Name: Trasplante De InducidaS Pluripotentes Derivadas De Células Madre Mesoangioblastos Como Progenitores Miógenos En Modelos De Ratón De La Regeneración Muscular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Aprende a evaluar el potencial miogénico de progenitores musculares derivados de células iPSC en modelos de ratón para regeneración muscular. Este método permite estudiar terapias celulares para distrofias.

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Los autores agradecen a Giulio Cossu, Martina Ragazzi y todo el laboratorio por su útil discusión y apoyo, y a Jeff Chamberlain por proporcionar amablemente el vector MyoD-ER. Todos los experimentos con animales vivos se completaron de conformidad y cumplimiento con todas las agencias reguladoras e institucionales pertinentes, reglamentos y directrices. El trabajo en el laboratorio de autores cuenta con el apoyo del Consejo de Investigación Médica del Reino Unido, los proyectos Optistem y Biodesign del 7º Marco de la Comunidad Europea y el Proyecto Italiano Duchenne Parent.

1. Evaluación del potencial miogénico y de injerto
<ol><li>
In vitro: Diferenciación inducida por MyoD<ol>
<li>Generar una línea celular estable de IDEMs transducidos con el vector lentiviral Tamoxifeno-inducible MyoD-ER, titulando la multiplicidad de infección (MOI; por ejemplo, 1, 5 y 50) utilizando la tinción descrita en 1.1.9 (MyHC) como resultado de la eficiencia del procedimiento.</li>
		<li>Recubrir un plato de 3,5 cm con 1 ml de Matrigel al 1% e incubar durante 30 min a 37 °C.</li>
		<li>Lavar el plato dos veces con la semilla mediana 1 x 105 IDEMs transducidas MyoD-ER en el plato de cultivo de tejidos de 3,5 cm e incubar a 37 °C en medio de crecimiento.</li>
		<li>Espere que las células alcancen la confluencia en uno o dos días y luego agregue 1 μM de 4OH-tamoxifeno en el medio de crecimiento(1ª dosis).</li>
		<li>Después de 24 horas, reemplace el medio de crecimiento con un medio de diferenciación complementado con 1 μM de 4OH-tamoxifeno(2ª y última dosis).</li>
		<li>Reemplace la mitad del medio con un medio de diferenciación fresco cada dos días.</li>
		<li>Examine diariamente las culturas para la formación del myotube.</li>
		<li>Después de una semana (5 días en medio de diferenciación), lavar las placas suavemente con PBS y fijar con paraformadehído al 4 % durante 5 min en RT.</li>
		<li>Realizar una tinción de inmunofluorescencia con anticuerpos contra la miosina de cadena pesada (MyHC) para confirmar la presencia de miotubos. Counterstain con un tinte nuclear(e.g. Hoechst).</li>
	</ol>
</li>
</ol>La eficiencia de la diferenciación se evalúa como el porcentaje de núcleos dentro de las células MyHC-positivas: proceder al siguiente paso si la eficiencia es de >50%.
<ol start="2"><li>
In vivo: engraftment en un modelo de regeneración muscular aguda Para evaluar la contribución in vivo de MyoD-ER IDEMs a la regeneración muscular, las células se etiquetan previamente con un vector que codifica para la proteína verde fluorescente (GFP) que permitirá rastrearlos dentro del tejido. Los IDEM de GFP de MyoD-ER se inyectan en los músculos murinos adultos, previamente lesionados con una miotoxina(por ejemplo, cardiotoxina). Para evitar el rechazo inmune contra xenogeneic (tal como HIDEMs) o las células genético manipuladas/corregidas se requiere utilizar ratones inmunodeficientes o immunosuppressed.<ol>
<li>Pretratar a los animales con una inyección intraperitoneal de 3,5 μl/g de 10 mg/ml de tamoxifeno (forma liposoluble) 24 horas antes del trasplante y pretratar las células añadiendo 1 μM de 4OH-tamoxifeno (forma acuosa) en el medio de crecimiento durante la noche antes del día del trasplante.</li>
		<li>Administrar anestesia y analgesia al ratón siguiendo las pautas específicas que regulan los procedimientos quirúrgicos en el centro animal.</li>
		<li>Inyectar 25 μl de cardiotoxina de 100 μM (CTX; de Naja mossambica mossambica; PRECAUCIÓN: sustancia potencialmente dañina) en los músculos tibiales anteriores (TA).</li>
		<li>24 horas después de tratar a los animales con tamoxifeno y CTX, separar las células por tripsinización y recuento.</li>
		<li>Centrifugar las células a 232 x g durante 5 min.</li>
		<li>Lave el pellet celular en PbS libre de Ca2+y Mg2+,centrífuga y luego resuspense suavemente el pellet celular en Ca2+- y PBS libre de Mg2+a una concentración final de 106 células/30 μl, que será el volumen final de cada inyección.</li>
		<li>Inyecte 30 μl de suspensión celular en los músculos previamente lesionados usando una jeringa con aguja de 29 o 30 G. Preste especial atención al retirar la aguja del músculo. Hágalo lentamente, evitando derramar la suspensión celular a través de la pista de la aguja. No trasplantar la AT contralateral y utilizarla como control, inyectando 30 μl de PBS libre de Ca2+y   Mg2+para replicar las condiciones del trasplantado.</li>
		<li>Trate a los animales con tamoxifeno durante seis días adicionales y administre analgesia(por ejemplo, carprofeno) durante dos días adicionales.</li>
		<li>Explantar los músculos a partir de 14 días después del trasplante. Procesar y analizar las muestras como se detalla en los Protocolos 4 y 5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Trasplante en modelos de ratón de distrofia muscular
Este ensayo de trasplante permite evaluar la extensión del injerto de IDEMs en modelos mural de distrofia muscular. Los animales, tratados de la siguiente manera, también pueden ser evaluados para el mejoramiento funcional del fenotipo de la enfermedad. Las pruebas funcionales se pueden realizar a partir de dos semanas después del trasplante. Con el fin de mejorar el injerto considere la realización de ejercicios pretrasplante en cinta (como se describe en el Protocolo 3) y / o inyecciones de células en serie cada tres semanas para 3x(es decir, para un total de 3 inyecciones / músculo).
<ol><li>Trasplante intramuscular<ol>
