Name: El aislamiento de las neuronas sensoriales de Aplysia californica Se Patch clamp grabaciones de Corrientes glutamatérgicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprende a aislar neuronas sensoriales de Aplysia californica mediante digestión enzimática y técnicas de patch clamp para estudiar corrientes iónicas en neurociencia.

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Financiado por el NIH P40 OD010952, la Fundación Korein, de la Universidad de Miami Fellowship de SLC y una beca de Maytag para ATK. Los autores agradecen al personal de la Nacional de Recursos para la Aplysia, así como Lauren Simonitis y Hannah Peck, quien proporcionó micrografías de una figura.

1. Preparación de células <ol><li> En el Día 1, pesar y anestesiar a los animales. <ol><li> Pesar unos 30 g, 1 kg animal. Se anestesia en animales 5-10 volúmenes de agua de mar 01:01: MgCl isotónica. 6H 2 0 durante 1 hora con aireación, tales como una bomba de aire de acuario eléctrico con piedra de aire adjunto. </li></ol></li><li> Prepare suministros de disección. <ol><li> Montar la bandeja de disección limpia con alfileres de acero inoxidable, tales como pasadores de tela. Montar varios platos de Petri que contenían agua de mar artificial (ASW; véanse las Tablas 1 y 3) + penicilina / estreptomicina (P / S). </li><li> Tenga listo un microscopio de baja potencia. Tener instrumentos de disección limpias listas, como la nariz crucería y pinzas quirúrgicas finas y finas y grandes tijeras quirúrgicas. Rocíe los instrumentos con un 70% de alcohol isopropílico antes de su uso y deje secar. </li></ol></li><li> Posición animal en la bandeja de disección. <ol><li> Posición animales cara ventral hacia abajo en la bandeja de disección. Pin animalesa través de los bordes de la pared del cuerpo y las fronteras parapodiales, pero evite la cola y la cabeza, para exponer la superficie dorsal y la ranura genital </li><li> Enjuague la superficie dorsal en el agua fría de la llave de ejecución lenta. Aplicar una corriente de luz de 70% de alcohol isopropílico a partir de una botella flexible a lo largo de la ranura genital y sobre la parte superior de la cabeza. </li></ol></li><li> Hacer la incisión inicial. <ol><li> El uso de un microscopio de baja potencia (véase la Tabla 2) y la luz reflejada para observar el punto en el que la ranura genital origina en el margen de cáscara anterior, mantener tensada con unas pinzas de punta acanalada un pliegue de tejido a la izquierda de este origen, mientras cortando un poco profunda el hoyo todo el camino a través del área lisa, plana de la pared del cuerpo justo a la derecha de la ranura genital con tijeras en ángulo finas. </li><li> Hemolinfa deberá observarse para verter en el agujero, a veces llevando consigo el ganglio abdominal y el estómago. </li></ol></li><li> Ampliar la incisión. <ol><li> Use tijeras grandes para expandir ªe incisión anterior a un punto entre los rinóforos, mientras tira hacia arriba con la cuchilla inferior para evitar cortes en el intestino. Se observaron los órganos internos que se derrame fuera de la incisión. </li></ol></li><li> Retire los ganglios. <ol><li> Vuelva a colocar la bandeja y reorientar el microscopio en la región de la cabeza. </li><li> Con unas pinzas limpias y tijeras finas, quitar la cabeza ganglios cortando en un momento los nervios que forman la cabeza de los ganglios en un anillo alrededor del esófago para eliminar pleural-pedal y cerebral ganglios como grupo. </li><li> Retire el ganglio vestibular que se adhiere a la parte ventral del esófago. </li><li> Retire el ganglio abdominal cortando los 4 grandes conectivas nerviosas que emiten desde este ganglio. </li></ol></li><li> Aislar los ganglios de interés. <ol><li> Recortar los ganglios de la cabeza aparte, dejando una longitud de conectores unidos a cada ganglio de interés que es igual a al menos el diámetro del ganglio; esto retardar enzima sobre-digestiónde las células de interés en el siguiente paso. </li><li> Ponga cada ganglio objetivo a través de 2 enjuagues de ASW + P / S, moviéndose entre enjuagues con pinzas limpias. </li><li> Si la orientación de las células de PVC, deje el hemiganglion pleural derecho accesorio a la hemiganglion pedal derecho, y del mismo modo dejar el hemiganglion pleural izquierdo conectado al hemiganglion pedal izquierdo. </li><li> Desechar los ganglios no deseado y el resto del animal de acuerdo con la práctica aceptada la investigación. </li></ol></li><li> Digerir enzimáticamente los ganglios. <ol><li> Para cada ganglio, preparar 1 ml de solución de enzima que consiste en 3,75 mg dispasa, 1 mg de hialuronidasa y 0,3 g de colagenasa