La pasivación de la superficie de Estudios sola proteína-molécula

El objetivo general de este procedimiento es obtener una superficie de portaobjetos de cuarzo funcionalizada de calidad superior. Esto se logra primero limpiando los portaobjetos y cubreobjetos de cuarzo perforados con agua y acetona. A continuación, el portaobjetos se graba con hidróxido de potasio y la solución piraña para mejorar la calidad de la superficie.

A continuación, las laminillas y cubreobjetos se funcionalizan con grupos amina, seguido de dos rondas de pasivación de la superficie mediante un polímero para hacer que la superficie de vidrio sea inerte. El paso final consiste en armar la cámara microfluídica a partir de la laminilla y el cubreobjetos, con las superficies recubiertas de polietilenglicol o pegiladas enfrentadas entre sí. En última instancia, una nueva estrategia que consiste en tratar la superficie con moléculas de peg durante dos rondas mejora notablemente la calidad de la pasivación, tal como se observa mediante microscopía de fluorescencia de molécula individual.

La principal ventaja de esta técnica o de las técnicas existentes, como el recubrimiento polimérico tras el ataque con óxido de potasio, es que este método garantiza una calidad superior. Las personas nuevas en este método tendrán dificultades, ya que deben realizarse múltiples tratamientos de servicio. Para comenzar la perforación, siga los pasos detallados en el protocolo del texto con las láminas de cuarzo.

Limpie los portaobjetos colocándolos en un frasco de vidrio para tinción. Normalmente se pueden colocar de cinco a quince portaobjetos en un solo frasco. Luego enjuague los portaobjetos con agua UE tras repetir el enjuague tres veces, someta los portaobjetos a ultrasonido con agua UE durante cinco minutos para eliminar la suciedad, deseche el agua y enjuague los portaobjetos tres veces adicionales con agua UE.

A continuación, sustituya el agua UE con acetona y someta las laminillas a sonicación con acetona durante 20 minutos o más, deseche la acetona y enjuague las laminillas con agua Milli Q para eliminar cualquier residuo de acetona. A continuación, sustituya el agua por hidróxido de potasio uno molar y someta las laminillas a sonicación durante 20 minutos o más. Un ataque químico excesivo mejorará la calidad de la superficie, pero introducirá rayaduras que podrían interferir con la imagen de fluorescencia.

Lave las laminillas con agua Milli Q tres veces para eliminar los restos de hidróxido de potasio antes de realizar el atacado piranha. Transfiera las laminillas a un portaportas Duran o a un portaportas de teflón hecho a medida, y colóquelas en un vaso de precipitados de un litro situado dentro de una campana extractora. Llene el vaso de precipitados con 450 mililitros de ácido sulfúrico.

Luego agregue 150 mililitros de peróxido de hidrógeno para obtener una proporción de tres a uno entre el ácido sulfúrico y el peróxido de hidrógeno. Agite la solución para lograr una mezcla adecuada y deje el vaso de precipitados en reposo durante 20 minutos. Saque los portaobjetos de la solución piranha y colóquelos en un portaportaobjetos que contenga agua millieu.

Mientras tanto, deseche la solución de piraña en un frasco designado para residuos. Una vez que alcance la temperatura ambiente, enjuague las laminillas tres veces con agua UE tras la limpieza de las cubreobjetos. Reemplace el agua UE en los recipientes de tinción con metanol. Mantenga las laminillas y las cubreobjetos en metanol.

Mientras tanto, prepare la solución de aminosilización vertiendo 100 mililitros de metanol en el matraz. Luego agregue cinco mililitros de ácido acético y tres mililitros de tres amino propil, trimetil, y mezcle suavemente agitando. Reemplace el metanol en las placas de tinción que contienen los portaobjetos y los cubreobjetos con la mezcla de reacción de aminosilización.

Incube de 20 a 30 minutos y, durante la incubación, sonique una vez durante un minuto. A continuación, sustituya la reacción de aminoisililación por metanol. Luego deseche el metanol y agregue una solución fresca de metanol.

Repita este procedimiento tres veces para la primera ronda de funcionalización superficial. Utilizando primero el polímero, seque las láminas y las cubreobjetos con gas nitrógeno. Luego colóquelas en cajas limpias para pipetas parcialmente llenas con agua milli Q, de manera que el lado que debe ser pegilado quede orientado hacia arriba. A continuación, agregue 64 microlitros del tampón de reacción recién preparado a una solución de peg preparada.

Pipetee la mezcla hacia arriba y hacia abajo para disolverla completamente. Luego, centrifugue a 16.100 G durante un minuto. Para eliminar las burbujas de aire, deposite 70 microlitros de la mezcla de pegilación sobre un portaobjetos de cuarzo seco.

Coloque suavemente una laminilla seca sobre la solución, incube los portaobjetos en un ambiente oscuro y húmedo durante dos horas hasta toda la noche para almacenar los portaobjetos y laminillas pegilados. Desarme cuidadosamente el portaobjetos y la laminilla deslizando la laminilla hacia un lado y enjuagándolos con agua UE antes de secarlos con gas de nitrógeno. Coloque un par de portaobjetos y laminilla en un tubo de 50 mililitros de manera que las superficies pegiladas queden orientadas en direcciones opuestas.

Cierre parcialmente el tubo y aplique vacío antes de llenarlo con gas nitrógeno y atornillar bien la tapa. Almacénelo a menos 20 grados Celsius. Estos pasos ayudan a preservar la superficie pegilada durante un largo período de tiempo.

Realice una segunda ronda de pegilación según se describe en el protocolo escrito inmediatamente antes de usar la portaobjetos para armar una cámara microfluídica. Coloque un portaobjetos de cuarzo sobre una superficie plana con el lado pegilado hacia arriba. Cree un canal en diagonal sobre la superficie pegilada colocando cinta adhesiva doble cara sobre el portaobjetos.

Asegúrese de que los orificios estén posicionados en el centro del canal. Luego, coloque suavemente una cubeta pegilada encima para completar la cámara, con el lado pegilado hacia abajo.

Cierre la cámara presionando la laminilla sobre las áreas donde se coloca la cinta adhesiva doble cara. Hágalo suavemente pero a fondo, de modo que la cámara quede herméticamente sellada. Finalmente, cierre los bordes de la cámara con pegamento epóxico.

Proceda a inmovilizar estreptavidina o neutravidina y agregue moléculas biológicas biotiniladas para imágenes de molécula individual según se describe en el protocolo escrito. Si la funcionalización de la superficie se ha realizado con éxito, se observan menos de 10 proteínas absorbidas no específicamente por área de imagen. Cuando se añade una proteína marcada con un fluoróforo de uno a 10 nanomolares en la cámara, si cualquiera de los pasos de limpieza o reacción no se ha llevado a cabo adecuadamente, el número de proteínas absorbidas no específicamente aumenta significativamente. Por ejemplo, si se omite el ataque con piranha, se observa una absorción no específica 100 veces mayor.

La naturaleza superior de la doble pegilación se muestra prominentemente aquí. Se observó que las señales de fondo provenientes de las moléculas fluorescentes y de la solución eran mucho más débiles cuando se utilizó la doble pegilación, como se muestra en el panel izquierdo. Esto indica que las proteínas son repelidas de manera más efectiva por la capa doblemente pegilada.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cuatro horas si se lleva a cabo correctamente. No olvide que trabajar con AYA puede ser extremadamente peligroso; siempre deben tomarse precauciones como el uso adecuado de guantes, gafas y delantal al realizar este procedimiento.