Name: Localización y cuantificación relativa de nanotubos de carbono en las células con multiespectral de imágenes de Citometría de Flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-12T13:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Aprende a localizar y cuantificar nanotubos de carbono en células mediante citometría de flujo con imágenes multiespectral. Este método permite analizar la internalización celular de manera estadísticamente relevante.

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Este trabajo fue apoyado por ANR P2N (Nanother project 2010-NANO-008-04), por la Region Ile de France (contrato nº E539) y por CNRS. Open Access fue pagado por EMD Millipore.

1. Preparación de Nanotubos de Carbono Dispersables en Agua (CNTs)
<ol>
	<li>Dispersar primero los CNT en agua de cultivo celular, antes de sonicarlos durante 20 min en un sonicador de agua de baño a 20 °C. Si los CNT se funcionalizan con una sonda fluorescente, protéjalos tanto como sea posible de la luz durante todo el experimento.</li>
</ol>
2. Etiquetado de células con CNTs
<ol>
	<li>Cultive células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) (por ejemplo) en placas de 25 cm² en medio DMEM, que contengan un 10% de suero fetal bovino y un 1% de estreptomicina de penicilina.</li>
	<li>Preparar soluciones de CNTs a concentraciones de 0, 10, 20 y 50 μg/ml en medio completo e incubar las células a 37 °C durante 20 h o a 4 °C durante 20 h (2 ml de suspensión de CNT para una placa de 25 cm²).</li>
</ol>
3. Fijación celular
<ol>
	<li>Retire el medio de incubación después; enjuague las células con PBS, tripsinícelas y vuelva a suspender las células en medio DMEM completo. Centrífuga durante 5 min a 1.200 rpm.</li>
	<li>Reemplace el medio primero por paraformaldehído al 4% durante 1 hora a 4 °C, luego por PBS para conservarlos. Si es necesario, las células se pueden almacenar en esta etapa del proceso a 4 °C durante varios días hasta el análisis por citometría.</li>
	<li>Cada muestra debe contener alrededor de 106 células concentradas en 50 μl de PBS. Suspenderlos correctamente para evitar agregados durante el análisis y filtrarlos a través de un tintor de malla de 50 μm. 
	Nota: Cada paso debe realizarse con mucha suavidad para preservar las células.</li>
</ol>
4. Adquisición de ImageStream
Utilice el citómetro de flujo de imágenes multiespectrales ImageStream para adquirir imágenes de células. 
Hay que respetar algunos puntos:
<ol>
	<li>Seleccione un aumento adaptado (aquí se utiliza un objetivo de 40X).</li>
	<li>Si se utilizan fluorocromos: 
	- Preparar una muestra de control sin fluorocromo. 
	- Prepare las células con un control positivo de un solo color para cada fluorocromo utilizado en 
	además de sus muestras.</li>
	<li>Utilice el láser de 488 nm para excitar el FITC y el canal 02 para recoger la emisión de fluorescencia (paso de banda 480-560 nm). Además, utilice también los canales 01 y 06 para el campo claro (BF) y el campo oscuro (DF) respectivamente.</li>
</ol>
5. Post Procesamiento - Software de Análisis IDEAS (Versión 4.0)
<ol>
	<li>Entre todos los eventos adquiridos, el análisis debe restringirse primero a la población de celdas individuales: utilice un diagrama de puntos biparamétrico que represente la "relación de aspecto" (es decir, ancho/alto) frente al "área de celda" (parámetros aplicados a las celdas en BF) (Figura 1). Las células individuales incluidas en la región de interés con un área estándar y una relación de aspecto cercana a 1 se distinguen de eventos multicelulares (área grande y relación de aspecto pequeña) y escombros (área extremadamente pequeña).</li>