<li>Pretratar a los animales con una inyección intraperitoneal de 3,5 μl/g de 10 mg/ml de tamoxifeno (formulación liposoluble) 24 horas antes del trasplante y pretratar las células añadiendo 1 μM de 4OH-tamoxifeno (formulación acuosa) en el medio de crecimiento durante la noche antes del día del trasplante.</li>
		<li>Separar por tripsinización, contar y centrifugar las células a 232 x g durante 5 min.</li>
		<li>Lavar el pellet celular en Ca2+- y Mg2+- PBS libre, centrífuga y luego resuspend el pellet en Ca2 +- y Mg2 +- PBS libre a una concentración de 106 células / 30 μl.</li>
		<li>Administrar analgesia y desinfectar la piel del animal (opcional) con un desinfectante a base de povidona yodada o clorexidina. Esto también ayudará a localizar los músculos tibiales anteriores (TA), gastrocnemios (GC) y cuádriceps femorales (QC; específicamente el vasto intermedius).</li>
		<li>Inyecte 30 μl de suspensión celular en los músculos usando una jeringa con aguja de 29 o 30 G. Para la AT, inserte 5 mm de la aguja 2 mm por debajo de la inserción del tendón proximal (dirección craneocaudal) con una inclinación de 15° en relación con la tibia e inyecte lentamente la suspensión celular mientras retrae la aguja (vacíe la jeringa con 2 mm de la aguja todavía dentro del músculo). Para el GC y el QC, repita el mismo procedimiento que se detalla para el TA, siendo la principal diferencia la inserción caudocranial de la aguja 2 mm por encima de la unión miotendinosa del tendón de Aquiles para el GC y 2 mm por encima del tendón distal para el QC (inclinación de 15° con respecto al fémur). Preste atención al retirar la aguja del músculo para evitar derramar la suspensión celular a través de la pista de la aguja. SOLUCIÓN DE PROBLEMAS: En caso de bajo injerto, considere la inyección de ratones juveniles (1-2 semanas de edad)7 con 3 x 105 células / 10 μl (tenga en cuenta que en este caso el tamoxifeno debe administrarse por vía subcutánea).</li>
	</ol></li>
	<li>Trasplante intrarterial Esta parte del protocolo permite evaluar la capacidad de los MIDEMs y HIDEMs para ser entregados en la circulación arterial, cruzar la pared del vaso y contribuir a la regeneración del músculo esquelético en los músculos aguas abajo hasta el sitio de inyección.<ol>
<li>Pretrabate a los animales y las células descritos anteriormente en el paso 2.1.1.</li>
		<li>Separar por tripsinización y filtro con un colador celular de 40 μm (para eliminar los grupos de la suspensión celular en el improbable caso de que la exposición nocturna al tamoxifeno pudiera impulsar la fusión y formación de miotubos de células adyacentes) contar y centrifugar las células a 232 x g durante 5 min</li>
		<li>Lavar el pellet celular en Ca2+- y Mg2+- PBS libre, centrífuga y luego resuspend el pellet en Ca2 +- y Mg2 +- PBS libre con 0.2 Internacional Unidades de heparina sódica (opcional) a una concentración celular final de 106 células/50 μl. Añadir 10% de colorante azul patente (concentración final: 1,25 mg/ml en solución salina normal o Ca2+- y Mg2+- PBS libre) a la solución con el fin de visualizar la distribución de la suspensión celular.</li>
		<li>Administrar anestesia y analgesia al ratón de acuerdo con las directrices que regulan los procedimientos quirúrgicos en el centro animal institucional específico.</li>
		<li>Afeitarse la región inguinal (también conocido como femoral o triángulo de Scarpa) y desinfectar la piel con un desinfectante a base de povidona yodada o clorhexidina.</li>
		<li>Haga una incisión de 5-7 mm y localice el haz femoral: vena, arteria y nervio (el nervio se coloca lateralmente a la arteria y la vena medialmente).</li>
		<li>Retire suavemente la fascia conectiva que cubre el haz con las fuerzas.</li>
		<li>Separe la vena femoral y el nervio de la arteria introduciendo suavemente la punta de un fórceps (o una aguja de 30 G) entre ellos y ampliando progresivamente el agujero. SOLUCIÓN DE PROBLEMAS: La vena femoral es frágil: preste atención a no pellizcarla con el fórceps durante su desprendimiento de la arteria femoral. En caso de hemorragia, drene la sangre con gasa estéril y use un micro cauterizador para facilitar la hemostasia.</li>
		<li>Levante la arteria con una punta de las pinzas y sujete la arteria con la otra punta.</li>
		<li>Perfore la arteria con una jeringa equipada con una aguja de 30 G. Inyecte 50 μl de suspensión celular aguas abajo del área sujetada, a una velocidad de infusión de aproximadamente 5 μl/seg. SOLUCIÓN DE PROBLEMAS: Resuspend cuidadosamente las células en la jeringa antes de la inyección: es vital evitar la precipitación de las células y la formación de burbujas de aire dentro de la jeringa. El diámetro de la arteria femoral es ligeramente menor que una aguja de 30 G: tenga cuidado de no truncar la arteria mientras inserta la aguja. El tinte azul patente permite reconocer la efectividad de la inyección: si se inyecta correctamente, toda la extremidad se volverá rápidamente azul claro.</li>
		<li>Retire lentamente la aguja y los pinzas de la arteria para restaurar el torrente sanguíneo en la extremidad.</li>
		<li>Aplique presión con gasa estéril para evitar sangrado y/o cauterizar según sea necesario.</li>
		<li>Suturar la herida y vigilar a los animales hasta la recuperación de la anestesia.</li>
		<li>Administre la analgesia por 3 días e inspeccione la herida diariamente (en caso de la infección de la herida discuta esto con el personal animal de la instalación y administre los antibióticos según lo requerido).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Medidas de resultado en animales distróficos trasplantados: Prueba de cinta de correr
