La mejora de la tasa de éxito de cristalización de proteínas por Random Matrix Microseed Screening

El objetivo general de este procedimiento es mejorar el número y la calidad de difracción de los cristales de proteínas obtenidos de un experimento de cribado de cristalización. Para hacer esto, se identifica un material cristalino o precipitado a partir de un experimento de detección de cristalización de proteínas existente establecido utilizando una proteína objetivo de interés, el material cristalino o precipitado se cosecha y luego se usa para generar un stock de semillas cristalinas. A continuación, se establece una serie de cribas de cristalización que contienen tanto la proteína diana de interés como las semillas cristalina.

Por último, se supervisan las cribas de cristalización sembradas para detectar la formación de cristales y se caracterizan los nuevos cristales de proteínas. En última instancia, la aplicación de este procedimiento puede resultar en un aumento del tamaño del número y la calidad de difracción de los cristales de proteínas obtenidos de los experimentos de detección de cristalización. Las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes, por ejemplo, la micro siembra tradicional o la macro siembra, son que se puede realizar rápidamente, es altamente escalable y muestrea significativamente más espacio de cristalización que otros métodos de siembra.

Otra ventaja de esta técnica es que no requiere el uso de material de partida cristalino de alta calidad para la producción de semillas. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se requiere un grado significativo de destreza manual durante los pasos de recolección y manipulación de cristales. Demostración visual de si el método es crítico, ya que la microsiembra de matriz aleatoria se desvía significativamente de otros métodos de siembra de cristales.

Las sutilezas de este método son clave para el éxito, y algunos de ellos son difíciles de comunicar con precisión en forma de texto. Solo Comience este procedimiento con una bandeja de cristalización colocada utilizando un microscopio binocular o un sistema de imágenes de cristal. Inspeccione la bandeja todos los días durante la primera semana.

Luego, una vez a la semana a partir de entonces, tome nota del tamaño del cristal. Tan pronto como no haya evidencia de un mayor crecimiento, seleccione uno o más pozos apropiados de la bandeja de los cuales recolectar material cristalino. Para la generación de semillas, se puede utilizar cualquier material, incluidas agujas finas, luces espiales, microcristales y cristales irregulares y mal formados.

Es más probable que el material más antiguo esté parcialmente reticulado y es menos adecuado para su uso en experimentos de siembra. El día de la cosecha, use un bollo inflamado para hacer una sonda redondeada con una pipeta de vidrio para pastos. Para ello, caliente la pipeta cerca del centro hasta que se ablande.

Luego, retíralo rápidamente de la llama y sácalo separando los extremos. Trata de tirar del vidrio hacia abajo hasta un diámetro de menos de 0,25 milímetros en el punto donde tenga aproximadamente 0,25 milímetros. Rompe el vidrio y sumerge brevemente el extremo roto en la llama.

Repita este proceso hasta que se forme una semiesfera de vidrio en el extremo con un diámetro de aproximadamente 0,75 milímetros. Coloque un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga una cuenta de semilla en hielo. A continuación, abra la bandeja de cristalización seleccionada.

Bueno, para 24 bandejas colgantes de pozos. Use un par de pinzas para quitar el cubreobjetos. A continuación, invierta el cubreobjetos y colóquelo sobre una superficie limpia y estable.

Para 96 bandejas abatibles bien sentadas. Use un bisturí para cortar alrededor de la película de plástico del techo en la parte superior del pocillo seleccionado y luego retire la parte extirpada de la película del techo con un par de pinzas. Retire 50 microlitros de la solución del depósito y transfiera este líquido al tubo de microcentrífuga que contiene la perla de semilla, asegurándose de que el tubo permanezca en hielo durante todo el proceso.

Es importante realizar esto precisamente como se describe y lo más rápido posible. Tenga cuidado de triturar completamente el material de la semilla con la sonda y recupere todo lo que pueda mientras observa la muestra bajo un microscopio. Use la sonda de vidrio preparada anteriormente para triturar completamente los cristales de la cubierta.

Caídas deslizantes. Los cristales pequeños pueden tardar varios minutos en triturarse por completo. Los cristales que son fáciles de triturar no están reticulados y no son cristales de sal.

Mientras que los cristales de sal producen un clic distintivo que se puede escuchar y sentir cuando se trituran. A continuación, retire cinco microlitros de la solución del depósito del tubo de perlas de semillas y transfiéralo al subpozo equivalente para un experimento de gota sentada o cubreobjetos para un experimento de gota colgante que contenga el material cristalino que se va a cosechar. Pipetee este líquido hacia arriba y hacia abajo de cinco a seis veces para resuspender la mayor cantidad posible del subpozo o del contenido de la barbotina de cobertura.

Regrese la suspensión al tubo de la perla de la semilla y repita este paso dos veces más, asegurándose de que se coseche la mayor cantidad posible de material cristalino. Vortex, la gota de la semilla durante dos minutos, deteniéndose cada 30 segundos para enfriar el tubo con hielo. En tubos de 1,5 mililitros que contienen la solución del depósito.

