La pasivación de la superficie de Estudios sola proteína-molécula

El objetivo general de este procedimiento es producir una superficie deslizante de cuarzo pulido de calidad superior. Esto se logra limpiando primero los portaobjetos de cuarzo perforados y los cubreobjetos con agua y acetona. Luego, el portaobjetos se graba con hidróxido de potasio y la solución de piraña para mejorar la calidad de la superficie.

A continuación, los portaobjetos y los cubreobjetos se funcionalizan con grupos amina seguidos de dos rondas de superficie utilizando un polímero para hacer que la superficie del vidrio sea inerte. El paso final es ensamblar la cámara microfluídica desde el portaobjetos y el cubreobjetos con las superficies recubiertas de polietilenglicol o pegiladas una frente a la otra. En última instancia, una nueva estrategia de tratar la superficie con moléculas peg durante dos rondas mejora notablemente la calidad de la pasivación observada por la microscopía de fluorescencia de una sola molécula.

La principal ventaja de esta técnica o de las técnicas existentes, como el recubrimiento con polímeros después del grabado con óxido de potasio, es que esta técnica garantiza una calidad superior. Las personas nuevas en este método tendrán dificultades ya que se deben realizar múltiples tratamientos de servicio. El taladro para comenzar, el cuarzo se desliza como se detalla en el protocolo de texto.

Limpie los portaobjetos colocándolos en un frasco de vidrio para teñir. Por lo general, se pueden colocar de cinco a 15 portaobjetos en un solo frasco. A continuación, enjuague los portaobjetos con agua UE después de repetir el enjuague tres veces, sonique los portaobjetos con agua UE durante cinco minutos para eliminar la suciedad, deseche el agua y enjuague los portaobjetos tres veces más con agua UE.

A continuación, sustituya el agua UE por acetona y sonique los portaobjetos con acetona durante 20 minutos o más, deseche la acetona y enjuague los portaobjetos con agua Milli Q para eliminar cualquier residuo de acetona. A continuación, sustituya el agua por un molar de hidróxido de potasio y sonique los portaobjetos durante 20 minutos o más. El grabado excesivo mejorará la calidad de la superficie, pero introducirá arañazos que podrían interferir con las imágenes de fluorescencia.

Enjuague los portaobjetos con agua Milli Q tres veces para eliminar los rastros de hidróxido de potasio y realizar el grabado de pirañas. Transfiera los portaobjetos a un soporte para portaobjetos Duran o a un soporte de teflón hecho a medida, y colóquelos en un vaso de precipitados de un litro que se encuentra en una campana química. Llene el vaso con 450 mililitros de ácido sulfúrico.

Luego agregue 150 mililitros de peróxido de hidrógeno para una proporción de tres a uno entre ácido sulfúrico y peróxido de hidrógeno. Revuelva la solución para mezclar correctamente y deje el vaso de precipitados sin tocar durante 20 minutos. Saque los portaobjetos de la solución de piraña y colóquelos en un soporte para portaobjetos que contenga agua de millieu.

Mientras tanto, deseche la solución de piraña en una botella de desecho designada Una vez que alcance la temperatura ambiente, enjuague los portaobjetos tres veces con agua UE después de la limpieza del cubreobjetos. Reemplace el agua UE en los platos de tinción con metanol. Mantenga las correderas y los cubreobjetos en metanol.

Mientras tanto, prepare la solución de aminoislandización vertiendo 100 mililitros de metanol en el matraz. Luego agregue cinco mililitros de ácido acético y tres mililitros de tres aminopropilo, trimetilo, y mezcle suavemente agitando. Reemplace el metanol en los platos de tinción que contienen los portaobjetos y los cubreobjetos con la mezcla de reacción de aminosilización.

Incubar durante 20 a 30 minutos durante la incubación, sonicar una vez por un minuto. A continuación, reemplace la reacción de aminoislandización con metanol. Luego deseche el metanol y agregue una solución de metanol fresca.

Repita este procedimiento tres veces para la primera ronda de superficie Usando polímero primero, seque los portaobjetos y los cubreobjetos con gas nitrógeno. A continuación, colóquelos en cajas de pipetas limpias parcialmente llenas de agua mili Q de tal manera que el lado que debe estar pegilado quede hacia arriba. A continuación, añada 64 microlitros del tampón de reacción recién preparado a una solución de clavijas preparada.

Pipetea la mezcla hacia arriba y hacia abajo para que se disuelva por completo. A continuación, centrifugar a 16, 100 G durante un minuto. Para eliminar las burbujas de aire, coloque 70 microlitros de la mezcla de pegilación en un portaobjetos de cuarzo seco.

Coloque suavemente un cubreobjetos seco sobre la solución, incube los portaobjetos en un ambiente oscuro y húmedo durante dos horas o toda la noche para almacenar los portaobjetos pegilados y los cubreobjetos. Desmonte con cuidado la corredera y el cubreobjetos deslizando el cubreobjetos hacia su lado y enjuagándolos con agua UE antes de secarlos con gas nitrógeno. Coloque un par de portaobjetos y cubreobjetos en un tubo de 50 mililitros de modo que las superficies pegiladas queden alejadas unas de otras.

Cierre parcialmente el tubo y aspírelo antes de llenarlo con gas nitrógeno y enroscar bien la tapa. Guárdalo a 20 grados centígrados bajo cero. Estos pasos ayudan a preservar la superficie pegilada durante un largo período de tiempo.

Realice una segunda ronda de pegilación como se describe en el protocolo de texto inmediatamente antes de usar el portaobjetos para ensamblar una cámara microfluídica. Coloque un portaobjetos de cuarzo sobre una superficie plana con el lado pegilado hacia arriba. Haga un canal en diagonal sobre la superficie pegilada colocando cinta adhesiva de doble cara sobre el portaobjetos.

Asegúrese de que los orificios estén colocados en el centro del canal. A continuación, coloque suavemente un cubreobjetos pegilado en la parte superior para completar la cámara. Con el lado pegilado hacia abajo.

Selle la cámara presionando el cubreobjetos sobre las áreas donde se coloca la cinta adhesiva de doble cara. Hazlo con suavidad pero a fondo para que la cámara quede sellada herméticamente. Finalmente, cierre los bordes de la cámara con pegamento epoxi.

Proceda a inmovilizar la estreptavidina o neutro travaína y agregue moléculas biológicas biotiniladas para la obtención de imágenes de una sola molécula como se describe en el protocolo de texto, si la superficie se ha realizado con éxito, se observan menos de 10 proteínas no absorbidas específicamente por área de imagen. Cuando se añaden de uno a 10 nanomolares de proteína marcada con fluorescencia en la cámara, cuando alguno de los pasos de limpieza o reacción no se ha llevado a cabo correctamente, el número de proteínas no absorbidas específicamente aumenta significativamente. Por ejemplo, si se omite el grabado de la piraña, se observa 100 veces más absorción inespecífica.

La naturaleza superior de la doble pegilación se muestra aquí de manera prominente. Se observó que las señales de fondo de las moléculas fluorescentes y la solución eran mucho más débiles cuando se usaba la doble pegilación, como se muestra en el panel izquierdo. Esto indica que las proteínas son repelidas más eficazmente por la capa doblemente pegilada.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro horas si se realiza correctamente. No olvide que trabajar con AYA puede ser extremadamente peligroso, siempre se deben tomar precauciones como guantes, gafas y delantal adecuados mientras se realiza este procedimiento.