Metabólicas etiquetado y de membrana de fraccionamiento para Comparativo Proteómica Análisis de

El objetivo general del siguiente experimento es separar diferentes subcompartimentos de membrana y estudiar su composición proteica diferencial. Esto se logra mediante el etiquetado con isótopos estables de células bajo distintas condiciones, lo que permite diferenciar los tratamientos. En el análisis espectrométrico de masas, como segundo paso, se mezcla el material celular proveniente de los dos tratamientos, lo cual asegura un procesamiento conjunto y reduce la variación entre muestras.

A continuación, los subcompartimentos de la membrana plasmática se purifican y separan mediante centrifugación en gradiente de sacarosa en subcompartimentos estériles, ricos y empobrecidos estériles. Se obtienen resultados de centrifugación en gradiente que muestran abundancias diferenciales de proteínas en los subcompartimentos bajo diferentes tratamientos, basados en datos de espectrometría de masas cuantitativa. La principal ventaja de este protocolo frente a métodos existentes, como el inmunoblot (Western blot), es que podemos registrar cuantitativamente la distribución de miles de proteínas en los subcompartimentos y, de este modo, descubrir nuevos candidatos implicados en procesos de señalización.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que la purificación me de un sistema bifásico es difícil de aprender. La razón de esto es que implica muchos pasos y el control preciso y el manejo cuidadoso son muy importantes. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la señalización al descubrir nuevos candidatos proteicos como reguladores de procesos de membrana. Comience cultivando cultivos de suspensión celular de arabidopsis ana marcados y no marcados según se describe en el protocolo escrito.

Células homogenizadas de aproximadamente un litro de cultivos de suspensión celular de siete días de edad en nitrógeno líquido mezclan cantidades iguales de cultivos celulares congelados marcados y no marcados según el peso fresco en un vaso de precipitados y agregan dos volúmenes de tampón H; inmediatamente coloque el vaso sobre un agitador y agite hasta que el material se derrita y no quede hielo. Filtre el homogenato a través de una capa de tela de mira hacia tubos de centrífuga de 250 mililitros; después equilibre las muestras con tampón H y centrifugue a 10.000 ×g durante ocho minutos. Tras la centrifugación, cargue el sobrenadante en tubos de ultracentrífuga preenfriados con un volumen de aproximadamente 32 mililitros.

Después de equilibrar las muestras con tampón, sedimentar las microsomas mediante centrifugación a 100.000 Gs y cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Tras la centrifugación, retire el sobrenadante, que contiene las proteínas solubles. Se puede guardar una pequeña cantidad de esta fracción para una posterior precipitación de proteínas y análisis subsiguiente de proteínas solubles; re suspenda el sedimento de membrana de cada muestra en la cantidad respectiva de tampón R según se describe en el protocolo escrito y coloque en la parte superior del sistema bifásico U uno.

Si se utiliza el sistema bifásico de seis gramos, cargue exactamente dos gramos del pellet de membrana resuspendido y cargue el mismo volumen de tampón puro R que se usó para la suspensión de resuspensión de la muestra en U2. Mezcle lentamente los tubos U1 y U2 invirtiéndolos 30 veces a una velocidad de aproximadamente una inversión por segundo. Centrifugue las muestras a 1500 Gs y cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Tras la centrifugación, retire la fase superior de U2. Transfiera la fase superior de U1 a U2 antes de repetir la centrifugación utilizando los mismos parámetros. A continuación, transfiera la fase superior de U2 a los tubos de ultracentrífuga, diluya con cinco volúmenes de tampón R y mezcle completamente. Centrifugue las muestras a 200,000 Gs y cuatro grados Celsius durante una hora.

Finalmente, reutilice. Suspender el precipitado de membrana en una pequeña cantidad de tampón T y E para el aislamiento de membranas resistentes a detergentes. Después de verificar la concentración de la fracción de membrana plasmática mediante el ensayo de Bradford, añadir Triton X-100 a la fracción de membrana plasmática en una proporción de detergente a proteína, peso a peso, entre 13 y 15, y una concentración final de detergente entre 0,5 y 1%. Agitar las muestras a aproximadamente 100 RPM y cuatro grados Celsius durante 30 minutos.

Luego, agregue tres volúmenes de sacarosa 2,4 M a un volumen de la membrana plasmática tratada para obtener una concentración final de sacarosa de 1,8 M. Prepare el gradiente de sacarosa en tubos para ultracentrífuga cargando las respectivas soluciones de sacarosa encima de la fracción de 1,8 M. Centrifugue las muestras a 250.000 × g y 4 grados Celsius durante 18 horas. Retire cuidadosamente los tubos de ultracentrífuga del rotor para evitar la alteración de la banda de baja densidad, que puede ser visible como un anillo lechoso en la interfase entre la sacarosa 0,15 M y la 1,4 M.

A veces no se puede ver nada, pero la fracción proteica resistente al detergente aún está presente. Retire una fracción de 0,75 mililitros de volumen desde la parte superior del gradiente, de las fracciones dos y tres, que abarcan los volúmenes de aproximadamente 1,5 mililitros por encima del anillo de interfase y 0,5 mililitros por debajo del anillo de interfase.

Representan la fracción de membrana resistente al detergente. Recoger estas fracciones en tubos Falcon de 15 mililitros. Las fracciones nueve y diez contienen la fracción de membrana soluble en detergente y también pueden recogerse para su comparación.

Para comenzar la extracción de proteínas a partir de la fracción resistente a detergentes, agregue cuatro volúmenes de metanol a las fracciones recolectadas y vortexee completamente. Luego, agregue un volumen de cloroformo antes de volver a vortexear completamente. Finalmente, agregue tres volúmenes de agua y vortexee; centrifugue las muestras a 2000 Gs durante cinco.

