Name: Viva Imaging Ensayo para la evaluación de los Roles de Ca 2 + Y esfingomielinasa en la reparación de los poros de la formación de toxina Heridas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 25 s
Description: Aprende a utilizar el ensayo de imagen en vivo con FM1-43 para evaluar la reparación de membrana plasmática y los roles del calcio y la esfingomielinasa en células. Este método permite cuantificar con precisión la cinética de reparación.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH R37 AI34867 y R01 GM064625 a NWA Agradecemos al Dr. R. Tweten de la Universidad de Oklahoma para el plásmido de expresión de SLO.

1. Transcripcional silenciamiento de la ASM <ol><li> Semilla de 1,5 x 10 5 células HeLa en 2 ml de medio de crecimiento DMEM (DMEM alto en glucosa con 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM de L-glutamina, 1% de Penn-Strep) en platos inferior 35 mm de vidrio (MatTek) y incubar durante la noche a 37 ° C en el 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Al día siguiente, aspirado fuera de los medios de crecimiento y reemplazarlo con 2 ml de DMEM medio de suero reducido (DMEM con FBS al 4%), al menos 1 hora antes de añadir la mezcla de transfección de ARNsi. </li><li> Prepare 4 tubos para la mezcla de transfección siRNA oligo. En los tubos A y C, añadir 250 l de Optimem reducida suero y 4 l de Lipofectamine RNAiMax, por 35 mm de plato a ser transfectadas. En el tubo B, añadir 250 l de Optimem reducen el suero y 8 l (160 pmoles) de control de contenido GC medio oligo (Control siRNA), por placa de 35 mm a transfectar. En el tubo D, añadir 250 l de Optimem reducen el suero y 8 l (160 pmoles) de SMPD1 oligo (siasmo), por placa de 35 mm to ser transfectadas. Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Combinar los tubos A y B para formar el complejo de transfección de ARNsi de control, y los tubos C y D para el ASM ARNsi. Se incuban las reacciones a temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Añadir las mezclas de reacción de transfección siRNA control y ASM siRNA lentamente, gota a gota, en los platos de fondo de 35 mm de vidrio respectivas y se incuba a 37 ° C / 5% CO 2. A las 24 h después de la transfección, aspirar suavemente de los medios de comunicación y reemplazar con medio de cultivo fresco DMEM. Para knockdown ASM eficiente, los platos deben ser incubadas a 37 ° C / 5% CO 2 durante aproximadamente 31 horas (total 55 horas) antes de imágenes en directo. </li></ol> 2. Preparación de los reactivos para Live Microscopía <ol><li> Preparar una solución de toxina de formación de poros recombinante estreptolisina O (SLO) a una concentración de 100 ng / l en frío 1x PBS sin Ca2 + y Mg2 +. La SLO utilizado en estos ensayos es un constitutively mutantes cisteína activa que no requiere agentes para reducir la actividad, proporcionado amablemente por Dr. Rod Tweten de la Universidad de Oklahoma. La toxina se expresó en E. coli BL21 DE3 y se purificó en condiciones nativas, como se ha descrito previamente 16. </li><li> Preparar la solución de stock FM1-43: Resuspender FM1-43 polvo liofilizado en DMSO para crear una solución 25 mM. </li><li> Preparar Solución A: Se diluye la solución madre FM1-43 en DMEM frío con Ca 2 + a una concentración final de 4 mM (se necesitan 1,5 ml por plato de MatTek) y almacenar en hielo hasta que se necesite. </li><li> Preparar la solución B: Diluir la solución madre FM1-43 en DMEM frío sin Ca mM de EGTA 2 + y 10 (Ca 2 +-DMEM libre) a una concentración final de 4 M (1,5 ml necesarios por plato MatTek) y almacenar en hielo hasta necesaria. </li><li> Pre-caliente (37 ° C) alícuotas de 1 ml de Solución A y Solución B en tubos Eppendorf. </li><li> Mantenga las soluciones de hielo de DMEM con Ca 2 +, y Cun DMEM 2 + libre. </li></ol> 3. Imágenes de células vivas de FM1-43 La afluencia en SLO células tratadas y no tratadas <ol><li> Llenar un tamaño medio contenedor de metal poco profunda con hielo picado, invertir en un recipiente de vidrio grande con hielo, y añadir hielo adicional dejando sólo la superficie del fondo del recipiente