Optogenética perturbación de la actividad neuronal con la iluminación láser en semi-intacta Drosophila Las larvas in Motion

En este protocolo, comenzamos con la alimentación de la larva del genotipo apropiado con alimentos a base de E que contienen todas las TR trans A. Cada laboratorio se fija y se disecciona en una solución salina normal para reemplazar la solución salina normal con una solución de dos mili de calcio y colocar la preparación de LABA en la etapa del microscopio. El movimiento del LABA diseccionado se graba en vídeo con una cámara CCD. Al iluminar el sistema nervioso localmente, podemos perturbar la actividad neurológica de un subconjunto de neuronas en un momento específico mientras monitoreamos el movimiento de la misma preparación inactiva.

Hola, soy Tega en el laboratorio Dr.A. Hola, soy Hola Kosaka, también en dr. Un nivel de Oph de laboratorio.

La locomoción es un sistema modelo útil para estudiar el circuito motor. Debido a las técnicas genéticas altamente desarrolladas en este protocolo, vamos a realizar la manipulación optogenética de las neuronas motoras mientras monitoreamos el movimiento del nivel. Mediante el uso de láseres en el microscopio confocal, se puede estimular un subconjunto de neuronas y analizar las respuestas motoras a la perturbación espacio-temporal de las neuronas.

Así que comencemos. Mantenga líneas de mosca de K six G four US CHR two, o K six G four US NPHR en bios de plástico que contengan alimentos vivos estándar. Agregue una solución de TL a la levadura a base de las concentraciones adecuadas y mezcle bien Unte la levadura a base de un aato de jugo de manzana.

Recoja el segundo o tercer lugar en SLA de los viales. Coloque el vestíbulo en el aate con espacio de levadura que contenga un TR. Cubra la placa con papel de aluminio para mantener un TR en la oscuridad. Cultive el vestíbulo a 25 grados C durante un período de tiempo adecuado.

Se trata de una cámara CCD para la visualización del mismo laboratorio intacto. Conecte la cámara CCD a un microscopio confocal convencional con un desprendimiento SEMA. Recoge el vestíbulo de A TRA y enjuágalos con agua.

Para eliminar los restos de comida del cuerpo, coloque la lava en el plato frío de protección C con el lado dorsal y sujete con alfileres de insectos de la cabeza y la cola. Agregue solución salina normal sin calcio.

Haga una pequeña incisión cerca de la cola con unas microtijeras de la incisión. Haz un corte longitudinal a lo largo de la línea media dorsal. Tenga cuidado de evitar dañar el núcleo nervioso ventral y los nervios periféricos.

Haz una pequeña incisión lateral del alfiler de la cabeza en cada esquina de la pared corporal disecada. Extirpar los órganos internos, excepto el cerebro y el cordón nervioso ventral. Reemplace la solución salina normal con una solución de timbre de calcio modelo de 2 millones.

Coloque una lente de objetivo seco de alta potencia en el microscopio confocal y coloque la preparación del laboratorio en la platina del microscopio. Obtener una imagen de transmisión de la preparación disecada con un láser rojo para localizar el código del nervio ventral mediante microscopio confocal. Definir la región de interés en el molde de zoom de la imagen de transmisión es útil para determinar la región específica de interés.

Cambie el conjunto de filtros del microscopio para iluminar con luz de 488 nanómetros o 559 nanómetros. Visualice la pared del cuerpo iluminando la preparación con la lámpara halógena. Supervise la preparación con una cámara CCD conectada al microscopio confocal.

Recuerde el movimiento de la pared del cuerpo y cambie el rayo láser solo para manipular temporalmente las actividades neuronales mientras monitorea el movimiento, el movimiento peristáltico en la misma preparación intacta es observado y registrado por la cámara CCD. Este laboratorio expresa CHL dos en las neuronas modernas. La iluminación de uno o dos segmentos del núcleo nervioso ventral activa las neuronas modernas en los segmentos, lo que a su vez induce la contracción muscular en los segmentos correspondientes de la pared corporal, estimulando otros segmentos en el nervio ventral.

El frío induce la contracción de otros segmentos del cuerpo. La NPHL se expresó en las neuronas motoras cuando se estimularon con un láser amarillo algunos segmentos del nervio ventral. La onda de propagación se detuvo en el segmento correspondiente de la pared del cuerpo.

A continuación, la onda se reinició desde el segmento detenido cuando se apagó la eliminación por láser. Este protocolo dilucida el procedimiento para realizar la perturbación optogenética de la actividad neuronal con láseres en el mismo nivel circular en movimiento. El código del nervio ventral y el nervio periférico no deben dañarse durante esta disección para lograr una estimulación suficiente.

La potencia de iluminación debe ajustarse cambiando la potencia del láser, la velocidad de escaneo o el número de repeticiones en el microscopio confocal. Este es todo el protocolo. Gracias por mirar y buena suerte en tus experimentos.