tipo XI por ml de ASW + P / S en un tubo cónico de 15 ml de polipropileno. </li><li> Lugar enjuaga ganglios en la solución enzimática y coloque la tapa. Se coloca el tubo en posición horizontal sobre un agitador rotatorio (véase el cuadro 2) a baja velocidad durante 13-5 horas durante la noche a aproximadamente 23 ° C (temperatura ambiente). </li></ol></li><li> Prepare elplacas de cultivo. <ol><li> Antes de microdisección (Día 2), preparar poli-D-lisina (PDL) recubiertos con placas de cultivo en una campana de cultivo de tejido. Añadir ~ 0,5 ml PDL (0,2 mg / ml de agua estéril) para el centro de un plato de 35 mm para ~ 25 min. </li><li> Enjuague PDL 3 veces con agua estéril. Deje que se seque. UV-esterilizar las placas. </li></ol></li><li> Día 2 Aislar las neuronas. <ol><li> Llene el centro de 35 mm platos que eran PDL-revestido y UV esterilizada con aproximadamente 0,5 ml de la ASW + P / S para crear una isla de los medios de comunicación en el interior del plato de otro modo seco. Esto se puede hacer en el banco, fuera de la campana de cultivo de tejido. Uno de los platos debe estar preparado para cada grupo de células procedentes de una hemiganglion. </li><li> Tenga listo un plato de disección de 100 mm de diámetro hecha por Sylgard-recubrimiento y curado de un mm de la superficie de la disección profunda 5, equipado con pasadores de disección finas de varios tamaños para ser utilizados como alfileres y sondas (véase la Tabla 3). Enjuague este plato con un 70% de alcohol isopropílico y después con ASW + P / S, y finalmente fill con ASW + P / S. </li></ol></li><li> Prepare microdisección de los ganglios digerido. <ol><li> Verter la solución de enzima que contiene la pleural-pedal y bucal ganglios digerido en el plato de disección. </li><li> Coloque el plato en la platina del microscopio sobre una superficie negro con luz reflejada. </li><li> Utilizando el tejido conectivo adjunto, precisar cada pleural-pedal hemiganglion lado dorsal hacia arriba. Los tejidos deben ser suaves e intolerante de estiramiento. </li></ol></li><li> Microdissect neuronas PVC. <ol><li> Uso de 2 pares de pinzas finas limpias, y que sostiene un pasador de disección fina en un par de fórceps como una sonda, aislar las células de PVC a partir de una hemiganglion pleural. La digestión enzimática se han eliminado o roto aparte la vaina de tejido conectivo que cubre el clúster de PVC, sin embargo, las células se adhieren el uno al otro. </li><li> Utilice la sonda para separar estas células desde el pedal de conjuntivo-pleural 18, a continuación, dejar que la caída grupo de células a la parte inferior de la disecciónplato. </li></ol></li><li> Transferir las neuronas a placa de cultivo. <ol><li> Transferir el grupo de células a un preparado 35 mm de placa de cultivo por succión suavemente el clúster en la punta de un poco pulida al fuego desechable de pipeta Pasteur de vidrio, a continuación, dispensación lentamente en la isla los medios de comunicación en una placa de cultivo, teniendo cuidado de evitar la introducción de burbujas de aire en la pipeta. Repita el aislamiento del grupo PVC de la otra hemiganglion y colocar en una placa de cultivo independientes. </li></ol></li><li> Microdissect y transferir las neuronas BSC. <ol><li> De clavijas de salida del lado ventral ganglio vestibular arriba, con cuidado de sobra las células de interés. Repita el paso 1.12, y los 2 grupos de células BSC del ganglio vestibular 10. </li><li> Aislamiento de las neuronas de PVC y el BSC producirá 4 placas de cultivo que contienen grupos de neuronas: 2 platos que contienen grupos BSC y 2 platos que contienen grupos de PVC. Deseche el resto de los ganglios y dejar de lado el plato de 100 mm disección. </li></ol></li><li> DissocIATE los grupos de células. <ol><li> Coloque una placa de cultivo que contiene las células en la platina del microscopio de baja potencia y retire la cubierta. </li><li> Disociar el clúster de PVC con un movimiento rápido suavemente la parte inferior de la placa de cultivo adyacente a la agrupación de células con un pasador de disección fina celebrada en fórceps. Sacudiendo está cavando la punta del alfiler en el plástico de la parte inferior del plato como si tratara de cavar una mota de plástico. Cuando la fricción con el plástico libera el punto de pin, una ola de percusión se produce a través del medio que se rompe la mata cerca de las células. </li><li> Pueden ser necesarios 5-10 películas a casi disociar completamente las células, pero es mejor dejar pequeños grupos de células en lugar de a flick demasiado no sea que las células serán destruidas por pura mecánica. </li><li> Colocar la tapa