metálico expuesto. Coloque una toalla de papel húmeda en la parte inferior de metal expuesto para permitir la transferencia térmica uniforme. </li><li> Tome un plato MatTek tratados con siRNA control (muestra 1) y colóquela sobre la toalla de papel húmeda y fría. Se aspira suavemente fuera todos los medios y lavar 3 veces con frío Ca 2 + libre de DMEM. Después del último lavado, aspirado de todos los medios de comunicación en el plato. </li><li> Para la imagen asociada a la célula FM1-43 en las células no herida con SLO (Muestra 1) en la presencia de Ca 2 +, añadir 180 l de solución fría B al cubreobjetos de vidrio centro de la placa inferior de 35 mm de vidrio y se incuba durante 5 min en hielo (Tabla 1). </li&gt; <li> Coloque el plato MatTek en el escenario de un microscopio confocal calentado a 37 ° C y equipado con una cámara ambiental (que mantiene la temperatura, humedad y niveles de CO 2). Encontrar el campo de las células que serán fotografiadas mirando a través de un 40X NA 1.3 objetiva (Nikon). Si está disponible, active PerfectFocus o un dispositivo similar para corregir la deriva térmica. </li><li> Añadir 1 ml de solución A precalentado suavemente a un lado de la placa de 35-mm y reemplace la tapa de la cámara ambiental (Tabla 1). </li><li> Adquirir imágenes de 4 min a 1 fotograma cada 3 s utilizando el software de imagen apropiada (Volocity en el sistema de hilatura de microscopía confocal de disco UltraView Vox Perkin Elmer). La excitación de FM1-43 se lleva a cabo con una línea de láser de 488 nm utilizando un filtro dicroico con un paso de banda de 488 nm, y la discriminación de emisiones se logra a través del uso de un filtro 527 (W55) de emisión. Niveles de potencia láser y sensibilidad de la cámara se ajustan para lograr la exposición de imagen de 100 ms. </li><li> Repita los pasos 3.2 a 3.6 para detectar FM1-43 en las células tratadas con siRNA control sin herir SLO (muestra 2) en ausencia de Ca 2 +, excepto que en el paso 3.5 Solución B debe añadirse (Tabla 1). </li><li> Para medir FM1-43 afluencia en las células tratadas con ARNsi de control heridos con SLO ya sea en la presencia (muestra 3) o ausencia de Ca 2 + (Muestra 4), ​​añadir 180 l de solución fría de SLO B que contiene al cubreobjetos de vidrio centro de la 35 mm de plato con fondo de cristal y se incuba durante 5 min en hielo como en el paso 3.3. Repetir los pasos 3.2 a 3.6; ajustar la adición de cualquiera de las soluciones A o la solución B en el paso 3.5 (Tabla 1). </li><li> Para determinar el papel de la ASM en reparación de la membrana de plasma, repita los pasos 3.2 a 3.6 usando células siRNA tratados con ASM para todas las condiciones (Muestras 5-8) (Tabla 1). </li><li> Para determinar el papel de la esfingomielinasa recombinante extracelular (SM) en lacinética de la reparación de la membrana plasmática (reflejados por la inhibición de FM1-43 afluencia) (muestras 9-10), se añade SM (0-50 mU) a cualquier solución A o la solución B en el paso 3.5 y luego añadieron a las células durante la células vivas formación de imágenes en un volumen total de 1 ml (Tabla 1). </li></ol> 4. Cuantificación de FM1-43 Afluencia en células <ol><li> Después de las películas han sido adquiridos, medir la intensidad de la fluorescencia intracelular de FM1-43 utilizando el software de análisis de imágenes (Volocity Suite, PerkinElmer). Dibujar una región de interés en la región citosólica de cada celda en el campo y aplicar las herramientas de software para determinar la intensidad de fluorescencia FM1-43 media a lo largo de todos los fotogramas de vídeo. </li><li> Para ajustar las variaciones en el FM1-43 tinción inicial, los datos de cada vídeo se expresan como aumento veces en la intensidad de la fluorescencia con el tiempo, y se representaron gráficamente para cada condición diferente. El aumento de veces en la fluorescencia de cada punto de tiempo individual porde células se calcula como F V / F 0, donde F T es la fluorescencia media en el punto de tiempo específico, y F 0 es la fluorescencia media en el momento t = 0 (figuras 1-2). </li></ol>