A partir de dos semanas después del trasplante de células, es posible evaluar el mejoramiento funcional de la capacidad motora de los ratones tratados con las pruebas de cinta de correr. Esta prueba permite la evaluación de la tolerancia al ejercicio /resistencia de los ratones tratados. Un ratón se considera fatigado cuando se pone en el área de descanso durante más de 5 segundos, sin intentar volver a enganchar la cinta de correr después de una serie de 3 estímulos mecánicos consecutivos (uno cada 5 segundos). Las mediciones basales comienzan aproximadamente un mes antes del tratamiento y se utilizan para evaluar la mejoría de cada animal probado. Esta prueba puede ir seguida de ensayos adicionales para controlar la fragilidad de la fibra, la mejora de la fuerza, el injerto, la diferenciación de las células trasplantadas y el mejoramiento morfológico de los músculos trasplantados (consulte Discusión).
<ol><li>Aclimatar a los animales (generalmente tres grupos: tratados, no tratados y de tipo salvaje/ controles no distróficos) al ejercicio antes de la primera medición: establecer la cinta de correr a una velocidad de 6 m/min durante 10 min. Repita el procedimiento cada dos días durante una semana. SOLUCIÓN DE PROBLEMAS: Registre todas las mediciones a la misma hora del día para evitar sesgos debido a los ciclos circadianos.</li>
	<li>Coloque los animales en la cinta de correr, que se ha configurado previamente con una inclinación de 10 °.</li>
	<li>Encienda la cinta de correr, con una velocidad de arranque de 6 m/min (proporcione un estímulo mecánico suave en caso de que los animales no estén dispuestos a comenzar el ejercicio).</li>
	<li>Inicie el temporizador y aumente la velocidad 2 m/min cada 2 min.</li>
	<li>Tan pronto como un animal se acueste en el área de descanso durante más de 5 segundos sin intentar volver a enganchar la cinta de correr, tóquelo suavemente con un palo para estimular el reinicio del ejercicio (ver arriba).</li>
	<li>Registrar el rendimiento (tiempo y/o distancia) de cada animal.</li>
	<li>Repita las mediciones semanalmente o cada 10 días durante al menos 3 veces.</li>
	<li>Repita el mismo procedimiento después del trasplante.</li>
	<li>Analizar los datos de rendimiento comparando la medición de cada animal con su rendimiento basal. Sugerimos trazar los valores en un gráfico como un porcentaje de la capacidad motora promedio en relación con la línea de base y analizarlos mediante una prueba de ANOVA de una o dos vías seguida de una prueba posterior apropiada para comparar los grupos.</li>
</ol>SOLUCIÓN DE PROBLEMAS: use un mínimo de 5 animales/grupos de edad, genotipo y sexo y repita las mediciones durante al menos 3 veces después del trasplante.
4. Evaluación Del Injerto Celular Y Diferenciación En Los Músculos Trasplantados
Los músculos trasplantados y de control se cosechan en el momento adecuado (<2 días para el análisis de injerto a corto plazo, 2-3 semanas para el análisis a medio plazo y >1 mes para el análisis a largo plazo). Si las células trasplantadas se etiquetan con GFP, el injerto en músculos recién aislados se puede evaluar por fluorescencia directa bajo un estereomicroscopio equipado con UV.
<ol><li>Lay y orientar a lo largo del eje vertical músculos recién aislados en la goma tragachanth (6% p/v)</li>
	<li>Deshidratar las muestras en isopentano prechilled durante un minuto, congelarlas en nitrógeno líquido durante al menos 2 min y colocarlas inmediatamente a -80 °C para su almacenamiento.</li>
	<li>Procese las muestras con un criostato para obtener secciones de 7 μm de espesor en portaobjetos polarizados. Muestree la mayoría del músculo en los portaobjetos, recogiendo aproximadamente 8-10 diapositivas con 30-40 secciones / diapositiva. Es recomendable recoger una serie de secciones en un tubo de 1,5 ml para realizar ensayos de biología molecular/bioquímica.</li>
	<li>Evalúe el injerto celular con diferentes tinciones inmunofluorescentes, dependiendo de la configuración experimental. Por ejemplo, en caso de trasplante HIDEM en ratones Sgca-null/scid/bg, manche secciones con: a) un anticuerpo contra Lamin A/C para detectar núcleos de células humanas injertada; b) un anticuerpo contra Laminina para visualizar la estructura general del músculo; y c) un anticuerpo contra Sgca para detectar la restauración donante-derivada de la proteína ausente en el animal distrófico.</li>
	<li>Cuantifique, usando un microscopio de fluorescencia, el número de núcleos donantes por sección muscular dentro y fuera de las fibras musculares y el número de miofiberos esqueléticos derivados de donantes por sección.</li>
</ol>5. Histopatología muscular
Los análisis histopatológicos permiten la evaluación de la estructura morfológica del músculo trasplantado. La mejora arquitectónica en la estructura del tejido se espera como resultado del acercamiento de la terapia celular.
<ol><li>Fije los músculos recién aislados con paraformadehído al 4% durante 1 hora a 4 °C.</li>
	<li>Deshidratar las muestras con un gradiente ascendente de sacarosa(por ejemplo, 7,5-15-30% p/v).</li>
	<li>Deje los músculos durante la noche en la solución de sacarosa más alta.</li>
	<li>Incruste las muestras en Tissue Tek OCT, colóquelas en isopentano prechilled hasta que la OCT se vuelva sólida (evitando la inmersión completa de las muestras), congele en nitrógeno líquido durante al menos 2 min y colóquelas inmediatamente a -80 °C para su almacenamiento.</li>
	<li>Procese las muestras con un criostato para obtener secciones de 7 μm de espesor como se describió anteriormente.</li>
	<li>Manche las secciones con hematoxilina y eosina o tricromo de Masson de acuerdo con los protocolos estándar del fabricante.</li>
</ol>La tinción de hematoxilina y eosina permite calcular los sellos distintivos de la regeneración muscular, tales como: a) el número de miofiberos; b) área de sección transversal; c) el número de miofiberos que contienen un núcleo central. El tricromo de Masson se utiliza para calcular el índice fibrótico, haciendo restando el área total ocupada por los miofiberos esqueléticos del área total de la imagen: el área resultante refleja principalmente el infiltrado conectivo y graso del músculo. Todos los análisis de las imágenes se podían realizar utilizando el software ImageJ (NIH) con la herramienta de medición y el complemento de contador de celdas.