Realice una serie de diluciones para archivar diluyendo el stock de semillas en la solución del depósito por un factor de cuatro a 10 en cada etapa. Si la semilla, el caldo y las diluciones no se van a utilizar inmediatamente, coloque alícuotas de 10 a 20 microlitros en un congelador de 20 grados centígrados negativos o 80 grados centígrados negativos para su almacenamiento. Una vez congeladas, las existencias de semillas pueden conservarse indefinidamente hasta que se necesiten.

El cribado de cristalización RMMS se puede realizar utilizando bandejas de 24 pocillos que emplean el método de difusión de vapor de gota colgante o bandejas de 96 pocillos que utilizan el método de difusión de vapor de gota sentada. Para realizar nuestro cribado MMS en bandejas colgantes de 24 pocillos, utilice una pipeta para transferir manualmente 300 microlitros de cada condición desde una criba de cristalización de 96 condiciones en 10 mililitros. Formato de un solo tubo para cada pocillo de 4 24.

Las bandejas de cristalización bien engrasadas de cada depósito de 300 microlitros transfieren un microlitro de cada condición de cristalización a la superficie de un cubreobjetos de plástico correspondiente del que se han retirado las tiras protectoras delanteras y traseras por un microlitro. En la portada, agregue un microlitro de solución de proteína, luego 0,5 microlitros de caldo de semillas cristalinas. En la primera ronda de RMMS, es importante no utilizar la solución madre de semillas diluida.

Ya que cuanto mayor sea la concentración de semillas, más golpes de cristalización se obtendrán. Invierta cada cubreobjetos de modo que la gota de líquido quede hacia abajo y colóquela por encima de la adecuada. Presione bien hacia abajo el cubreobjetos, comprimiendo la grasa del techo y formando un sello seguro.

Una vez que se hayan establecido las 96 gotas, transfiera la bandeja a una incubadora a una incubadora a una temperatura de cuatro a 18 grados Celsius o a una habitación de temperatura constante para su almacenamiento. Para realizar nuestro cribado MMS en 96, bandejas de caída bien sentadas. Utilice un robot de cristalización o una pipeta de ocho canales para transferir de 20 a 50 microlitros de cada condición desde una pantalla de cristalización de 96 condiciones en formato de bloque de pocillos profundos a cada pocillo correspondiente de la bandeja de cristalización.

A continuación, transfiera 1,0 microlitros de solución proteica, 1,0 microlitros de condición de cristalización y 0,5 microlitros de caldo de semillas a las gotas. Selle la bandeja con una lámina transparente para el techo y transfiérala a una incubadora a una temperatura de cuatro a 18 grados centígrados o a temperatura constante para el almacenamiento. Los experimentos deben inspeccionarse una vez cada 24 horas durante cinco días después del establecimiento y, posteriormente, una vez cada siete días durante un máximo de cuatro semanas utilizando un microscopio binocular o un sistema de imágenes de cristal. Inspeccione cada subpozo o cubrebocas en secuencia y registre cualquier evidencia de formación de cristales.

Compare los resultados de nuestros experimentos de detección de MMS con los de las pruebas de detección que no son de ED y registre las diferencias. Es posible que se requieran múltiples ciclos observados de RMMS. Antes de una calidad de difracción óptima, se producen cristales para ciclos adicionales.

Utilice las existencias de semillas diluidas archivadas según sea necesario para controlar el número de cristales por pocillo. Demostrar la eficacia de RMMS. Se aplicaron métodos de cribado a la cristalización de henna, lisozima blanca y catalizador hepático bovino para cada condición de proteína 3 96.

Se utilizaron cribas de cristalización J-C-S-G-P-A-C-T y Morpheus. Luego, después de cinco días, se seleccionó una sola condición de cada bandeja que se encontró que apoyaba el crecimiento de material cristalino y se utilizó para la generación de semillas. Después de cinco días, se inspeccionaron las bandejas de cristalización y se registró el número de gotas con cristales.

Esta figura resume los resultados de este experimento y proporciona un análisis cuantitativo de la lisozima de clara de huevo de gallina. Se observó un aumento de cuatro a diez veces en la tasa de éxito de la cristalización en comparación con las bandejas sin ED cuando se aplicó RMMS a esta proteína. En particular, en el caso de la catalasa hepática bovina, solo una sola afección en el cribado de Morpheus produjo cristales, en comparación con las 55 afecciones identificadas tras el uso de RMMS.

Además, hubo un aumento de tres y dos veces en la tasa de éxito de la cristalización de latas de hígado bovino utilizando cribados JCSG y PACT respectivamente en todos los casos, e independientemente del cribado de cristalización utilizado, nuestro cribado MMS produjo un número total de cristales significativamente mayor que el cribado no RMMS. Concluimos que nuestro MMS es un enfoque simple pero poderoso, que puede aumentar significativamente la tasa de éxito de los experimentos de detección de cristalización de proteínas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar un experimento de selección de matriz sembrada micros aleatorios desde la identificación y recolección de material cristalino a través de la preparación de stock de semillas cristalinas y, finalmente, el establecimiento de la cristalización sembrada una vez dominado.

Esta técnica se puede realizar en menos de una hora. En el caso de los experimentos de cribado de microsiembra de matriz aleatoria, realizados con un robot de manipulación de líquidos, o en unas tres horas en el caso de los experimentos realizados a mano. Al intentar este procedimiento, es importante asegurarse de que todas las pantallas de cristalización sembradas estén bien selladas antes del almacenamiento.