<ol><li>Heilbrunn, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeilbrunn%2C+L+%22The+dynamics+of+living+protoplasm%22">The dynamics of living protoplasm</a>. , Academic Press. (1956).</li>
<li>Chambers, R., Chambers, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChambers%2C+R+%22Explorations+into+the+nature+of+the+living+cell%22">Explorations into the nature of the living cell</a>. , Harvard University Press. (1961).</li>
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<li>Tweten, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol-dependent+cytolysins%2C+a+family+of+versatile+pore-forming+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins.</a> Infect. Immun. 73, 6199-6209 (2005).</li>
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<li>Yamaji-Hasegawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+and+pore+formation+of+a+sphingomyelin-specific+toxin%2C+lysenin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligomerization and pore formation of a sphingomyelin-specific toxin, lysenin.</a> J. Biol. Chem. 278, 22762-22770 (2003).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Los primeros estudios sobre el daño y la membrana plasmática de reparación mecánica se basó en diversos mecanismos de las células hiriendo, que van desde dejar caer bolas de cristal, micropipeteo, esquila, rayaduras o arañazos. La lectura de todos estos ensayos fue de tipo cualitativo más que cuantitativo, y no dio información precisa sobre la cinética del mecanismo de reparación. La capacidad de las células para volver a sellar su membrana plasmática después de estas formas de lesión se midió por la presencia o ausenci...

