Los métodos para realizar cruces en Setaria viridis, Un nuevo sistema de modelo para las gramíneas

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo realizar cruces para cter verus, un nuevo sistema modelo para las gramíneas. Esto se logra seleccionando, recortando y etiquetando primero el pináculo. El segundo paso es castrar la panícula recortada sumergiéndola en un baño de agua a 48 grados centígrados.

A continuación, el pináculo recortado se utiliza como hembra para la polinización por un pináculo que arroja polen. El paso final es cosechar las semillas dos semanas después de la polinización cruzada. En última instancia, se utiliza la tinción Gus de las semillas híbridas putativas para mostrar la eficacia de la técnica.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como la emasculación física, es que es menos invasiva y relativamente fácil de establecer en el laboratorio. Este método ayudará a acelerar la adopción de cter verus como modelo genético al facilitar la realización de cruces. Para comenzar, retire una celda para regar y luego llene una bandeja con celdas de cuatro por nueve con metro Mix 360.

A continuación, rocíe ligeramente las celdas y siembre las semillas en la superficie del suelo, una semilla por celda. Luego cubra las semillas con una capa de tierra, niebla la superficie del suelo de 0,5 centímetros de espesor para humedecerlas y luego riegue los pisos desde el fondo. Siga regando las celdas desde la parte inferior una o dos veces al día después de la siembra de la semilla, teniendo cuidado de no regar en exceso.

Establezca las condiciones de la cámara de crecimiento a 31 grados centígrados durante el día y 22 grados centígrados por la noche con un tratamiento previo de 15 grados centígrados de 8:30 a.m. a 9:00 a.m. También mantenga un horario de luz y oscuridad de 12 horas y establezca la humedad relativa en 50% en estas condiciones. Satter verus a 10.1 florecerá de 21 a 22 días desde la siembra de la semilla. Lo ideal es que la emasculación se realice por la tarde o por la noche.

Seleccione el pentáculo primario en cada planta que tenga de una a cinco flores en flor. A continuación, corta la punta del pentáculo y retira todas las flores de la sección inferior de las secciones proximal, media y base con unas pinzas finas. Si solo tiene una décima a una quinta parte de las flores en flor.

Con el fin de retener la sección inferior de la parte distal, media y superior de la mitad proximal para un mayor recorte, corte la punta y recorte las flores desde la base de la panícula. Si una panícula tiene de un cuarto a la mitad de flores en flor, conserve la sección media proximal para un recorte adicional y corte la sección media distal. Una vez que se haya cortado el pentáculo, use unas tijeras quirúrgicas para recortar ligeramente las cerdas.

Tenga cuidado de retener las cerdas en la región que será polinizada para proteger las flores de posibles daños por calor. Para cada espiguilla, conserve la flor madura superior. El florete superior tendrá una mayor probabilidad de antesis en el momento de la polinización.

Luego retire todas las flores que hayan florecido y todas las flores inmaduras, dejando aproximadamente de 20 a 30 flores por pináculo que se distribuyan uniformemente. A continuación, marque un lado de cada flor con un rotulador permanente rojo. Y registre el número de floretes en el pináculo con la siguiente información, la fecha de emasculación, la duración y la temperatura a la que se realiza la emasculación.

Una vez recortada la panícula, retire todos los macollos de cada planta para asegurar la reasignación de más recursos al desarrollo de la panícula principal. Una hora antes de la emasculación, programe un baño de agua a 48 grados centígrados para el tratamiento térmico. Una vez precalentado, doble suavemente los pentáculos recortados y sumérjalos de tres a cuatro a la vez en agua tibia durante tres a seis minutos.

Tenga cuidado de no romper el tallo del pentáculo. La hoja bandera, que subtiende el pentáculo, no debe entrar en contacto con agua caliente. Esto es para evitar el daño por calor al tejido de la hoja.

Una vez que se haya realizado la emasculación durante el tiempo deseado, retire las panículas del baño de agua y sacuda suavemente el agua de la panícula. A continuación, cubra completamente la panícula castrada con una bolsa de pan microperforada personalizada y asegúrela con un lazo giratorio. Las bolsas de pan microperforadas se pueden personalizar según el tamaño de la panícula.

Finalmente, vuelva a colocar las plantas en la cámara de crecimiento hasta el día siguiente. A las 9:00 a.m. del segundo y tercer día, traslade a los padres femeninos y masculinos no castrados de la cámara de crecimiento al laboratorio para realizar cruces, observar y agregar otro rojo. a las flores que han florecido o están floreciendo.

Con un marcador permanente rojo, registre el número total de flores florecidas por panícula. A continuación, registre la fecha de polinización y el nombre del progenitor masculino en la etiqueta para llevar un registro de los cruces que se han realizado. Observe el momento pico de antítesis en los padres masculinos en nuestras condiciones de laboratorio, las flores en los pentáculos del padre masculino comienzan a abrirse sincrónicamente alrededor de las 10:10 a.m. Una vez abiertas, el esfuerzo completo de la antera y la liberación de polen ocurrirán después de 20 minutos.

Comienza la polinización inmediatamente cuando está amarillenta. Las anteras blancas son visibles en las flores del progenitor masculino. Las polinizaciones se realizan el segundo y tercer día mediante el uso de polinización de panícula a panícula o de antera a polinización de estigma.

Usando una panícula separada mientras el macho frota suavemente la panícula junto con la panícula emasculada para facilitar la polinización y desecha la panícula masculina para evitar la contaminación, repita el proceso de polinización hasta que cada pináculo castrado haya sido polinizado por dos o tres pentáculos. El método más eficaz es la polinización del estigma con fórceps. Elija una flor que esté floreciendo con anteras de color blanco amarillento o recoja anteras y toque físicamente el estigma de la flor en el padre femenino.

Use una flor del padre masculino para polinizar una flor en la panícula emasculada entre las polinizaciones de diferentes padres masculinos. Sumerja las pinzas en etanol al 95%, seguido de un límpialo con toallitas Kim para evitar la contaminación debida al arrastre de polen entre diferentes cruces. Una vez realizada la polinización, cubra la panícula del progenitor femenino con una bolsa de pan microperforada personalizada y asegúrela en la base con un lazo giratorio.

Después de la polinización hasta la cosecha de semillas, coseche las semillas de 14 a 16 días después del día de la polinización y coloque la etiqueta en el mismo sobre que las semillas. Las semillas con marcas rojas en ambos lados representan las semillas que resultaron del cruzamiento genético controlado. Deseche las semillas sin marcas rojas, ya que representan las semillas que resultan de las flores recién desarrolladas.

Después de la emasculación, las semillas con marcas rojas, solo en un lado, probablemente representarán las semillas resultantes de la autopolinización. Finalmente, seque las semillas a 30 grados centígrados durante dos días. Guarde las semillas secas en el laboratorio o, idealmente, en una cámara de semillas.

Cuando esté listo para un análisis más detallado, retire las fisis si es necesario. Los métodos descritos en este video fueron el resultado de numerosos ensayos utilizando diferentes temperaturas y tiempos de tratamiento para optimizar el proceso de emasculación. El éxito de este proceso se midió por el número de semillas híbridas que se obtuvieron.

Seis semillas de uno de los cruces de prueba en los que el padre masculino llevaba un reportero. Aquí se muestran los genes que codifican para la beta glucuronidasa. El gen reportero hace que la semilla se vuelva azul cuando se tiñe, lo que hace que el número de semillas híbridas sea fácil de contar. Una vez dominado, se pueden cruzar hasta 15 pentáculos por día si el procedimiento se realiza correctamente.

Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo realizar cruces en Aria verus.