<ol><li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+of+human+skeletal+muscle+are+myogenic+precursors+distinct+from+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 255-267 (2007).</li>
<li>Minasi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meso-angioblast%3A+a+multipotent%2C+self-renewing+cell+that+originates+from+the+dorsal+aorta+and+differentiates+into+most+mesodermal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues.</a> Development. 129, 2773-2783 (2002).</li>
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<li>Wu, S. M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+potential+of+induced+pluripotent+stem+cells+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Harnessing the potential of induced pluripotent stem cells for regenerative medicine.</a> Nat. Cell Biol. 13, 497-505 (2011).</li>
</ol>

F.S.T. ha presentado una solicitud internacional de patente (no. PCT/GB2013/050112) incluyendo parte de la estrategia descrita en este artículo. Recibió financiación de Promimetic y DWC ltd. para su investigación.

Los iPSC pueden ampliarse indefinidamente preservando su potencial de auto-renovación y, por lo tanto, ser dirigidos a diferenciarse en una amplia gama de linajes celulares12. Por esta y otras razones, las células madre/progenitoras derivadas de iPSC se consideran una fuente prometedora para los enfoques autólogos de terapia génica y celular13. Un trabajo publicado previamente de los autores informó de la generación de progenitores miógenos de ratón y humanos a partir de iPSCs con un fenotipo simila...

