Localización y cuantificación relativa de nanotubos de carbono en las células con multiespectral de imágenes de Citometría de Flujo

El objetivo general del siguiente experimento es proporcionar un método nanometrológico para monitorear y cuantificar la absorción celular de nanotubos de carbono en un número estadísticamente relevante de células. Esto se logra tratando primero las células con nanotubos de carbono dispersables en agua, que ingresan a las células de manera dependiente de la concentración. Estos nanotubos de carbono finalmente se marcan con un marcador fluorescente.

Luego, después de la fijación, cada célula se obtiene en el campo claro, el campo oscuro y los canales fluorescentes de un flujo de imágenes multiespectral. Citómetro. Para visualizar la distribución de los nanotubos de carbono y el nivel de absorción de luz, luz dispersa y fluorescencia, el etiquetado de nanotubos induce en cada célula píxel por píxel. En última instancia, la absorbancia y dispersión intrínseca de la luz dentro de las células permite la localización y cuantificación de los nanotubos de carbono.

Por lo tanto, este método puede ayudar a responder nuevas preguntas en los campos de la nanotoxicología y la nanomedicina, como el impacto y el destino de los materiales basados en carbono en células vivas, y también el potencial de los nanotubos de carbono como sistema de administración de fármacos. A continuación, sonique los nanotubos en un baño con agua a 20 grados centígrados durante 20 minutos. A continuación, diluya los nanotubos a concentraciones de 0, 10, 20 y 50 microgramos por mililitro en medio completo, y luego incube dos mililitros de cada dilución con las células de interés en 1 placa de 25 centímetros cuadrados por dilución a 37 grados Celsius después de 20 horas, retire el medio de incubación de cada placa y enjuague las células marcadas con nanotubos de carbono con PBS.

Después del lavado, la tripsina observa las células de cada placa y luego las vuelve a suspender en medio DMEM completo. A continuación, transfiera cada muestra a tubos de halcón individuales de 15 mililitros y luego centrifuga las células durante cinco minutos a 200 veces G y temperatura ambiente. Vuelva a suspender cada pellet en formaldehído al 4% a cuatro grados centígrados durante una hora.

Después de la fijación, gire las células hacia abajo nuevamente y vuelva a suspender cada muestra granulada a 15 veces 10 a la quinta celda en 150 microlitros de PBS. A continuación, filtre las muestras a través de filtros de malla individuales de 50 micras para adquirir imágenes de las células con un flujo de imágenes. Citómetro de flujo de imágenes multiespectrales.

En primer lugar, seleccione un aumento adaptado y, a continuación, muestre las muestras de interés de la imagen. Utilice un láser de 685 nanómetros para obtener imágenes del campo oscuro y configurar el citómetro de flujo. Canal número seis para recoger la emisión de campo oscuro a un paso de banda de 745 a 800 nanómetros.

Visualice las muestras en los canales de campo claro número uno y número seis de campo oscuro para el análisis de imágenes. En primer lugar, cree un diagrama de puntos paramétrico con una relación de aspecto de anchura y altura en comparación con el área de la celda. Esto permite discriminar las celdas individuales que tienen un área estándar y una relación de aspecto cercana a uno de los eventos multicelulares, que tienen un área grande y una relación de aspecto pequeña, y los escombros que exhiben un área extremadamente pequeña.

Después de usar las imágenes de celda para verificar que las celdas individuales se han seleccionado correctamente, configure un diagrama de puntos biparamétrico para celdas marcadas con nanotubos de carbono altamente contrastadas trazando el contraste contra el gradiente cuadrático medio para permitir la exclusión de la raíz baja, el gradiente cuadrado medio, las celdas desenfocadas de bajo contraste y la selección de las celdas en el plano enfocado. A continuación, utilice la herramienta Buscar la mejor entidad para determinar el parámetro que proporciona la mejor separación estadística entre las celdas etiquetadas y las no etiquetadas. Por ejemplo, para este experimento representativo, la característica de objeto de píxel medio es la más adecuada.

A continuación, trace este parámetro contra la frecuencia normalizada para trazar un histograma para la cuantificación de los nanotubos absorbidos por las células en cada concentración experimental. Ahora trace un gráfico biparamétrico para el objeto de píxel medio en campo claro frente a la intensidad en campo oscuro. Para comprobar la correlación entre estos dos parámetros, también se evalúa la cuantificación de nanotubos mediante la creación de imágenes en la célula a medida que los nanotubos de carbono aparecen como manchas oscuras intensas En el canal de campo claro, seleccione un rango restringido de píxeles con una intensidad baja, por ejemplo, entre cero y 533 para crear la máscara de umbral, Uno que se ajusta a los nanotubos oscuros con precisión para crear una segunda máscara denotada máscara dos para visualizar los nanotubos que aparecen brillantes en el canal de campo oscuro.

Seleccione un rango de píxeles con una intensidad alta. Por ejemplo, se eligió un rango de 150 a 4.095 para este experimento. Luego, usando el área de la máscara de campo claro uno o la máscara de campo oscuro dos, configure un diagrama de puntos para cuantificar la internalización relativa de los nanotubos.