	<li>Para seleccionar celdas en el plano enfocado, utilice un diagrama de puntos biparamétrico adaptado para celdas marcadas con CNT altamente contrastadas: trace el 'contraste' frente al 'gradiente RMS' (que mide la calidad de nitidez de una imagen) en la imagen BF: permite la exclusión de celdas desenfocadas que muestran un gradiente rms bajo y un contraste bajo en sus imágenes BF (Figura 1).</li>
	<li>
	<ol>
		<li>Determine el parámetro que proporciona la mejor separación estadística entre las celdas etiquetadas y no etiquetadas mediante el uso de la opción "encontrar la mejor característica". En nuestro estudio, la característica media del objeto de píxel es el parámetro más adecuado (Figura 2).</li>
		<li>Traza un histograma utilizando este parámetro en comparación con la frecuencia normalizada para comparar la cantidad de CNTs absorbidos para las concentraciones probadas (Figura 3).</li>
		<li>Trazar el gráfico biparamétrico 'mean pixel object on BF' (Notación: Mean Pixel_Object (M01,Ch01,Tight)_Ch01) frente a 'intensity on DF'(Intensity_MC_Ch06), con el fin de estudiar la correlación entre estos dos parámetros (Figura 4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>La cuantificación también se valora mediante mascarillas:
	<ol>
		<li>Dado que los CNT aparecen como puntos oscuros fuertemente absorbentes en BF, primero cree una máscara de umbral que se ajuste a ellos con precisión seleccionando un rango restringido de píxeles con una intensidad baja comprendida entre 0-533 en este estudio (Máscara 1, notación: Intensidad (M01, BF, 0-533)) (Figura 5). La elección de la intensidad umbral se realiza en celdas marcadas en comparación con las celdas de control.</li>
		<li>Por el contrario, cree también una máscara que se ajuste a los píxeles de alta intensidad (150-4095 en este caso) del DF (Máscara 2, notación: Intensidad (M06, DF, 150-4095)) (Figura 6).</li>
		<li>Traza un gráfico usando el área de la máscara (ya sea 1 o 2; (notación: Area_Intensity(M01, BF, 0-533)para la mascarilla 1): proporcionará una cuantificación relativa de la internalización de CNTs a diferentes concentraciones (Figura 7).</li>
		<li>Compruebe el grado de correlación entre estas dos máscaras (gracias al gráfico biparamétrico 'área de la máscara 1' frente a 'área de la máscara 2') (Figura 7).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cree otras máscaras para localizar CNT en celdas:
	<ol>
		<li>Una máscara que se ajusta al interior de la celda: Erode (M01, 7) - correspondiente a la máscara de toda la celda (M01) (Figura 8), que se erosiona aún más de 7 píxeles (Figura 9).</li>
		<li>Una máscara que se ajusta a la membrana solo usando la ecuación booleana: M01 y no Erode(M01,7) - máscara de toda la célula (M01) sustraída del interior (Erode(M01,7)) (Figura 10).</li>
		<li>Para considerar los píxeles oscuros en la membrana (correspondientes a los CNT), cree entonces la máscara: Intensidad(M01 y no Erode(M01, 7), BF, 0-533) (Figura 11).</li>
		<li>Visualice las diferentes máscaras aplicadas en una colección de celdas para verificar su relevancia (Figura 12) para celdas etiquetadas y no etiquetadas.</li>
		<li>Aplique el área característica en la máscara seleccionando los píxeles negros en la membrana 'Area_Intensity(M01 and not Erode(M01, 7), BF, 0-533)' llamada área negra. Permitirá la cuantificación de los CNTs en la membrana. 
		 