y repita con otras placas de cultivo. </li></ol></li><li> Almacenar los cultivos celulares. <ol><li> Coloque las placas de cultivo que contienen islas de medios en sus centros con células disociadas enun gran contenedor que permite la circulación de aire, tal como una x 25 mm ronda placa Petri de plástico 150, y colocar este plato en una incubadora a 17 ° C. </li><li> Instalar en la cámara de un recipiente abierto de agua como una fuente de humedad. Dejar reposar durante la noche. Las células se adhieren al revestimiento de poli-D-lisina en el centro del plato. </li></ol></li><li> Placas de cultivo de inundación. <ol><li> El día 3, inundar suavemente los platos con 2,5 ml de ASW + P / S. Examinar y contar las células usando un microscopio invertido cultivo celular. Conservar en el 17 ° C incubadora. </li></ol></li></ol> 2. Electrofisiología El método es parche estándar de sujeción que se ha descrito en numerosos textos (por ejemplo, Sakmann y Neher, 1995) 16. Este protocolo funciona en células ≤ 100 pF de capacitancia o células &lt;60 m de diámetro durante los días 3 y 4 del protocolo. Las células sin procesos son óptimas para la grabación. La siguiente EXAMEN especialiones se aplican: <ol><li> Las células más grandes pueden ser acomodados con la opción de configuración del amplificador 200B Axopatch establecido en β = 0,1. La activación de corrientes muy grandes puede causar que las células se escapen de fijación de voltaje. Soluciones ASW sustituido para el contenido de sal (por ejemplo, una fracción de la de NaCl sustituido con impermeable al cloruro de N-metil-D-glucamina) se puede usar para reducir la amplitud de corriente de la célula entera. </li><li> Fibra llenos de borosilicato pipetas parche tirados en un extractor de pipeta y rellenada hasta la mitad con una solución intracelular (ICS) que consta de 450 mM KCl y otras sales (ver Tabla 1) son adecuados, y deben tener una resistencia de aproximadamente 0,5 a 1 MOhm. Si se desea el aislamiento de las corrientes iónicas específicas, por ejemplo, corrientes de Na + en la ausencia de corrientes de K, K + en esta solución puede ser sustituido por otros iones tales como Cs +. Cl - sustitución de ICS con un anión impermeant también se justifica si se desea un ICS más natural9. </li><li> Las células son robustos con&gt; 1 hr-largas grabaciones posibles a temperatura ambiente. La grabación es óptima en los días 3 y 4 del protocolo, correspondientes a 24-48 horas de cultivo. Después de 48 horas hay dificultades para formar sellos GigaOhm, quizás a causa de elaboración de un glicocálix sobre la superficie de la célula, y los problemas causados ​​por la abrazadera espacio excrecencia proceso. Las células son útiles, sin embargo, para los estudios de clamp no parches, tales como la toxicología, que se pueden completar en &lt;14 d. </li><li> ASW y otras soluciones para ser dispensado desde el dispositivo de solución por gravedad, así como la solución intracelular, deben ser filtrados a través de una jeringa montada en un filtro de 0,2 micras Acrodisk (Tabla 3) para eliminar las partículas finas que interfieren con la formación de sello GigaOhm. </li><li> La desensibilización se produce al utilizar agonistas tales como D-aspartato (D-Asp), por lo tanto, ~ 1-2 minutos entre las aplicaciones de los agonistas se recomienda. Por el contrario, la potenciación se observa a menudo con una rápida aplicación repetidacationes de agonistas tales como L-glutamato (L-Glu). </li><li> Agonista de corrientes activadas tales como L-Glu pueden ser estudiadas mediante la aplicación de agonistas con la Picospritzer pipeta. Esta pipeta se tira de la misma como la pipeta de parche y contiene agonista en ASW. Cuando la punta de la pipeta se coloca por debajo de la tubería de salida del dispositivo de solución por gravedad, y en un ángulo de 45 ° respecto a la tubería de salida (Figura 2F), agonista se lavó rápidamente fuera de la celda, y la desensibilización se reducirá al mínimo. El agonista de la pipeta debe crear un ángulo de 90 ° o más en relación con la pipeta de parche. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Las técnicas de disociación describen aquí dió cultivos de neuronas sensoriales que contienen 50-100 neuronas aisladas intercalados con pequeños números de células gliales y otras células no identificados. Los pasos más críticos en el protocolo son el tiempo de los ganglios permanecen en solución de enzima, y ​​agitando, la disociación de los grupos de células digeridas para romper el clúster en las células individuales. Digestión enzimática (paso 1.8) debe ser optimizado a la temperatura disponibles. A 23 ° C con agita...