Se ha sabido durante varias décadas que reparación de la membrana de plasma después de la lesión mecánica es un 1,2 Ca 2 +-dependiente proceso. Estudios posteriores mostraron que el Ca 2 + afluencia a través de la herida desencadena un proceso vigoroso de la exocitosis de las vesículas intracelulares en el sitio de la lesión, que se requiere para volver a sellar 3,4. Se utilizó la tasa de pérdida de un colorante fluorescente cargado en el citoplasma de las células para evaluar la velocidad de la reparación, y llegó a la conclusión de que el resellado se completó dentro de &lt;30 seg después de la lesión 5. Dos modelos fueron propuestos inicialmente para explicar la necesidad de la exocitosis en la reparación de la membrana plasmática: 1) el modelo de &quot;parche&quot;, lo que sugiere que el Ca 2 + afluencia través de la lesión desencadena la fusión inicialmente homotípica de vesículas intracelulares, formando un &quot;parche&quot; de gran tamaño que haría a continuación, ser aplicada a la membrana plasmática para volver a sellar la herida 6 y 2) el modelo de reducción de la tensión, que propuso que la membrana Added por Ca 2 +-dependiente de la exocitosis en las proximidades de la herida reduciría de plasma tensión de la membrana, facilitando de resellado de la bicapa de 7. El papel de la Ca 2 +-desencadenó la exocitosis en la reparación de la membrana plasmática se ve reforzada por estudios que muestran que los lisosomas contienen una molécula de Ca 2 + sensor, sinaptotagmina VII, lo que facilita su exocitosis y reparación de la membrana plasmática de las células lesionadas 8,9,10,11 . Sin embargo, la evidencia adicional ha indicado que la exocitosis por sí sola no era suficiente para promover la reparación de la membrana de plasma. Además de lágrimas mecánicas en la membrana plasmática, una forma frecuente de lesión de las células es la permeabilización por las toxinas formadoras de poros producidos por bacterias o células inmunes 12,13 14,15. A diferencia de las lágrimas mecánicas, proteínas formadoras de poros se insertan en la membrana plasmática que forma un poro estable, proteína forrado de que no se puede volver a cerrarse simplemente mediante la aplicación de un &quot;parche&quot; de la membrana o por reduccióning tensión de la membrana. Curiosamente, los estudios revelaron que las células de mamífero tienen un mecanismo eficiente para reparar su membrana plasmática después de la permeabilización con proteínas formadoras de poros, y este proceso también requiere la presencia de Ca2 + extracelular 12. Este hallazgo plantea la cuestión de si la supresión de poro transmembrana de la superficie celular era también un proceso rápido, como se observa con heridas mecánicas 5. Sorprendentemente, nuestros estudios recientes revelaron que el resellado de las células permeabilizadas con toxinas formadoras de poros tiene propiedades muy similares a la reparación de heridas mecánicas: el proceso requiere extracelular de Ca 2 +, y se completa dentro de ~ 30 seg. La investigación de este proceso con más detalle, recientemente hemos aprendido que, además de Ca 2 +-exocitosis regulada de los lisosomas, reparación de la membrana plasmática implica una forma rápida de la endocitosis, que se activa por la liberación de la enzima lisosomal esfingomielinasa ácida (ASM) y es esencial no sólo para the eliminación de poros transmembrana, sino también para la reparación de heridas mecánicas 16. Para determinar la cinética de resellado celular después de la permeabilización con proteínas formadoras de poros, en nuestro laboratorio hemos adaptado una metodología de formación de imágenes en vivo que se había utilizado previamente para evaluar el resellado de las fibras musculares aisladas de láser-heridos 17. Este ensayo se basa en las propiedades del colorante lipófilo FM1-43, que se intercala de manera estable en el prospecto exterior de las bicapas de lípidos que aumentan en intensidad de fluorescencia. Cuando la membrana bicapa de plasma se interrumpe ganancias de tinte extracelular acceso a membranas intracelulares, proporcionando un ensayo sensible para detectar lesión de la membrana plasmática y reparar 18,16,19,20. Para adaptar este ensayo para la evaluación de resellado celular después de la permeabilización con proteínas formadoras de poros, que las células pre-incubaron a 4 ° C con la toxina bacteriana estreptolisina O (SLO), que se une al colesterol de la membrana 21. Celular síncronopermeabilización puede entonces lograrse fácilmente moviendo las células de hielo para calentar medio en una platina de microscopio calentado, que activa la oligomerización y cambio en la conformación que conduce a la formación de poros transmembrana. Una ventaja de este enfoque, en los ensayos previamente publicados utilizando heridas láser, es que un mayor número de células puede analizarse simultáneamente en un campo microscópico, proporcionando una mejor toma de muestras de la población celular. Dadas las similitudes mecánicas entre el proceso de resellado de células visto después de la lesión mecánica y la permeabilización con toxinas formadoras de poros, el ensayo como se describe aquí proporciona un método muy versátil y potente para factores implicados en el proceso fundamental de la reparación de la membrana de plasma de disección. Como un ejemplo, se muestra que es posible usar este ensayo para identificar los pasos de Ca 2 + dependientes e independientes del proceso de reparación.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fuerte>Reactivo</fuerte></td></tr><tr><td>HeLa 229 línea celular</td><td>ATCC</td><td>CCL2-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Alto Glucosa </td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Alta Glucosa No Calcio</td><td>Invitrogen</td><td>20168</td><td></td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Invitrogen</td><td>T3163</td><td></td></tr><tr><td>Optimem Suero Reducido</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778</td><td></td></tr><tr><td>Medio de control Contenido de GC Oligo ARNi</td><td>Invitrogen 12935300</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SMPD1 Oligo ARNi</td><td>Invitrogen</td><td>HSS143988</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal Gemini-Bioproductos inactivados por calor</td><td></td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Esfingomielinasa de Bacillus cereus</td><td>Sigma</td><td>S7651</td><td></td></tr><tr><td>Platos con fondo de vidrio de 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>Material</fuerte></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Cámara</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C9100-50</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal de disco giratorio</td><td>PerkinElmer</td><td>UltraViewVoX</td><td></td></tr><tr><td>Análisis de software software</td><td>PerkinElmer</td><td>Volocity Suite</td><td></td></tr><tr><td>Cámara ambiental</td><td>Dispositivos de patología Cámara</td> de <td>sistema</td><td></td> LiveCell</tr></tbody></table>

viva imaging ensayo para la evaluación de los roles de ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; y esfingomielinasa en la reparación de los poros de la formación de toxina heridas