Mediante una centrífuga de banco, elimine la fase acuosa por encima de la capa proteica en la interfase. A continuación, agregue tres volúmenes de metanol y vortexee. Retire completamente el sobrenadante S antes de recolectar el precipitado para prepararlo para la digestión en solución.

Comience la digestión en solución disolviendo la muestra en un pequeño volumen de urea seis molar, tiroidina dos molar pH ocho, abreviado como UTU. Utilice el volumen más bajo posible que sea compatible con la muestra. Después de centrifugar las muestras y realizar la digestión según se describe en el protocolo del texto, diluya la muestra con cuatro volúmenes de tris HCl 10 milimolar pH ocho.

Luego, agregue un microlitro de tripsina por cada 50 microgramos de proteína de la muestra e incube durante toda la noche a temperatura ambiente con agitación constante a 700 RPM. Centrifugue las muestras a 4.000 ×g durante 10 minutos. Finalmente, acidifique las muestras hasta una concentración final de 0,2 % de TFA para alcanzar un pH de 2 mediante la adición de aproximadamente una décima parte del volumen de ácido trifuoroacético al 2 %. Para fabricar puntas C18 tipo stage tip, coloque un disco C18 de tamaño micro en una superficie plana y limpia, como una placa de Petri de plástico desechable.

Extraiga un pequeño disco utilizando una aguja hipodérmica de punta roma con un diámetro de 1,5 milímetros. El disco queda adherido dentro de la aguja y puede transferirse a una punta de pipeta. Empuje el disco fuera de la aguja y fíjelo en la parte cónica de una punta de pipeta utilizando un trozo de sílice fundida o un tubo que encaje en el interior de la aguja. Condicione una punta de etapa C18 colocando 50 microlitros de la solución B sobre la punta de etapa preparada.

Gire la punta en la centrífuga a 2000 RPM durante dos minutos. En una centrífuga de sobremesa, equilibre la punta de la etapa utilizando 100 microlitros de la solución a. Gire la punta a 5.000 GS en una centrífuga de sobremesa. Repita la equilibración y el giro.

Cargue la muestra en el disco pipeteando cuidadosamente la muestra dentro de la punta de pipeta que contiene el disco. Gire las puntas en la centrífuga hasta que todo el volumen de la muestra atraviese el disco C 18. Lave las puntas en etapas dos veces con 100 microlitros de la solución A. Después de centrifugar las puntas, recoja el EIT en un tubo de reacción nuevo de 1,5 mililitros con 40 microlitros de la solución B y centrifugue.

Una vez más, concentre la muestra en el evaporador rotatorio (speed vac) bajo condiciones ideales. Detenga el proceso de deshidratación cuando quede apenas uno o dos microlitros de líquido. Como paso final, agregue un volumen final de nueve microlitros de solución de suspensión Resus a la muestra y transfiera esta al placa de microtitulación para el análisis por espectrometría de masas.

El enriquecimiento de proteínas de membrana plasmática puede demostrarse mediante análisis proteómico de pequeñas eluiciones de membrana plasmática, fracciones y proteínas en la fase inferior del sistema de dos fases. La fase inferior contiene las membranas internas de la célula. Por ejemplo, proteínas típicamente conocidas de membrana plasmática, como las proteínas quinasas receptoras, mostraron una alta abundancia en la fracción de membrana plasmática y una baja abundancia en la fracción de fase inferior que contiene las membranas internas.

A su vez, las proteínas conocidas del retículo endoplasmatico muestran una alta abundancia en la fracción de membrana interna y no se observaron en la fracción de membrana plasmática. El enriquecimiento subsiguiente de las fracciones de membrana resistentes a detergentes dará, en casos ideales, como resultado la formación de un anillo lechoso de vesículas membranosas de baja densidad. A aproximadamente un quinto de la altura del tubo, se encontró la mayor abundancia de la proteína remn en las fracciones de membrana resistentes a detergentes o fracciones DRM, tal como se esperaba.

Por el contrario, las proteínas que no están presentes en la membrana, como los microdominios de un transportador A b, C, no muestran un aumento en la abundancia en la fracción DRM. Asimismo, contaminantes típicos, como una proteína mitocondrial del complejo A TPAs F cero y una proteína ribosomal del ribosoma 60 s, no muestran una abundancia enriquecida en la fracción DRM. Aunque aún se pueden identificar cantidades mínimas tras el análisis por espectrometría de masas, las relaciones de abundancia proteica del estado de fosforilación de proteínas en la membrana plasmática, fracciones de cultivos celulares marcados y no marcados, pueden distinguirse cuantitativamente.

Los resultados típicos de la ventana de cuantificación MS quant deben mostrar una relación de intensidad iónica uno a uno para la mayoría de los péptidos identificados. Aquellos péptidos cuya relación de intensidad iónica se desvíe significativamente de uno a uno se consideran regulados de manera diferencial entre el cultivo celular marcado y no marcado, y son candidatos para asociarse con proteínas afectadas por el tratamiento aplicado. Un buen control de calidad para confirmar un etiquetado metabólico exitoso es la coelución de las versiones marcada y no marcada del péptido como un único pico en la separación por nano HPLC, tal como se muestra aquí.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres días, desde el inicio de la extracción hasta la carga de la muestra en el espectrómetro de masas. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la inmunotransferencia, con el fin de responder preguntas adicionales sobre la suplantación de proteínas diana específicas. Así, tras ver este video, deberíamos tener una buena comprensión de cómo mezclar cultivos celulares vegetales marcados con isótopos estables, cómo llevar a cabo una purificación de membrana plasmática mediante un sistema de dos fases, y cómo separar los compartimentos membranosos ricos en esteroles de los empobrecidos en esteroles.