El molusco opistobranch marino Aplysia, ha sido un modelo neurobiológico útil para muchas décadas. Es mejor conocido como modelo de habituación y condicionamiento clásico 7, 8. Los estudios sobre el aprendizaje y la memoria en este modelo ganó el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 2000 por Eric R. Kandel, en un premio que compartió con Arvid Carlsson y Paul Greengard 10. Los estudios que implican registros eléctricos a partir de preparaciones reducidas, en la que los elementos del sistema nervioso de este invertebrado se diseccionaron a partir del animal con los nervios y los músculos dejaron adjunta, han ayudado a aclarar los papeles de las neuronas individuales en Aplysia. Identificación de los mecanismos moleculares precisos que constituyen el aprendizaje en Aplysia sin embargo, a menudo empleado otra técnica, a largo plazo co-cultivos de una neurona sensorial y un motoneuronas, obtenido de uno en uno a partir de animales donantes individuales y se dejó formar una sinapsis en la placa de cultivo de 21 . Nosotros y otros 1, 3, 6, 14, 15, 16 hemos explotado la facilidad con la que identifican las neuronas se pueden orientar en este modelo, así como su resistencia en experimentos a largo plazo para hacer cultivos a corto plazo disociados de grupos de neuronas nominalmente homogéneos en el que se estudian las corrientes iónicas bajo fijación de voltaje en la configuración de patch clamp. Muchas neuronas Aplysia se levantan a las reiteradas rondas de parche de sujeción para dar tiempo a las manipulaciones experimentales de larga duración. La técnica es útil para las neuronas como las células neurosecretoras bolsa del ganglio abdominal, y las neuronas sensoriales de los ganglios pleural y bucal cuya disociación como se describe aquí, pero no para las neuronas muy grandes&gt; 60 m de diámetro, tales como L7 o R2 de el ganglio abdominal. No empleamos suero Aplysia en nuestras culturas, a diferencia de los senso-motoneuronas co-cultivos descritos en otro lugar. La mayoría de las neuronas obtenidas mediante este procedimiento no podrá contar con procesos para tél primero 48 h en cultivo, facilitando toda grabación de voltaje de la célula, pero entonces brotar y elaborar los axones y otros procesos durante aproximadamente 14 días antes de morir a causa de la falta de nutrientes y / o factores de crecimiento. Esta técnica produce cultivos primarios de neuronas 50-100 por plato de regiones fisiológicamente documentados de los ganglios bucal y pleural. Este protocolo es útil para los investigadores que estudian aspectos de la fisiología de células individuales en experimentos que requieren numerosos experimental repeticiones por animal. Se produce un par coincidente de los cultivos debido a la separación anatómica de las células diana en hemiganglia izquierda y derecha, permitiendo estudios que se benefician del tratamiento combinado y los cultivos de control. El protocolo se dirige bucales S racimo (BSC), las neuronas del ganglio vestibular, y ventrocaudal (PVC) pleurales neuronas del ganglio pleural. Estas células son de un tamaño apropiado para el conjunto de grabaciones de voltaje de la celda de visualización y Robust respuestas glutamatérgicas. La metodología discutida es apropiado para la mayoría de los ganglios en el sistema nervioso Aplysia.