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Lesión de la membrana de plasma es un evento frecuente, y las heridas que ser reparado rápidamente para asegurar la supervivencia celular. La afluencia de Ca 2 + es un evento de señalización clave que desencadena la reparación de heridas mecánicas en la membrana plasmática dentro de ~ 30 seg. Estudios recientes revelaron que las células de mamíferos también vuelven a sellar su membrana plasmática después de la permeabilización con formador de poros toxinas en un proceso de 2 +-dependiente de Ca que implica la exocitosis de la esfingomielinasa ácida enzima lisosomal seguido por endocitosis de poro. Aquí se describe la metodología utilizada para demostrar que el resellado de las células permeabilizadas por la toxina estreptolisina O también es rápida y dependiente de Ca 2 + afluencia. El diseño del ensayo permite la sincronización del evento lesión y una medición cinética precisa de la capacidad de las células para restaurar la integridad de la membrana de plasma mediante formación de imágenes y la cuantificación de la medida por la que el colorante liphophilic FM1-43 llega a las membranas intracelulares. Este vivo als ensayoO permite una evaluación sensible de la capacidad de exógenamente añadido factores solubles tales como la esfingomielinasa para inhibir FM1-43 afluencia, que refleja la capacidad de las células para reparar su membrana plasmática. Este ensayo nos permitió demostrar por primera vez que la esfingomielinasa actúa aguas abajo de Ca 2 +-dependiente de la exocitosis, ya que la adición de la enzima extracelular promueve resellado de las células permeabilizadas en ausencia de Ca 2 +.

Las bajas concentraciones de reparación de la membrana plasmática esfingomielinasa (SM) de rescate de bacterias en las células agotadas en esfingomielinasa ácida lisosomal. Usando el ensayo de formación de imágenes FM1-43, que anteriormente mostró que las células deficientes para el ASM enzima lisosomal y expuestos a SLO hiriendo en la presencia de Ca 2 + tienen un defecto de membrana plasmática es rescatado por adición extracelular de la enzima humana recombinante 19. Des...

Formación de imágenes en vivo de las células expuestas a la colorante lipófilo FM1-43 permite la determinación precisa de la cinética por el cual las toxinas formadoras de poros son retirados de la membrana plasmática. Este es un ensayo sensible que puede ser utilizado para evaluar las necesidades del Ca 2 +, esfingomielinasa y otros factores en la reparación de la membrana de plasma.

Viva Imaging Ensayo para la evaluación de los Roles de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Y esfingomielinasa en la reparación de los poros de la formación de toxina Heridas

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar el colorante lipofílico FM 1-43 en imágenes de células vivas para medir la cinética precisa de la eliminación de toxinas de bajo rendimiento de la membrana plasmática. Esto se logra primero preuniendo la toxina a cuatro grados Celsius. El segundo paso consiste en transferir el cultivo a la platina calentada del microscopio y encontrar un plano focal en el que se puedan visualizar las células.A continuación, agregue el medio precalentado adecuado e inmediatamente comience la adquisición de imágenes. El paso final consiste en analizar y cuantificar la fluorescencia intracelular de FM 1-43. En última instancia, este ensayo sensible puede utilizarse para evaluar los requisitos de calcio, fungicida, mielina y otros factores en la reparación de la membrana plasmática.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el daño con láser es que el ensayo de permeación con SLL permite la formación sincronizada de lesiones en la membrana plasmática que son muy uniformes en tamaño tras desencadenar la celulización. La imagen en intervalos de tiempo reales de la entrada de colorantes lipofílicos permite determinar con prec

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Investigación

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Biology

Biología

Aquí descritos son protocolos que se utilizan para visualizar el proceso dinámico de la MG53 mediada por reparación de la membrana celular en todo el animal y en el nivel celular. Estos métodos se pueden aplicar para investigar la biología celular de volver a sellar la membrana plasmática y la medicina regenerativa.

Visualización de MG53 mediada por reparación de la membrana celular mediante In vivo Y In vitro Sistemas de

Este video muestra un ensayo para estudiar la eficiencia de resellado de la membrana plasmática en células de mamíferos. Las células están expuestas a una toxina bacteriana formadora de poros, que forma poros en la membrana celular. En presencia de iones de calcio extracelulares, el poro provoca la entrada de calcio, induciendo eventos de resellado de la membrana. La eficiencia del resellado se evalúa utilizando un colorante de yoduro de propidio que se une al ADN, que solo ingresa a las...

