Patch Clamp Las grabaciones de las células embrionarias de pez cebra Mauthner

El objetivo general de este procedimiento es registrar las propiedades sinápticas y de excitabilidad de los embriones de pez cebra en la boca de sus células. Esto se logra diseccionando primero el embrión de pez cebra para exponer la superficie ventral de la cerebria posterior. El segundo paso es colocar la preparación disecada en la platina de un microscopio de pinza de parche e identificar la boca en sus células.

Próxima versión. Sujete las células M utilizando el modo de grabación adecuado y registre la actividad sináptica y las propiedades de excitabilidad. El paso final es analizar los datos registrados para determinar las propiedades sinápticas o de excitabilidad.

En última instancia, el pinzamiento de parches de estas células se utiliza para mostrar las propiedades de los receptores sinápticos en un organismo en desarrollo. Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dos áreas principales de dificultad. La primera es la disección.

La segunda formación de la escena del concierto puede ser un reto. La primera vez que tuve la idea de este método fue cuando decidí trabajar en una preparación de pez cebra en la que el cerebro posterior estaba unido a la médula espinal, demostrando que el procedimiento sería burram Roy, un estudiante de doctorado graduado en mi laboratorio, Comience este procedimiento preparando el plato de disección forrado con Sard. Primero, fije las arandelas a la corredera con grasa.

Luego agregue sarda líquida al centro de la lavadora. La sarda generalmente se cura durante la noche y forma un pequeño lecho circular en el portaobjetos de vidrio, que se convierte en la base del plato de disección. Después de colocar un portaobjetos en el portaobjetos, colóquelo en la cámara de grabación para que sirva de base para la disección.

Después, prepare las soluciones necesarias. Las soluciones extracelulares deben dejarse a temperatura ambiente, mientras que las soluciones intracelulares deben mantenerse estériles. También se puede añadir un 0,1% de líquido para el amarillo a la solución intracelular, de modo que la visualización de la morfología de la célula M se pueda realizar al final del experimento para confirmar la identidad de la célula.

A continuación, cría los embriones de pez cebra de tipo salvaje en agua de huevo a 28,5 grados centígrados y recolecta y prepara de acuerdo con la publicación anterior. Para la disección, transfiera los embriones a la placa de disección que también sirve como cámara de registro. Luego anestesiarlos durante siete a 10 minutos.

En una solución salina anestésica que se aproxima mucho a la solución salina fisiológica, se puede determinar si están adecuadamente anestesiados examinando la respuesta a un suave pellizco de la cola. A continuación, sujete los embriones a través del no concordante y colóquelos en la placa de la línea de protección SIL con alambre de tungsteno de 0,001 pulgadas bajo un microscopio de disección con un aumento de 25x. Ajuste el aumento del telescopio de disección a 40 a 50 x para realizar la disección.

Ahora, retira la mandíbula, los ojos y el prosencéfalo con un par de pinzas finas. Separe suavemente el cerebro posterior de la médula ganglionar subyacente trabajando cuidadosamente las pinzas entre la médula ganglionar y el cerebro. A continuación, gire suavemente el cerebro posterior para que la superficie ventral quede hacia arriba.

Esta posición proporciona un buen acceso a las células M, que generalmente se encuentran a menos de cinco a 10 micrómetros de la superficie ventral en embriones jóvenes y de 20 a 50 micrómetros en larvas más viejas. A continuación, traslade con cuidado la preparación a la configuración de grabación, donde se puede realizar el experimento de la fijación de parches. Las células M se visualizan con contraste de interferencia diferencial, aunque también se pueden utilizar otros modos de imagen para prepararse para la fijación del parche.

Comience sacando algunas pipetas de parche CLA con vidrio de silicato bo de pared delgada. En una pipeta de tracción horizontal, los diámetros de la punta son de aproximadamente 0,2 a 0,4 micrómetros después del pulido al fuego hasta obtener un borde liso, y el cono del vástago mide aproximadamente cuatro milímetros de largo. Llene la punta de la pipeta con solución intracelular sumergiendo la punta en el líquido intracelular.

A continuación, inserte una aguja de jeringa en la pipeta y expulse suavemente la solución intracelular de la jeringa. Para terminar de llenar la pipeta, conecte la pipeta a la platina del cabezal del amplificador En la configuración de electrofisiología, es importante mantener la platina del cabezal en un ángulo de aproximadamente 45 grados con respecto al eje horizontal, ya que esto garantiza un ángulo de entrada para la pipeta que sea adecuado para la formación de sellos de alta resistencia con la boca en su celda justo antes de que la pipeta descienda a la solución de baño. Aplique una pequeña cantidad de presión positiva a la pipeta para reducir la posibilidad de que la punta se bloquee. Continúe acercándose a la célula M con una pequeña cantidad de presión positiva en la pipeta.

La presión positiva empuja suavemente la célula de un lado a otro y, cuando se coloca inmediatamente sobre la célula, forma un pequeño hoyuelo en la membrana celular. Ahora deje la pipeta en su lugar durante unos segundos para limpiar suavemente la superficie de la célula y así se pueda formar un sello fuerte entre la pipeta y la membrana. A continuación, libere la presión positiva de la pipeta para iniciar el sellado.

Una pequeña cantidad de presión negativa, junto con un potencial negativo de pipeta, da como resultado la formación de gigasellos en unos pocos segundos. Posteriormente, cambie el potencial de retención en el amplificador a menos 60 milivoltios. Ruptura de la membrana celular con una serie de pulsos cortos de succión.

A continuación, registre inmediatamente los potenciales de membrana y minimice los artefactos de capacitancia. Compare la capacitancia de la celda y la resistencia de acceso entre un 70 y un 85% La resistencia de acceso debe monitorearse cada 30 segundos a un minuto y, si hay un cambio del 20% o más, abortar el experimento. Una vez finalizado el experimento y adquiridos los datos suficientes, se sacrifica el embrión extrayendo el cerebro posterior con unas pinzas.

Esta figura muestra los registros representativos de las corrientes excitatorias de los receptores A, MPA y NMDA obtenidos de 48 embriones HPF. Aquí están las PSC espontáneas A MPA ME registradas desde una celda M a un potencial de retención de menos 60 milivoltios. Y este es el promedio de los PSC ME.

Aquí están las PSC espontáneas A, MPA y NMDA me registradas desde una celda M a un potencial de retención de 40 milivoltios. Y este es el promedio de ME PSCs, glutamato me PSCs se registraron en presencia de un micromolar TTX para bloquear potenciales de acción, cinco micromolares estrictos de nueve y 100 micromolares de ritoxina para bloquear glicina y G se muestra. Aquí están las PSC MI espontáneas registradas desde una celda M a un potencial de retención de menos 60 milivoltios.

Y el promedio de las PSC de IM se registró en presencia de un TTX micromolar para bloquear los potenciales de acción. Un milimolar de ácido quimérico para bloquear la actividad del receptor de glutamato y 10 micromolares de Qing para bloquear la aparición de GABA. Estos son los potenciales de acción registrados de una célula M en esta célula en particular.

Un estímulo de umbral de SRA de 0,48 nanoamperios provocó varios potenciales de acción, pero un estímulo al umbral solo da como resultado la producción de un solo potencial de acción. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos a cuatro horas si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo parchear el registro de pinza de las células M y otras neuronas espinales reticulares en embriones de pez cebra.