<table><tbody><tr><td>Agua de mar artificial ASW</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>surtido</td> <td>(mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7,6</td></tr><tr><td>Solución intracelular</td><td>Sigma</td><td>surtido</td> <td>(mM): 450 KCl, 2,9 CaCl2 (2 H2O), 2,5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA y 40 HEPES-KOH, pH 7,4</td></tr><tr><td>Poly-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina añadida a ASW en 1:100</td><td>Lonzo Walkersville, Inc.</td><td>17-603E</td><td>5.000 Unidades/ml de penicilina más 5.000 mg/ml de estreptomicina</td></tr><tr><td>Dispasa neutra II</td> Roche <td>Diagnostics</td><td>10165859001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>hialuronidasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4272</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>colagenasa tipo XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>L-glutamato (L-Glu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49601-100G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>D-aspartato (D-ASP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11200-10G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N-metil-D-aspartato (NMDA)</td><td>Biomol</td><td>100002-268</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>L-ASP</td><td>Sigma</td><td>A6683-25G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ácido alfa-amino-3-hidroxil-5-metil-4-isoxazol-propiónico (AMPA)</td><td>Sigma</td><td>A6816-5MG</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Antagonistas de L-Glu R</td><td>varios</td><td>varios</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>agar</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>quinurenato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61250</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>APV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido DL-2-amino-5-fosfonopentanoico (antagonista NMDAR)</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>VWRSP</td><td>BDH1133</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Chloride solución</td><td>surtida</td><td>Sigma</td><td>25 g FeCl3 + 25 ml HCl concentrado + 50 ml H2O</td></tr><tr><td>Sylgard silicona polímero de 2 partes</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>SYL184</td><td>Proporciona una superficie de clavija para platos de disección pequeños</td></tr><tr><td>Microscopio de aumento con zoom de 0-40x para disecciones</td><td>Wild</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Techniquip 150 vatios Iluminador de fibra óptica</td><td>Microóptica de Florida</td><td>TQ FOI-150</td> <td>&nbsp;</td></tr><tr>Mezclador <td></td><td></td><td>orbital RotoMix 50800</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio de contraste de fase invertida Nikon Diaphot con objetivos de 4x, 20x (opcional) y 40x</td><td>SR Research Ltd.</td><td>Enlace Ocular II&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Osciloscopio digital Tektronix</td><td>SR Research Ltd.</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>software de adquisición y análisis de datos pClamp 10</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PC con sistema operativo Windows XP o superior</td><td>Soluciones</td><td></td> para PC <td>Thinkserver con discos duros de estado sólido (80 GB) y monitores de bajo ruido Tirador de</td></tr><tr><td>micropipetas Flaming/Brown P87</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA&</td><td></td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Amplificador de pinza Axopatch 200B de Axon Instruments con un rango de compensación de capacitancia de 1-1000 pF; preamplificador</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Conjunto de soporte de electrodos de Axon instruments para el preamplificador Axopatch 200B</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td>CV203BU</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Convertidor A/D Digidata 1200</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Picospritzer, accionado por N2 ajustable en presión y duración</td><td>Parker Hannifin, Cleveland, OH</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>TMC Micro-G Mesa de aislamiento de vibraciones</td><td>Ametek</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr>Jaula <td></td><td></td><td>de Faraday</td><td>, fabricación a medida</td></tr>, <tr><td>Micromanipuladores piezoeléctricos Burleigh, Burleigh Instruments</td><td>; Thorlabs</td><td></td><td>actualmente PCS-5000; -serie 6000 + monta</td></tr><tr><td>manipuladores manuales Narishige M-152 (para sistema de perfusión y picospritzer)</td><td>Narishige USA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Vidrio de pipeta de filamento, 1,5 mm de diámetro exterior, 0,84 mm de diámetro interno -</td><td>WPI</td><td>1B150-3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>3 pulgadas de largo</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ag/AgCl media celda</td><td>WPI</td><td>EP4</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 ml, 35-2097 BD Falcon* Tubos de centrífuga</td><td>VWRSP</td><td>21008-918</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tijeras en ángulo Fine</td><td>Science Tools</td><td>15006-09</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dumostar Pinzas finas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11295-00</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos de halcón de 35 mm</td><td>VWRSP</td><td>25382-064</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>falcon 150 x 25 mm placas de cultivo de tejidos; 1013</td><td>VWRSP</td><td>1013</td><td>también se puede convertir en pequeñas placas de disección con sylgard</td></tr><tr><td>sylgard</td><td>WPI</td><td>SYL184</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>bandeja de disección animal</td><td>varios</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 ml, 35-2097 BD Falcon</td><td>VWRSP</td><td>21008-918</td><td>Para sistema de perfusión alimentado por gravedad de 6 orificios</td></tr><tr><td>Clips de aluminio con extremos de orificio para tornillos</td><td>Ferretería</td><td></td><td>Para sistema de perfusión</td></tr><tr><td>Agujas de calibre 23 (puntos de limado manual)</td><td>VWRSP</td><td></td><td>Para sistema de perfusión</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno de 0,022" de diámetro interno x 0,042" de diámetro exterior; 427411</td><td>Becton-Dickinson</td><td></td><td>para sistema de perfusión</td></tr><tr><td>H-7 soporte/soporte de pipetas para matriz de perfusión Microcap</td><td>Narishige USA</td><td></td> Para sistema de <td>perfusión</td></tr><tr><td>válvulas</td><td></td><td></td> unidireccionales <td>Para sistema de perfusión</td></tr><tr><td>Drummond Microcaps 1 &mu; l</td><td>VWRSP</td><td></td><td>para el sistema de perfusión</td></tr>, <tr><td>agujas de calibre 18 para succión (puntos limados)</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno</td><td>Cole Parmer</td><td>4.27436E+11</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>clavijas de disección fina</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>tubos capilares</td><td>Kimble 71900-100</td><td></td><td>pulidos al fuego y en forma de U en una llama de mechero Bunsen y rellenos con agar al 3% en</td></tr><tr><td>la tienda</td><td></td> de<td>artesanía de arcilla para modelar</td> <td>ECS&nbsp;</td></tr><tr><td>Soporte de plato para platina de microscopio con baño</td><td></td><td></td> de suelo aislado <td>Pipetas pasteur de fabricación a medida</td></tr><tr><td></td><td>VWRSP</td><td>14672-412</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>bombillas de pipeta</td><td>VWRSP</td><td>53283-911</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>filtros de jeringa acrodisk</td><td>VWRSP</td><td>28144-040</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>vidrio de filamento de borosilicato de pared gruesa de 1,5 mm de diámetro</td><td>WPI</td><td>1B150F-3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cilindro de nitrógeno de alta pureza y regulador</td><td></td><td></td> bifurcado<td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Tablas 1-3. Listas de Reactivos, Materiales y Equipos.</td></tr></tbody></table>

