optogenética perturbación de la actividad neuronal con la iluminación láser en semi-intacta<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

En este protocolo, comenzamos alimentando la larva del genotipo adecuado con alimento a base de E que contiene todo el trans A TR. Cada larva se fija y se diseca en una solución salina normal para sustituir la solución salina normal por una solución de Ringer con dos milimoles de calcio, y luego se coloca la preparación de LABA sobre la platina del microscopio. El movimiento de la preparación de LABA disecada se graba en video con una cámara CCD. Al iluminar localmente el sistema nervioso, podemos perturbar la actividad neuronal de un subconjunto de neuronas en un momento específico, mientras monitoreamos el movimiento de la misma preparación inerte.Hola, soy Tega en el laboratorio del Dr. A. Hola, soy Hi Kosaka, también en el nivel Oph del laboratorio del Dr. A.La locomoción es un sistema modelo útil para estudiar los circuitos motores. Debido a las técnicas genéticas altamente desarrolladas en este protocolo, realizaremos manipulación optogenética de neuronas motoras mientras monitoreamos el movimiento del nivel. Al utilizar láseres en el microscopio confocal, se puede estimular un subconjunto de neuronas y analizar las respuestas motoras a la perturbación espaciotemporal de las neuronas.Así que comencemos. Mantenga líneas de moscas de K six G four US CHR two, o K six G four US NPHR en viales de plástico que contengan alimento vivo estándar. Añada una solución TL al alimento a base de levadura en las concentraciones apropiadas y mézclelo bien. Extienda el alimento a base de levadura sobre una placa de agar de jugo de manzana.Tomar el segundo o tercer ejemplar de SLA de los viales. Colocar el vestíbulo en el medio aate con espacio de levadura que contenga un TR. Cubrir la placa con papel de aluminio para mantener el TR en la oscuridad. Incubar el vestíbulo a 25 grados C durante un período de tiempo adecuado.Esta es una cámara CCD para la visualización de un laboratorio intacto. Conecte la cámara CCD a un microscopio confocal convencional con una desconexión SEMA. Tome el vestíbulo A TRA y enjuáguelo con agua.Para eliminar los restos de alimento del cuerpo, coloque la larva en el plato frío con el lado dorsal del protector C hacia arriba. Sujete con alfileres entomológicos la cabeza y la cola. Añada solución salina normal sin calcio.Realice una pequeña incisión cerca de la cola con tijeras microquirúrgicas a partir de la incisión. Haga un corte longitudinal a lo largo de la línea media dorsal. Tenga cuidado de no dañar el cordón nervioso ventral y los nervios periféricos.Realice una pequeña incisión lateral del alfiler en cada esquina de la pared corporal diseccionada. Retire los órganos internos, excepto el cerebro y el cordón nervioso ventral. Sustituya la solución salina normal por solución de ringer con calcio modelo 2 millones.Coloque un objetivo seco de potencia máxima en el microscopio confocal y coloque la preparación experimental sobre la platina del microscopio. Obtenga una imagen de transmisión de la preparación diseccionada mediante un láser rojo para localizar el cordón nervioso ventral utilizando el microscopio confocal. Defina la región de interés en la imagen de transmisión; el molde de zoom resulta útil para determinar la región específica de interés.Cambie el conjunto de filtros del microscopio para iluminar con luz de 488 nanómetros o 559 nanómetros. Visualice la pared corporal iluminando la preparación con la lámpara de halógeno. Supervise la preparación con una cámara CCD conectada al microscopio confocal.Recuerde el movimiento de la pared corporal e intercambie el haz láser solo temporalmente para manipular las actividades neuronales mientras se monitorea el movimiento peristáltico; este movimiento en la misma preparación intacta es observado y grabado por la cámara CCD. Este laboratorio expresa CHL dos en neuronas modernas. Al iluminar uno o dos segmentos del cordón nervioso ventral, se activan las neuronas modernas en esos segmentos, lo que a su vez induce la contracción muscular en los segmentos correspondientes de la pared corporal, estimulando así otros segmentos en el nervio ventral.El frío induce la contracción de otros segmentos del cuerpo. NPHL se expresó en neuronas motoras cuando unos pocos segmentos del cordón nervioso ventral fueron estimulados con un láser amarillo. La onda propagada se detuvo en el segmento correspondiente de la pared corporal.La onda luego se reinició desde el segmento detenido cuando se apagó la eliminación con láser. Este protocolo aclara el procedimiento para realizar una perturbación optogenética de la actividad neural con láseres en el mismo nivel circular inact en movimiento. El cordón nervioso ventral y el nervio periférico no deben dañarse durante esta disección para lograr una estimulación suficiente.La potencia de iluminación debe ajustarse modificando la potencia del láser, la velocidad de escaneo o el número de repeticiones en el microscopio confocal. Este es todo el protocolo. Gracias por verlo y buena suerte en sus experimentos.

optogenetic-perturbation-neural-activity-with-laser-illumination-semi

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video describe la ablación de axones con láser de dos fotones en una larva de Drosophila melanogaster y un ejemplo de protocolo para inducir lesiones e imágenes del sitio de la lesión.