Los mesoangioblastos (MABs) son progenitores musculares asociados a vasos derivados de un subconjunto de pericitos1-3. La principal ventaja de los MABs sobre los progenitores musculares canónicos, como las células satélite4, reside en su capacidad para cruzar la pared del vaso cuando se entregan intraarteriales y, por lo tanto, contribuir a la regeneración del músculo esquelético en los protocolos de terapia celular. Esta característica ha sido evaluada y confirmada tanto en modelos murinos como caninos de distrofia muscular1,5,6. Estos estudios preclínicos han sentado las bases para un primer ensayo clínico de fase I/II basado en el trasplante intraarterial de MABs HLA-idénticos al donante en niños con distrofia muscular de Duchenne (EudraCT no. 2011-000176-33; actualmente en curso en el Hospital San Raffaele de Milán, Italia). Uno de los principales obstáculos de los enfoques de terapia celular, en los que se necesitan miles de millones de células para tratar el músculo de todo un cuerpo, es el limitado potencial proliferativo del "medicamento" (las células). Por otra parte se ha demostrado recientemente que no es posible obtener MABs de pacientes afectados por algunas formas de distrofias musculares, pues ocurre en la distrofia muscular 2D de la miembro-faja (LGMD2D; OMIM #608099)7.
Para superar estas limitaciones, recientemente se ha establecido un protocolo para derivar células madre/progenitoras similares al MAB a partir de iPSCs humanas y murinas7. Este procedimiento genera poblaciones celulares fácilmente expandibles con una firma de genes vasculares e inmunofenotipos altamente similares a los MABs derivados del músculo adulto. Tras la expresión del factor regulador miogénico MyoD, tanto murino como humano IDEMs (respectivamente MIDEMs y HIDEMs) experimentan diferenciación terminal del músculo esquelético. Para lograr este objetivo, los IDEMs pueden ser transducidos con vectores capaces de impulsar la expresión de MyoD, ya sea de forma constitutiva o inducible8-10. Se utiliza un vector lentiviral que contiene AdNc MyoD fusionado con el receptor de estrógeno (MyoD-ER), lo que permite su translocación nuclear tras la administración de tamoxifeno (un análogo del estrógeno)11. Esta estrategia resulta en la formación de miotubos multinucleados hipertróficos, con alta eficiencia7. En particular, los IDEM son notumorigenic, pueden engraft y diferenciar dentro de los músculos del anfitrión sobre el trasplante y se pueden corregir genético usando diversos vectores(e.g. lentiviruses o cromosomas artificiales humanos), allanando el camino para las estrategias terapéuticas autólogas futuras. La derivación, caracterización y trasplante de IDEMs han sido descritos en la publicación anterior7. Este papel del protocolo detalla los análisis realizados para evaluar la diferenciación miógena in vitro de IDEMs y las medidas subsecuentes del resultado para probar la eficacia de su trasplante en los modelos del ratón de la regeneración del músculo.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fuerte>REACTIVOS</fuerte></td></tr><tr><td>MegaCell DMEM</td><td>Sigma</td><td>M3942</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Sigma</td><td>I3390</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Suero de caballo</td><td>Euroclone</td><td>ECS0090L</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Lonza</td><td>DE14801F</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS Sin calcio/magnesio</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ITS (Insulina-Transferrina-Selenio)</td><td>Gibco</td><td>51500-056</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Solución de aminoácidos no esenciales</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fer-In-Sol</td><td>Mead Johnson</td><td></td> <td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ferlixit</td><td>Aventis</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido Oleico Sigma</td><td></td><td>01257-10 mg</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido linoleico</td><td>Sigma</td><td>L5900-10 mg</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Humano bFGF</td><td>Gibco</td><td>AA 10-155</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Factores de crecimiento reducidos Matrigel</td><td>Becton Dickinson</td><td>356230</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Heparina sódica</td><td>Mayne Pharma</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Solución de azul de tripano</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>HARMFUL</td></tr><tr><td>Tinte azul patentado</td><td>Sigma</td><td>19, 821-8</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-4884</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>TAAB</td><td>P001</td><td>NOCIVO</td></tr><tr><td>Tamoxifeno</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>4-OH Tamoxifeno</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>pLv-CMV-MyoD-ER(T)</td><td>Addgene</td><td>26809</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cardiotoxina</td><td>Sigma</td><td>C9759</td><td>NOCIVA</td></tr><tr><td>Povidona yodo</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Goma tragachante</td><td>MP Biomedicals</td><td>104792</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Isopenthane</td><td>VWR</td><td>24,872,323</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tissue-tek OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>VWR</td><td>27,480,294</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Correderas de vidrio polarizado</td><td>Thermo</td><td>J1800AMNZ</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma</td><td>E4382</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Sigma</td><td>HHS32</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>tricrómico de Masson</td><td>Bio-Optica</td><td>04-010802</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticuerpo de cadena pesada antimiosina de ratón</td><td>DSHB</td><td>MF20</td> <td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti Lamin A/C de ratón</td><td>Novocastra</td><td>NLC-LAM-A/C</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Fluka</td><td>B2261</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti laminina</td><td>de conejo Sigma</td><td>L9393</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>MATERIALES Y EQUIPOS</fuerte></td></tr><tr><td>Sutura antibacteriana adsorbible 4-0</td><td>Ethicon</td><td>vcp310h</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Jeringa de aguja de 30 G</td><td>BD</td><td>324826</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cinta de correr</td><td>Columbus instrumento</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Estrommicroscopio</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Leica</td><td>DMIL LED</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Unidad de isoflurano</td><td>Harvad Apparatus</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fibra óptica</td><td>Euromecs (Holanda)</td><td>EK1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Vet Tech</td><td>C17A1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bisturíes</td><td>Swann-Morton</td><td>11REF050</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pinza quirúrgica</td><td>Fine Scientific Tools</td><td></td><td>5/45</td></tr><tr><td>Cauterizador de alta temperatura</td><td>Bovie Medical</td><td>AA01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>COMPOSICIÓN DE MEDIOS</td></tr><tr><td colspan="4">La composición de los medios se detalla a continuación. Medio de crecimiento de HIDEMs: <ul> <li>MegaCell Dulbecco's Modified Eagle Medium (MegaCell DMEM)</li> <li>5% suero fetal bovino (FBS)</li> <li>2 mM glutamina</li> <li>0,1 mM &beta;-mercaptoetanol</li> <li>1% aminoácidos no esenciales</li> <li>5 ng/ml factor de crecimiento básico de fibroblastos humanos (bFGF)</li> <li>100 UI ml de penicilina</li> <li>100 mg/ml estreptomicina</li> </ul> Alternativamente, si algunos de los reactivos anteriores no están disponibles, los HIDEM se pueden cultivar en: <ul> <li>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</li> <li>10% FBS</li> <li>2 mM glutamina</li> <li>0,1 mM &beta;-mercaptoetanol</li> <li>1% Aminoácidos no esenciales (NEAA)</li> <li>1% ITS (insulina/transferrina/selenio)</li> <li>5 ng/ml humano bFGF</li> <li>100 UI ml de penicilina</li> <li>100 mg/ml estreptomicina</li> <li>0,5 &mu; Ácidos m oleico y linoleico</li> <li>1,5 &mu; M Fe2+ (Fer-In-Sol)</li> <li>0.12 &mu; M Fe3+ (Ferlixit)</li> </ul> medio de crecimiento MIDEMs: <ul> <li>DMEM</li> <li>20% FBS</li> <li>2 mM glutamina</li> <li>5 ng/ml bFGF</li> <li>100 UI ml de penicilina</li> <li>100 mg/ml estreptomicina</ li> </ul> Medio de diferenciación: <ul> <li>DMEM</li> <li>2% Suero de caballo (HS)</li> <li>100 UI ml de penicilina</li> <li>100 mg/ml estreptomicina</li> <li>2 mM glutamina</li> </ul> </td></tr><tr><td colspan="4">Tabla 1. Lista de Reactivos, Materiales, Equipos y Medios.</td></tr></tbody></table>