el aislamiento de las neuronas sensoriales de<em&gt; aplysia californica</em&gt; se patch clamp grabaciones de corrientes glutamatérgicos

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

El molusco gasterópodo marino Aplysia californica tiene una historia venerable como un modelo de funcionamiento del sistema nervioso, con especial importancia en los estudios sobre el aprendizaje y la memoria. Las preparaciones típicas para este tipo de estudios son aquellos en los que la sensorial y motoneuronas se dejan intactos en un animal disecado mínimamente, o neuronal de co-cultivo técnicamente elaborada de sensorial y motoneuronas individual. Menos común es la preparación neuronal aislado en el que pequeños grupos de neuronas nominalmente homogéneos se disocian en células individuales en cultivo a corto plazo. Tales células aisladas son útiles para la caracterización biofísica de las corrientes de iones utilizando técnicas de patch clamp, y la modulación selectiva de estos conductancias. Se describe un protocolo para la preparación de tales cultivos. El protocolo se aprovecha de los fácilmente identificables las neuronas sensoriales de los ganglios de la glutamatérgicas pleural y bucal, y describe su disociación y un mantenimiento mínimo in la cultura durante varios días sin suero.

La ubicación de las neuronas sensoriales en los ganglios que están dirigidos en este protocolo, las neuronas BSC y PVC se muestran en la Figura 1. Las neuronas BSC están situados en 2 grupos ovales simétricas en el lado ventral del ganglio vestibular, la superficie que se enfrenta lejos de la masa en el ganglio vestibular intacta (Figura 1A). Las neuronas de PVC forman grupos bilaterales, en forma de V que se envuelven alrededor de la superficie dorsal del ganglio pleural hacia el eje c...

Se describe la disección del sistema nervioso de la liebre de mar marino<em&gt; Aplysia</em&gt; Después de la anestesia, el aislamiento de las neuronas para el cultivo a corto plazo de los tejidos, y las grabaciones de las corrientes de iones de células individuales a través de la técnica de patch clamp.

El aislamiento de las neuronas sensoriales de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Se Patch clamp grabaciones de Corrientes glutamatérgicos