Lesión neuronal inducida por láser de dos fotones: un método para observar la degeneración y regeneración de los axones en larvas de Drosophila

La optogenética permite el uso de la luz para manipular neuronas que están genéticamente modificadas para expresar opsinas específicas, proteínas sensibles a la luz cuya activación por luz desencadena un cambio en el estado de la neurona. En este trabajo describimos un abordaje optogenético en Drosophila utilizando la opsina Channelrhodopsin2. El protocolo de ejemplo presenta un conjunto de ensayos optogenéticos para estudiar los circuitos neuronales detrás del comportamiento de escape de la...

Drosophila Optogenética: un método para manipular circuitos neuronales

Este video muestra un estudio del comportamiento de navegación de las larvas de Drosophila en respuesta a la estimulación optogenética de las neuronas sensoriales olfativas (ORNs). Las larvas transgénicas de Drosophila que expresan canales iónicos sensibles a la luz en los ORN se colocan en agarosa dentro de un campo de comportamiento. La estimulación optogenética con luz abre los canales, provocando una afluencia de cationes que desencadena la transmisión de la señal al cerebro, y se registra...

Comportamiento de navegación de larvas de Drosophila en respuesta a la estimulación optogenética de neuronas sensoriales olfativas

Este video muestra un método para inducir lesiones neuronales específicas en larvas de Drosophila utilizando un láser de alta potencia. Después de colocar la larva bajo un microscopio, un láser de baja potencia escanea las neuronas fluorescentes y luego aumenta la potencia del láser para inducir daño localizado. La lesión se confirma por el aumento de la fluorescencia y la aparición de un cráter en el lugar de la lesión.

Inducción de lesiones neuronales selectivas utilizando un láser de alta potencia en una larva de Drosophila

Codificados genéticamente herramientas optogenético permitir la manipulación no invasiva de neuronas específicas en...

Optogenético estimulación de comportamiento de escape en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aquí ilustramos cómo sola molécula de microscopía de localización foto-activado puede llevarse a cabo en la terminal del nervio motor de un vivo Drosophila melanogaster tercer instar de la larva.

En Vivo Una sola molécula de seguimiento en la Terminal presináptica del nervio Motor del Drosophila

Este protocolo analiza comportamiento navegación de larva de Drosophila en respuesta a la estimulación simultánea de la optogenetic de sus neuronas olfativas. Luz de longitud de onda de 630 nm se usa para activar las neuronas olfativas individuales expresando una rodopsina canal rojo-cambiado de puesto. Movimiento de larvas al mismo tiempo se realiza un seguimiento grabado digitalmente y analizados utilizando el software de medida.

Seguimiento de comportamiento larvario de Drosophila en respuesta a la estimulación de la Optogenetic de las neuronas olfatorias

Este protocolo introduce un ensayo de punto ligero para investigar el comportamiento fototáctico larvario de Drosophila. En este ensayo, se genera un punto de luz como estimulación de la luz, y el proceso de evitación de la luz larval es registrado por un sistema de imágenes basado en luz infrarroja.

Ensayo basado en puntos claros para el análisis de la fototaxis larval de Drosophila

La contractilidad de la actomiosina juega un papel importante en la morfogénesis celular y tisular. Sin embargo, es difícil manipular la contractilidad de la actomiosina in vivo de forma aguda. Este protocolo describe un sistema optogenético que inhibe rápidamente la contractilidad de la actomiosina mediada por Rho1 en embriones de Drosophila , revelando la pérdida inmediata de la tensión epitelial después de la inactivación de la actomiosina in vivo.

Inhibición optogenética de la contractilidad de la actomiosina mediada por Rho1 junto con la medición de la tensión epitelial en embriones de Drosophila

Este artículo presenta métodos para la manipulación optogenética en Drosophila melanogaster, utilizando CsChrimson y GtACR2 para activar y silenciar neuronas específicas. Se describen cuatro experimentos que utilizan la optogenética para explorar los comportamientos termotácticos y gustativos, proporcionando información sobre los mecanismos neuronales subyacentes que gobiernan estos procesos.

Ensayos conductuales para la manipulación optogenética de circuitos neuronales en Drosophila melanogaster

Este protocolo evalúa la actividad sináptica funcional entre parejas neuronales definidas in vivo en el sistema nervioso central de las larvas de Drosophila melanogaster utilizando herramientas codificadas genéticamente. CsLa estimulación optogenética mediada por Chrimson de neuronas sensoriales presinápticas cIVda induce la fotoconversión dependiente de calcio de CaMPARI en interneuronas possinápticas de la Cuenca-4.

Caracterización funcional de parejas pre- y postsinápticas individuales en el sistema nervioso central larvario de Drosophila usando CaMPARI

Aprende a manipular la actividad motoneuronal mediante optogenética en larvas semi-intactas de Drosophila utilizando iluminación láser. Este método permite analizar la dinámica de circuitos motores en tiempo real.

Optogenética perturbación de la actividad neuronal con la iluminación láser en semi-intacta

Explorar más videos