trasplante de inducidas pluripotentes derivadas de células madre mesoangioblastos como progenitores miógenos en modelos de ratón de la regeneración muscular

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

los iPSCs Paciente-derivados podían ser una fuente inestimable de células para los protocolos autólogos futuros de la terapia celular. Las células madre/progenitoras miógenas derivadas de iPSC similares a los mesoangioblastos derivados del pericito (células madre/progenitoras similares a mesoangioblastos derivadas de iPSC: IDEMs) se pueden establecer a partir de iPSCs generadas a partir de pacientes afectados por diferentes formas de distrofia muscular. Los IDEM específicos del paciente pueden corregirse genéticamente con diferentes estrategias(por ejemplo, vectores lentivirales, cromosomas artificiales humanos) y mejorarse en su potencial de diferenciación miogénica tras la sobreexpresión del regulador de la miogénesis MyoD. Este potencial miógeno se evalúa in vitro con ensayos específicos de diferenciación y se analiza por inmunofluorescencia. El potencial regenerativo de IDEMs se evalúa más a fondo in vivo,sobre el trasplante intramuscular e intrarterial en dos modelos representativos del ratón que exhiben la regeneración aguda y crónica del músculo. La contribución de idems al músculo esquelético del anfitrión entonces es confirmada por diversas pruebas funcionales en ratones trasplantados. En particular, el mejoramiento de la capacidad motora de los animales se estudia con pruebas en cinta de correr. El engraftment y la diferenciación de la célula entonces son evaluados por un número de análisis histológicos y de la inmunofluorescencia en los músculos trasplantados. En general, este trabajo describe los ensayos y herramientas utilizados actualmente para evaluar la capacidad de diferenciación de los IDEMs, centrándose en los métodos de trasplante y las medidas de resultado posteriores para analizar la eficacia del trasplante de células.

Los resultados representativos reportados siguen los principales ensayos in vitro/in vivo representados en el flujo de trabajo en la Figura 1. 48 horas después de la administración de 4OH-tamoxifeno Los núcleos MyoD-positivos son identificables dentro de los IDEMs transducidos por MyoD-ER en cultivo(Figura 2A). A continuación, las células se fusionan y se diferencian en miotubos multinucleados(Figura 2B). Cuando se trasplantan por vía intramuscular a un modelo m...