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar neuronas sensoriales individuales de plegia en cultivo a corto plazo. Para estudios de registro con parche, esto se logra primero mediante la disección de los ganglios que contienen las células sensoriales de un animal anestesiado. El segundo paso consiste en digerir los ganglios en una solución enzimática durante la noche.A continuación, se disecan las neuronas sensoriales de interés a partir de los ganglios digeridos. El paso final es la disociación de las placas de cultivo preparadas para su adhesión al sustrato de cultivo durante la noche. En última instancia, se utiliza el método de bloqueo de voltaje para estudiar las corrientes iónicas activadas por voltaje y por agonistas expresadas en estas neuronas.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la grabación celular in situ, es que el aislamiento de las neuronas permite utilizar una técnica de bloqueo de voltaje con un solo electrodo. Este método puede ayudar a identificar aspectos clave desconocidos en el campo de la neurobiología de Aplysia, como la identidad de las corrientes iónicas activadas por neurotransmisores implicados en el aprendizaje y la memoria. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la sensibilidad de las neuronas frente a la digestión enzimática y su dispersión sobre las placas de cultivo.Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando nos dimos cuenta de que ciertas corrientes glutamatérgicas importantes en el aprendizaje y la memoria se beneficiarían del aislamiento celular que proporciona este método. El procedimiento será demostrado por los estudiantes de posgrado Andy Kesel y Justin Greer. Comience este procedimiento colocando un animal anestesiado con el lado ventral hacia abajo en la bandeja de disección.Clave el animal a través de los bordes de la pared corporal y de las regiones parapodiales, evitando la cola y la cabeza, para exponer la superficie dorsal del surco genital. A continuación, enjuague la superficie dorsal con agua del grifo fría que fluya lentamente. Luego, aplique un chorro suave de alcohol isopropílico al 70 % desde una botella de presión a lo largo del surco genital y sobre la parte superior de la cabeza.Para realizar el corte inicial, tense firmemente con la pinza de punta roma un pliegue de tejido a la izquierda de la base del surco genital, mientras realiza con unas tijeras finas anguladas un orificio superficial que atraviese completamente la zona lisa y plana de la pared corporal situada justo a la derecha del surco genital. A continuación, amplíe el corte hacia delante hasta un punto situado entre las ROF cuatro mientras tira hacia arriba con la hoja inferior para evitar dañar el intestino. A continuación, utilice pinzas limpias y tijeras finas para extraer los ganglios cefálicos, cortando el punto donde los nervios que forman los ganglios cefálicos se curvan en forma de anillo alrededor del esófago, con el fin de retirar los ganglios petaloides pleurales y cerebrales como un grupo.Después de eso, retire el ganglio bucal que se adhiere al lado ventral del esófago. Para aislar los ganglios de interés, corte los ganglios cefálicos separándolos, dejando una longitud de tejido conectivo unido a cada ganglio de interés igual al menos al diámetro del ganglio. Esto retrasará la acción enzimática sobre las células de interés en el siguiente paso.Luego, enjuague cada ganglio objetivo dos veces en placas con agua de mar artificial que contenga penicilina-estreptomicina. Si se dirige a las células PVC, deje el hemiganglio pleural derecho unido al hemiganglio pétalo derecho, y de manera similar, deje el hemiganglio pleural izquierdo unido al hemiganglio pétalo izquierdo. A continuación, coloque los ganglios enjuagados en la solución enzimática y ajuste bien la tapa.Posteriormente, coloque el tubo de lado sobre un agitador rotatorio y ajuste a baja velocidad durante 13 a 15 horas durante la noche a aproximadamente 23 grados Celsius. En este procedimiento, llene el centro de las placas de 35 milímetros que fueron recubiertas con PDL y esterilizadas con UV con aproximadamente 0,5 milímetros de agua de mar artificial y penicilina-estreptomicina para crear una isla de medio en el interior. Para preparar la microdisección de los ganglios digeridos, vierta la solución enzimática que contiene los ganglios pleurales pedales y bucales digeridos en el recipiente de disección.A continuación, coloque el platillo sobre la platina del microscopio, sobre una superficie negra y bajo luz reflejada. Luego, utilizando el tejido conectivo adyacente, sujete cada hemicarpo pleural con el ganglio hacia arriba; los tejidos estarán blandos e intolerantes al estiramiento. Aísle entonces las células PVC de un hemicarpo pleural utilizando dos pares de pinzas, sosteniendo una fina aguja de disección con una de ellas como sonda.Utilice la sonda para desprender estas células del pétalo, plural, conectivo. Luego deje que el grupo celular caiga al fondo del recipiente para disección. Transfiera el grupo celular a un plato de cultivo preparado de 35 milímetros succionando suavemente el grupo hacia la punta de una pipeta de pasteur de vidrio desechable ligeramente pulida con fuego.Luego dispense lentamente sobre la isla de medio en una placa de cultivo, teniendo cuidado de evitar introducir burbujas de aire en la pipeta. Repita el aislamiento del grupo celular de PVC del otro hemiganglio y colóquelo en una placa de cultivo separada. A continuación se muestra una microfotografía del grupo celular de PVC de color anaranjado oscuro con forma de V del hemiganglio pleural derecho.Para diseccionar las neuronas BSC. Primero, sujete el ganglio bucal con el lado ventral hacia arriba, teniendo cuidado de preservarlo. Posteriormente, aísle las células BSC usando dos pares de pinzas, mientras sostiene una fina aguja de disección con una de ellas como sonda.A continuación, utilice la sonda para separar estas células del ganglio bucal. Luego, deje que las células caigan al fondo del platillo de disección. Esta micrografía muestra la posición de las células glutamatérgicas del ganglio bucal.Las neuronas BSC son identificables por su color naranja oscuro. El aislamiento de neuronas PVC y BSC produce cuatro placas de cultivo que contienen grupos de neuronas. Dos placas con grupos de BSC y dos placas con grupos de PVC.Deseche el resto de los ganglios y aparte el platillo de disección de 100 milímetros para disociar los grupos celulares. Coloque un platillo de cultivo que contenga células sobre la platina del microscopio de baja potencia y retire la tapa. Agite suavemente la parte inferior del platillo de cultivo adyacente al grupo celular.Con un alfiler fino de disección sostenido con pinzas, pueden ser necesarios de cinco a diez movimientos rápidos para disociar completamente las células. A continuación, repita el procedimiento con otras placas de cultivo. Después, coloque las placas de cultivo que contienen islas de medio con las células disociadas en un recipiente grande que permita la circulación de aire, como una placa de Petri redonda de plástico de 150 por 25 milímetros.Y coloque esta placa en un incubador ajustado a 17 grados Celsius. Posteriormente, coloque una placa abierta con agua como fuente de humedad dentro de la cámara y déjelas en reposo durante la noche para permitir que las células se adhieran al recubrimiento de polilisina en el centro de la placa. Al día siguiente, inunde suavemente las placas con 2,5 mililitros de agua de mar artificial y penicilina-estreptomicina, examine y cuente las células utilizando un microscopio invertido para cultivo celular.Aquí se muestran neuronas BSC vivas después de un día en cultivo; las células BSC son generalmente más grandes que las células PVC, con unos 40 micrones. Se muestra aquí una neurona PVC viva después de una semana en cultivo, mostrando el crecimiento de prolongaciones. Aquí se observa una corriente excitatoria transportada por iones de sodio en respuesta a un pulso de glutamato AL, y aquí una corriente en respuesta al D aspartato.Las corrientes activadas por NMDA suelen ser generalmente más pequeñas en amplitud que las activadas por otros agonistas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar no dañar las neuronas durante la disociación. Una ventaja de esta técnica es que crea dos cultivos a partir de cada ganglio, de modo que uno puede utilizarse como control apareado para el cultivo experimental.Esta técnica puede utilizarse para crear cultivos primarios de neuronas a partir de plegia u otros invertebrados marinos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar neuronas sensoriales de plegia mediante la digestión enzimática de los ganglios, seguida de la disociación cuidadosa de las células de interés.