Un ensayo in vitro basado en fluorescencia para medir la eficiencia de resellado de la membrana plasmática

El proceso de las células de curación heridas implica el tráfico de proteínas específicas y los compartimentos subcelulares al sitio de la lesión de la membrana celular. Este protocolo describe ensayos para controlar estos procesos.

Imágenes de células lesión de la membrana y procesos subcelulares implicadas en la reparación

Aquí, se describe un método que utiliza un sistema de infección basados ​​en la inserción de la membrana permeable a estudiar los efectos de estreptolisina S, una toxina secretada producida por estreptococos del grupo A, en los queratinocitos. Este sistema se puede aplicar fácilmente al estudio de otras proteínas bacterianas secretadas en diversos tipos de células huésped durante la infección.

Implementación de un Sistema de infección basada en la inserción de membrana permeable para estudiar los efectos de toxinas secretadas bacterianas en células huésped de mamífero

Herir la membrana de la célula a través de dos fotones láser es un método ampliamente utilizado para evaluar la capacidad mismo-resellado de la membrana y se puede aplicar a múltiples tipos de células. Aquí, describimos un protocolo en vitro en vivo imágenes de cierre de membrana en células de pacientes dysferlinopathy después de la ablación láser de dos fotones.

Ensayo de reparación de membrana de la célula utilizando un microscopio de dos fotones láser

Aquí describimos un análisis basado en la fluorescencia de alto rendimiento que mide la membrana plasmática resellado eficiencia mediante análisis fluorométrico y proyección de imagen en células vivas. Este ensayo puede utilizarse para la detección de drogas o genes diana que regulan el cierre de membrana plasmática en células de mamíferos.

Medida de alto rendimiento de membrana plasmática resellado eficacia en células de mamíferos

Describimos una invasiva en vivo imagen protocolo que es sencilla y económica, utilizando L-012, un análogo de quimioluminiscente luminol, para visualizar y cuantificar las especies de oxígeno reactivo (ROS) generadas en un modelo de ratón por escisión de la herida.

En Vivo Proyección de imagen de especies reactivas de oxígeno en un murino herida modelo

Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de arañazos in vitro utilizando fibroblastos primarios y para un ensayo de cicatrización de heridas de piel in vivo en ratones. Ambos ensayos son métodos sencillos para evaluar la cicatrización in vitro e in vivo de heridas.

Ensayo de migración de arañazos y cámara dorsal Skinfold para análisis In Vitro e In Vivo de sanación de heridas

La inactivación láser asistida por cromóforo (CALI) mediada por AlPcS2a es una poderosa herramienta para estudiar el daño espaciotemporal de vesículas intracelulares (IV) en células vivas.

Un enfoque fotodinámico para estudiar la función de la ruptura de vesículas intracelulares

Aquí se presenta un protocolo que utiliza promastigotes mayores de Leishmania para determinar la unión, citotoxicidad y señalización inducida por toxinas formadoras de poros. Se proporciona una prueba de concepto con estreptolisina O. Otras toxinas también se pueden utilizar para aprovechar los mutantes genéticos disponibles en L. major para definir nuevos mecanismos de resistencia a las toxinas.

Descifrando el mecanismo molecular y la función de las toxinas formadoras de poros usando Leishmania major

El método de punción termoplasmónica integra microscopía confocal, pinzas ópticas y nanopartículas de oro para estudiar las respuestas de las proteínas durante la reparación de la membrana plasmática en células y vesículas unilamelares gigantes. La técnica permite la punción rápida y localizada de la membrana, lo que permite la identificación de proteínas clave y sus funciones en la intrincada maquinaria de reparación de la membrana plasmática.

Un enfoque termoplasmónico para investigar la reparación de la membrana plasmática en células vivas y membranas modelo

Aprende a utilizar el ensayo de imagen en vivo con FM1-43 para evaluar la reparación de membrana plasmática y los roles del calcio y la esfingomielinasa en células. Este método permite cuantificar con precisión la cinética de reparación.

Viva Imaging Ensayo para la evaluación de los Roles de Ca 2 + Y esfingomielinasa en la reparación de los poros de la formación de toxina Heridas (Video) | JoVE Journal

Viva Imaging Ensayo para la evaluación de los Roles de Ca

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