Células madre pluripotentes inducidas (iPSC)-progenitores miógenos derivados son candidatos prometedores para las estrategias de terapia celular para tratar las distrofias musculares. Este protocolo describe el trasplante y las medidas funcionales necesarias para evaluar el injerto y la diferenciación de mesoangioblastos derivados de iPSC (un tipo de progenitores musculares) en modelos de ratón de regeneración muscular aguda y crónica.

Trasplante De InducidaS Pluripotentes Derivadas De Células Madre Mesoangioblastos Como Progenitores Miógenos En Modelos De Ratón De La Regeneración Muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar el potencial miogénico de progenitores musculares derivados de células madre pluripotentes inducidas en modelos murinos de regeneración muscular aguda y crónica. Esto se logra primero evaluando el potencial miogénico de las células in vitro. El segundo paso consiste en trasplantar las células mediante inyección intramuscular.Alternativamente, las células se inyectan en la arteria femoral mediante un procedimiento microquirúrgico. El paso final consiste en evaluar la mejora funcional del fenotipo distrofico en los animales tratados. Finalmente, se utilizan ensayos de inmunofluorescencia e histología para demostrar el injerto y la contribución funcional de las células donantes a los músculos del hospedador.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regeneración del músculo esquelético, como la investigación de enfoques de terapia celular. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de las distrofias musculares, ya que podrían allanar el camino hacia estrategias de terapia celular autóloga utilizando progenitores DER de células IPS. Aunque este método puede proporcionar información sobre terapias basadas en células madre, puede aplicarse a otros sistemas, como la administración de moléculas, por vía intramuscular o intraarterial, y el posterior análisis del efecto sobre la función y la morfología muscular.La idea de este método surgió cuando nos dimos cuenta de que el cultivo de IPSL podría proporcionar un enfoque para superar algunas de las limitaciones de las células madre adultas, como la disponibilidad a partir de biopsias de tejido y su potencial de expansión. Comience generando una línea celular estable de elementos que hayan sido transducidos con un vector inducible por tamoxifeno que sobreexpresa al regulador de la miogénesis MyoD. Después de recubrir con gel de matri al 1 % y lavar con medio, siembre una placa con las celdas transducidas e incube a 37 grados Celsius en medio de crecimiento. Las células deben alcanzar confluencia en uno o dos días.Cuando estén listas, agregue un micromolar de hidroxi-tamoxifeno al medio de crecimiento. Después de 24 horas, reemplace el medio de crecimiento por medio de diferenciación suplementado con un micromolar de hidroxi-tamoxifeno.Examine diariamente las culturas para la formación de tubos miotubulares y reemplace la mitad del medio con medio de diferenciación fresco. Cambie el medio cada dos días cuando las culturas estén listas. Se utilizan en ensayos de trasplante.Aquí se utilizan ratones distroficos e inmunodeficientes para determinar el grado de injerto en trasplantes intramusculares. Tratar previamente a los animales con una inyección de tamoxifeno 24 horas antes del trasplante. Las células también deben tratarse previamente con tamoxifeno añadido al medio de crecimiento la noche anterior.El día del trasplante, desprender las células mediante tripsina, contarlas y centrifugarlas, lavarlas una vez con PBS antes de la resuspensión, suspendiéndolas en PBS libre de calcio y magnesio hasta una concentración de diez a la sexta células por 30 microlitros. Después de anestesiar al animal y desinfectar la piel, localice el músculo tibial anterior. Identifique el punto de inserción del tendón proximal e introduzca la aguja.Coloque la punta a dos milímetros por debajo de este punto. Introduzca cinco milímetros de la aguja con una inclinación de 15 grados con respecto a la tibia e inyecte lentamente la suspensión celular mientras retira la aguja. Vacíe la jeringa manteniendo dos milímetros de la aguja aún dentro del músculo.Tenga cuidado al retirar la aguja del músculo para evitar derramar la suspensión celular a través del trayecto de la aguja. Siguiendo estos mismos procedimientos, se realizan inyecciones en el gastrocnemio dos milímetros por encima de la unión miotendinosa del tendón de Aquiles y del cuádriceps. Las inyecciones femeninas se realizan dos milímetros por encima del tendón distal para el trasplante intraarterial.Pretender los animales y células con tamoxifeno como se demostró anteriormente. Cuando estén listas para el trasplante, las células se preparan como se mostró previamente, excepto que se filtran antes de la centrifugación. Suspender nuevamente el precipitado en PBS libre de calcio y magnesio y agregar 10% del colorante azul de patente para permitir la visualización de la distribución de la suspensión celular.Resuspenda cuidadosamente las células en la jeringa y elimine todas las burbujas de aire antes de inyectar. Después de la anestesia, afeite y desinfecte el área como se muestra, realice una incisión de cinco a siete milímetros y localice el paquete femoral. Retire suavemente con pinzas la fascia conectiva que cubre el paquete. A continuación, separe cuidadosamente la vena femoral y el nervio de la arteria introduciendo suavemente la punta de una pinza entre ellos y ampliando progresivamente el orificio.La vena femoral es frágil. Tenga cuidado de no pellizcarla durante su separación de la arteria femoral. Una vez separada, levante la arteria con una punta de la