Por ejemplo, represente el área del canal seis correspondiente al campo oscuro con máscara dos contra el área del canal uno, correspondiente al campo claro con máscara uno. Después de determinar la correlación lineal entre la máscara uno y la máscara dos, visualice los nanotubos dentro del citoplasma creando primero una máscara de toda la célula y luego erosionando la máscara. Ahora se denota erosione M 0 1 7 por siete píxeles para ver el interior de la celda.

Para visualizar los nanotubos de carbono dentro de la membrana celular, use la ecuación booleana M cero uno y no erosione M 0 1 7. Esa es la máscara de toda la célula, sustraída del interior de la célula para crear una máscara de la membrana solo para evaluar los píxeles oscuros de la membrana. Aplique la máscara de campo claro a la máscara de membrana.

Aplique todas estas máscaras a varias células a la vez para confirmar la distinción entre las muestras marcadas y las no etiquetadas. A continuación, seleccione los píxeles negros de la membrana con la herramienta de área de características para cuantificar los nanotubos de carbono de la membrana celular. Por último, discriminar los nanotubos de carbono que se han interiorizado de los que se han absorbido en la membrana.

Traza el área negra de la membrana contra el área negra de toda la célula. Una vez que se hayan creado todas las parcelas para una condición experimental, cree una plantilla de informe estadístico. Guarde la plantilla como un archivo A ST y agrupe todos los archivos de datos.

El dispositivo de flujo de imágenes produce múltiples imágenes de alta resolución de cada celda en el citómetro de flujo, incluidos los canales de campo claro, campo oscuro y fluorescencia, como se demuestra aquí con tres celdas marcadas con nanotubos diferentes. También se muestran las superposiciones de estos canales. La presencia de nanotubos de carbono induce cambios tanto en el contraste como en el gradiente de las células marcadas en comparación con las células no marcadas.

Por lo tanto, la creación de un diagrama de puntos biparamétrico es importante para seleccionar las celdas de enfoque. Las células desenfocadas en amarillo se pueden discriminar por su bajo contraste y su bajo gradiente cuadrático medio, independientemente de la presencia o ausencia de etiquetado de nanotubos. Las celdas de enfoque no marcadas también exhiben un contraste bajo, pero demuestran una raíz alta, gradiente cuadrado medio cuando las celdas de enfoque están marcadas con nanotubos, sin embargo, las celdas demuestran un perfil de gradiente cuadrático medio de alto contraste y raíz baja.

Los nanotubos de carbono internalizados se distinguen fácilmente, particularmente en el canal de campo claro, donde aparecen como manchas oscuras intensas, cuyas áreas aumentan con la concentración de nanotubos. Cuando se analizan las señales medias de píxeles de las imágenes de campo claro, se puede determinar una cuantificación relativa de la absorción del nanotubo. Por ejemplo, estos histogramas demuestran el aumento significativo en la absorción de nanotubos que se produce con cada aumento en la concentración de etiquetado de nanotubos, ya que la cuantificación de nanotubos de carbono demostrada también es posible mediante el uso de máscaras aplicadas en un rango restringido de píxeles oscuros dentro de una imagen de campo claro, o dentro de los píxeles de alta intensidad dentro del campo oscuro. correspondientes a las áreas donde están presentes los nanotubos.

El trazado del área de estas máscaras permite una mayor cuantificación de la absorción de nanotubos de carbono. Además, la correlación entre los puntos en las imágenes de campo claro y oscuro se puede evaluar trazando la intensidad del campo oscuro frente a la señal de píxel media del campo claro, o trazando el área de la máscara dentro del campo claro frente al área dentro del campo oscuro. En las siguientes dos figuras se muestran los análisis de los nanotubos de carbono localizados en el interior de la célula.

Estas primeras imágenes muestran las diferentes máscaras que se crearon. Tenga en cuenta que la solidez de las máscaras de localización en función de la erosión de la máscara de celda predeterminada debe comprobarse visualmente en la colección de las celdas etiquetadas y sin etiquetar. Como se acaba de demostrar en estos diagramas de puntos, se ha trazado el área total de los puntos negros en la membrana celular frente a la de toda la célula para determinar la puntuación de internalización.

Para las células que se han incubado durante 20 horas a 37 grados centígrados en comparación con las células que se incubaron durante dos horas a cuatro grados centígrados a cuatro grados centígrados, los nanotubos de carbono se encuentran principalmente en la membrana, mientras que a 37 grados centígrados, los nanotubos de carbono se internalizan en más del 90% de las células. La fluorescencia de los nanotubos de carbono no es un buen indicador de la internalización de los nanotubos de carbono debido a una correlación demasiado baja entre los puntos fluorescentes y los puntos dentro de los canales de campo brillante y oscuro. De hecho, la correlación entre la intensidad de fitzy y el píxel medio del campo claro indica un coeficiente de correlación de Pearson de menos 0,2.

Como se demuestra en estas imágenes, la señal fluorescente no coincide de manera confiable con los puntos negros de campo claro, los nanotubos de carbono, el confinamiento y la agregación dentro de los lisosomas intracelulares apagaron parcialmente la señal fluorescente. Por el contrario, los nanotubos dispersos pueden dar una señal fluorescente más fiable después de su desarrollo. Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la nanotecnología y la nanomedicina exploren la interacción de las células vivas con nanomateriales basados en carbono o cualquier nanomaterial con una alta capacidad de absorción y dispersión de la vida utilizando un método de citometría estadística de alto rendimiento.