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Preparación de Aplysia Sensorio-motor culturas de células neuronales

Una técnica se describe para la implantación de...

Electrodo de fabricación e implantación de Aplysia californica Para grabaciones multi-canal neural y muscular en los animales intactos, libremente Comportarse

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Dos registros electrofisiológicos de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial en agudas rodajas de hipocampo

Este video muestra el procedimiento para mapear las conexiones sinápticas asegurando un corte de cerebro, colocando pipetas para lograr configuraciones de células completas y estimulando las neuronas presinápticas para registrar respuestas postsinápticas, dilucidando así la conectividad neuronal.

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Extracelularmente Identificar las neuronas motoras de un músculo en la piscina Motor<em&gt; Aplysia californica</em

El caracol marino Aplysia californica ha sido ampliamente utilizado como modelo neurobiológico para los estudios sobre bases celulares y moleculares del comportamiento. Aquí se describe una metodología para explorar el sistema nervioso de Aplysia para los análisis electrofisiológicos y moleculares de neuronas individuales de circuitos neuronales identificados.

Aplysia Preparación De Ganglios Para Análisis Electrofisiológicos Y Moleculares De Neuronas Individuales

El registro de las corrientes de Ca2+ en la membrana frontal de liberación presináptica es clave para una comprensión precisa de la entrada de Ca2+ y la liberación de neurotransmisores. Presentamos una disociación aguda de la médula espinal de la lamprea que produce axones reticuloespinales aislados funcionales, lo que permite el registro directo desde la membrana de la cara de liberación de las terminales presinápticas individuales.

Agudo Disociación de lamprea reticuloespinal axones para permitir la grabación del estreno de la cara de la membrana de individuales Terminales presinápticos funcionales

registros de patch-clamp y el llenado simultáneo de biocitona intracelular de neuronas sinápticamente acopladas en cortes agudos de cerebro permiten un análisis correlacionado de sus propiedades estructurales y funcionales. El objetivo de este protocolo es describir los pasos técnicos esenciales del registro electrofisiológico a partir de microcircuitos neuronales y su posterior análisis morfológico.

Electrofisiológico y Caracterización Morfológica de microcircuitos neuronales en el infarto agudo rodajas de cerebro Usando Emparejados patch-clamp grabaciones

Aquí, describimos los pasos esenciales para las grabaciones de la abrazadera del remiendo de celulares de las neuronas de la sustancia gelatinosa (SG) en el segmento de la médula espinal en vitro . Este método permite que las propiedades intrínsecas de la membrana, transmisión sináptica y caracterización morfológica de las neuronas de la SG a estudiar.

Preparación de láminas agudas de la médula espinal para celulares Patch-clamp de grabación en las neuronas de la sustancia Gelatinosa

Aprende a aislar neuronas sensoriales de Aplysia californica mediante digestión enzimática y técnicas de patch clamp para estudiar corrientes iónicas en neurociencia.

El aislamiento de las neuronas sensoriales de

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