pinza y sujete la arteria con la otra punta.Con una aguja de 30 G, puncionar la arteria e inyectar 50 microlitros de la suspensión celular aguas abajo de la zona sujeta con el clamp, a una velocidad de infusión de aproximadamente cinco microlitros por segundo. Retirar lentamente la aguja y la pinza de la arteria para restablecer el flujo sanguíneo hacia la extremidad. Aplicar presión con gasa estéril para evitar sangrado y/o cauterizar según sea necesario.El colorante azul de patente permite el reconocimiento inmediato de una inyección correctamente colocada; si se inyecta correctamente, todo el miembro se volverá azul claro rápidamente, suturar la herida y monitorear a los animales hasta que se recuperen. Administrar analgesia durante tres días e inspeccionar la herida. Los cambios diarios en la capacidad motora de los ratones tratados se evalúan mediante la prueba de cinta rodante. Las mediciones basales comienzan aproximadamente un mes antes del tratamiento y se utilizan para evaluar la mejora de cada animal probado.El primer paso consiste en aclimatar a los animales al ejercicio antes de la prueba. Para ello, ajuste la cinta rodante a una velocidad de seis metros por minuto durante 10 minutos. Repita este procedimiento cada dos días durante una semana.Una vez que estén familiarizados con el dispositivo, ajuste la inclinación a 10 grados y coloque los animales en los carriles de la cinta rodante. Encienda la cinta rodante con una velocidad inicial de seis metros por minuto. Toque suavemente a cualquier animal que no esté dispuesto a comenzar el ejercicio.A continuación, inicie el cronómetro y aumente la velocidad dos metros por minuto cada dos minutos tan pronto como un animal permanezca en el área de descanso durante más de cinco segundos. Sin intentar volver a activar la cinta, tóquelo suavemente con un palo para estimular el reinicio del ejercicio. Se considera que un ratón está fatigado cuando permanece en el área de descanso durante más de cinco segundos sin intentar volver a activar la cinta.Después de una serie de tres estímulos mecánicos consecutivos, uno cada cinco segundos, registre el desempeño de cada animal y repita las mediciones semanalmente o cada 10 días durante al menos tres veces, comenzando dos semanas después del trasplante celular. Repita el mismo procedimiento en los ratones tratados después de la prueba.Utilice comparaciones con la línea base para evaluar los cambios en el rendimiento. 48 horas después de la administración de cuatro dosis de hidroxitamoxifeno, se pueden identificar núcleos positivos para myo de en elementos transducidos con myo DER en cultivo. Como se observa aquí.Después de una semana, las células se fusionan y se diferencian en tubos mioxos multinucleados. Cuando se trasplantan por vía intramuscular en un modelo paralelo de lesión muscular aguda, los elementos contribuyen a la regeneración del tejido observada en la cinta rodante. La prueba de tolerancia al ejercicio muestra una mejora en la capacidad motora de los ratones tratados tras el trasplante.Los análisis ex vivo de músculos trasplantados muestran áreas positivas para GFP que representan el grado de colonización de las IMS en el tejido hospedador, demostrando así que las células donantes se integran en el músculo distrofico. Es importante destacar que las células trasplantadas son capaces de diferenciarse in vivo formando nuevas fibras miológicas esqueléticas. Este ejemplo muestra la expresión de alfa sarcoglicano a partir de IMS corregidas genéticamente en ratones beige skid deficientes en alfa sarcoglicano.La tinción tricrómica de Masson reveló una disminución en la cantidad de tejido fibrotico en el músculo tratado. A continuación, mediante este procedimiento, se pueden realizar métodos como la prueba de FreeWheel, el ensayo con azul de Evans y la mecánica de fibra individual o de músculo completo, con el fin de responder preguntas adicionales sobre la mejora en la capacidad motora voluntaria, la fragilidad de las fibras y la fuerza específica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la capacidad de diferenciación muscular, el potencial de injerto y la eficacia funcional de los progenitores miogénicos derivados de células IPS, utilizando ensayos in vitro, in vivo y ex vivo.

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Investigación

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Bioengineering

Bioingeniería

Seguimiento de Dinámica de injerto muscular en pequeños animales por En Vivo Fluorescente de imágenes

Método para la disociación enzimática, el etiquetado de superficie y la purificación por citometría de flujo de fibro / adipogénico y progenitores miogénica del músculo esquelético murino.

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Reprogramación directa de fibroblastos humanos en mioblastos para investigar terapias para trastornos neuromusculares

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Comparación de dos métodos representativos para la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas en células estromales mesenquimales

Aprende a evaluar el potencial miogénico de progenitores musculares derivados de células iPSC en modelos de ratón para regeneración muscular. Este método permite estudiar terapias celulares para distrofias.

Trasplante De InducidaS Pluripotentes Derivadas De Células Madre Mesoangioblastos Como Progenitores Miógenos En Modelos De Ratón De La Regeneración Muscular (Video) | JoVE Journal

Trasplante De InducidaS Pluripotentes Derivadas De Células Madre Mesoangioblastos Como Progenitores Miógenos En Modelos De Ratón De La Regeneración Muscular

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