Growth La medición y de la Expresión Génica Dinámica de Tumor-Targeted S. Typhimurium Las bacterias

El objetivo general de este experimento es estudiar la dinámica de expresión génica in vivo de bacterias S. tyrian que crecen dentro de tumores. Por primera vez en un modelo de cáncer de xenoinjerto de ratón, las bacterias se inyectan por vía intravenosa por la vena de la cola. Las bacterias colonizan el tumor y crecen exponencialmente, mientras que la expresión génica se visualiza mediante reporteros luminiscentes.

Las imágenes de bioluminiscencia de animales enteros se realizan utilizando el sistema de imágenes de espectro IVUS. Durante 24 a 48 horas se toma un curso de tiempo de imágenes IVUS. Esta serie de imágenes se correlaciona con los recuentos de colonias generados por la homogeneización y la siembra de tumores.

En conjunto, estos datos nos permiten medir cuantitativamente la expresión génica y la dinámica poblacional de bacterias objetivo de tumores in vivo en tiempo real, paso de preparación celular y líneas celulares utilizando técnicas estándar de cultivo celular. En este experimento, utilizamos células brutas de ocho células a una cofluidez objetivo de 80 a 100%Recolectar y contar células en un hemo, citómetro, resus, suspensión y DMEM libre de rojo de fenol a una concentración objetivo de cinco veces 10 a las siete células por mililitro, o alrededor de 200 microlitros por matraz. Añadir un 15% de factor de crecimiento reducido y mantener la suspensión celular en hielo hasta la implantación del tumor.

Anestesiaron ratones hembra desnudos de cuatro semanas de edad con un 3% de flúor. Cargue las células 100 microlitros por tumor en una jeringa de un molino y coloque una aguja de calibre 27 y medio para cada uno de los dos sitios de inyección bilaterales del flanco posterior. Levanta la piel suavemente con pinzas para hacer una tienda de campaña e inyectar células en la base.

Tenga cuidado de no penetrar demasiado profundo produciendo sangre. Use pinzas para quitar suavemente la jeringa sin salpicaduras. Monitoree el crecimiento del tumor diariamente durante 10 a 20 días hasta que se alcance un diámetro del tumor de dos a cuatro milímetros.

Preparación de bacterias, comience un cultivo nocturno de bacterias en tres milésimas de pulgada de medio LB más antibióticos de un caldo de congelador de menos 80 o una placa refrigerada. En este experimento se utilizó la cepa de atador ELH 4 30 de la mañana. Diluya el cultivo de uno a 100 en lb filtradas y crezca hasta un OD 600 de 0.4 a 0.6.

Centrifugar y lavar tres veces en solución salina tamponada con fosfato y volver a suspender a un OD final de 600 de 0,1 o aproximadamente una vez 10 a las siete celdas por mil. Inyección de bacterias, anestesia a los animales y colócala con la cola apuntando hacia la mano dominante. Localice la vena de la cola y dilate con agua tibia o una lámpara de calor.

Cargue las bacterias 100 microlitros por ratón en una jeringa de un milésimo de pulgada y doble el chip un poco menos de 90 grados. Alinee la punta de la jeringa con la vena de la cola, penetre a poca profundidad sin sentir resistencia e inyecte bacterias. Observe el desplazamiento del flujo sanguíneo para una inyección exitosa.

Espere aproximadamente de 12 a 18 horas antes de obtener imágenes para que ocurra la colonización. Las imágenes de ratón anestesian a los animales en la cámara de inducción. A continuación, coloque cada ratón en la plataforma de imágenes.

Mantenga un posicionamiento preciso para garantizar resultados cuantitativos entre puntos de tiempo, visualice animales utilizando el sistema de imágenes Ibis Spectrum. Si toma imágenes de más de un animal, coloque barreras de luz entre ellos para evitar la disección del animal con iluminación cruzada, sujetando el tumor con pinzas. Retire la piel con un movimiento de tijera inverso.

Movimiento: Cuando se haya separado la mayor parte de la piel, extirpe completamente el tumor con pinzas. Coloque los órganos y los tubos de microcentrífuga prepesados. Dado que la masa de estos tubos puede variar significativamente, es importante pesarlos previamente para obtener resultados cuantitativos.

Cuantificación de la bio distribución bacteriana para cada punto de tiempo extirpar y pesar los tumores, agregar 500 microlitros de PBS más 15% de glicerol y homogeneizar utilizando un desgarro de tejido, genera una dilución en serie y una placa para el recuento de colonias bacterianas resultados representativos. Con este protocolo, podemos generar datos sobre el crecimiento in vivo y la dinámica de expresión génica de bacterias dirigidas a tumores. El flujo de trabajo general se resume aquí.

En la primera etapa, inyectamos bacterias y obtuvimos imágenes del animal utilizando ivus para medir la expresión génica con luminiscencia como reportero. Luego, en la segunda etapa, extirpamos, homogeneizamos y colocamos placas en los tumores para determinar el número de bacterias que crecían en el tumor. La bioluminiscencia generada por cepas bacterianas se visualiza mediante aumentos de señal de ivus con dosis inyectada, con una dosis colonizadora mínima en torno a cinco veces 10 a cinco en todos los casos debido a las atenuaciones.

Las bacterias colonizaron específicamente los tumores o no logran crecer significativamente en los ratones. La señal se cuantifica utilizando unidades de radiación para normalizar el tiempo de exposición, o los valores típicos por encima de 10 a seis o más son indicativos de colonización para una infección determinada. La señal aumenta con el tiempo durante 24 a 48 horas. En este caso, el inicio máximo es alrededor de 36 horas después de la inyección, pero el momento puede variar según la cepa y el plásmido que se utilice. Asegúrese de colocar el ratón exactamente de la misma manera cada vez para garantizar resultados cuantitativos en el siguiente conjunto de experimentos.

Se cuantifica la biodistribución bacteriana para medir el crecimiento de bacterias a lo largo del tiempo en diferentes órganos, se cuantifican bacterias viables y tumores mediante la extirpación y homogeneización del tumor y la siembra de su dilución seriada. Otros órganos pueden ser cuantificados. De manera similar, aquí hemos utilizado el bazo, ya que la proporción de bazo tumoral es una medida típica de la especificidad bacteriana después del cálculo retrospectivo utilizando el factor de dilución.

Estos recuentos nos permiten medir la población bacteriana específica a lo largo del tiempo. A la izquierda, podemos ver que el número de bacterias crece de forma constante a lo largo de la duración del experimento. Con un tiempo de duplicación entre una y tres horas, sustancialmente menor que en los experimentos de cultivo por lotes.

Es probable que esto se deba a las malas condiciones de nutrientes en el microambiente tumoral. A la derecha, hemos cuantificado la proporción de bazo tumoral y hemos observado que aumenta a lo largo del experimento. El objetivo de estos experimentos es monitorear cuantitativamente la dinámica del crecimiento y la expresión génica de bacterias y entornos tumorales utilizando técnicas de imagen IVUS y recuento de colonias.

Hemos demostrado que las poblaciones de bacterias se pueden caracterizar in vivo en ambientes tumorales. En el futuro, se pueden diseñar y diseñar programas de expresión génica más complejos para construir sistemas sofisticados de administración terapéutica en bacterias.