		Para discriminar finalmente los CNTs que han sido internalizados de los adsorbidos solo en la membrana, trace el área negra en la membrana frente al área negra en toda la célula (es decir, 'Area_ Intensidad (M01 y no Erode(M01, 7), BF, 0-533' versus 'Area_ Intensidad (M01, BF, 0-533)'). 
		 
		nota: El mismo tipo de procedimiento se aplica con la señal fluorescente FITC: comparar el aumento de la intensidad de la fluorescencia FITC frente a la disminución de la señal media del píxel en el BF, o la colocalización entre las manchas oscuras en el BF y la intensidad de la fluorescencia FITC. En nuestro caso, este tipo de análisis no es relevante porque la señal de fluorescencia no coincide correctamente con las manchas oscuras en BF, por un lado, y con el campo claro en DF, por el otro, lo que demuestra que las propiedades intrínsecas de los CNTs (absorbancia y dispersión de la luz) son más apropiadas que la señal relacionada con la sonda de fluorescencia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Una vez que se hayan creado todos los gráficos en una condición experimental, cree una "plantilla de informe estadístico", guarde la plantilla como archivo .ast y agrupe todos los archivos de datos.</li>
</ol>

<ol><li>Kostarelos, K., Bianco, A., Prato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promises%2C+facts+and+challenges+for+carbon+nanotubes+in+imaging+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">Promises, facts and challenges for carbon nanotubes in imaging and therapeutics.</a> Nat. Nano. 4, 627-633 (2009).</li>
<li>De La Zerda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+nanotubes+as+photoacoustic+molecular+imaging+agents+in+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">Carbon nanotubes as photoacoustic molecular imaging agents in living mice.</a> Nat. Nano. 3, 557-562 (2008).</li>
<li>Zavaleta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+Raman+Spectroscopy+in+Living+Mice+for+Evaluation+of+Tumor+Targeting+with+Carbon+Nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Noninvasive Raman Spectroscopy in Living Mice for Evaluation of Tumor Targeting with Carbon Nanotubes.</a> Nano Lett. 8, 2800-2805 (2008).</li>
<li>Tong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+semiconducting+and+metallic+carbon+nanotubes+in+cells+and+mice+using+transient+absorption+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy.</a> Nat. Nano. 7, 56-61 (2012).</li>
<li>Welsher, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+route+to+brightly+fluorescent+carbon+nanotubes+for+near-infrared+imaging+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">A route to brightly fluorescent carbon nanotubes for near-infrared imaging in mice.</a> Nat. Nano. 4, 773-780 (2009).</li>
<li>Jin, H., Heller, D. A., Sharma, R., Strano, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+dependent+cellular+uptake+and+expusion+of+single-wall+carbon+nanotubes%3A+single+particle+tracking+and+a+generic+uptake+model+for+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Size dependent cellular uptake and expusion of single-wall carbon nanotubes: single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles.</a> ACS Nano. 3, 149-158 (2009).</li>
<li>Al-Jamal, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+mechanisms+of+functionalised+multi-walled+carbon+nanotubes+by+3D+electron+tomography+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake mechanisms of functionalised multi-walled carbon nanotubes by 3D electron tomography imaging.</a> Nanoscale. 3, 2627-2635 (2011).</li>
<li>Reuel, N. F., Dupont, A., Thouvenin, O., Lamb, D. C., Strano, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Tracking+of+Carbon+Nanotubes+within+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Tracking of Carbon Nanotubes within Living Cells.</a> ACS Nano. 6, 5420-5428 (2012).</li>
<li>Phanse, Y., Ramer-Tait, A. E., Friend, S. L., Carrillo-Conde, B., Lueth, P., Oster, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Cellular+Internalization+of+Nanoparticles+and+Bacteria+by+Multi-spectral+Imaging+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (64), e3884(2012).</li>
<li>Qian, F., Montgomery, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Imaging+of+Lineage-specific+Toll-like+Receptor-mediated+Signaling+in+Monocytes+and+Dendritic+Cells+from+Small+Samples+of+Human+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood.</a> J. Vis. Exp. (62), e3741(2012).</li>
<li>Marangon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+Carbon+Nanotube+Translocation+Assessed+by+Flow+Cytometry+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Intercellular Carbon Nanotube Translocation Assessed by Flow Cytometry Imaging.</a> Nano Lett. 12, 4830-4837 (2012).</li>
<li>Lacerda, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+mechanisms+of+chemically+functionalised+carbon+nanotubes+across+plasma+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Translocation mechanisms of chemically functionalised carbon nanotubes across plasma membranes.</a> Biomaterials. 33, 3334-3343 (2012).</li>
<li>Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAl-Jamal%2C+KT+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Balasubramanian, K., Burghard, M. 625, Humana Press. 123-124 (2010).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Insights+of+Transmembranal+Mechanism+and+Subcellular+Localization+of+Noncovalently+Modified+Single-Walled+Carbon+Nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">New Insights of Transmembranal Mechanism and Subcellular Localization of Noncovalently Modified Single-Walled Carbon Nanotubes.</a> Nano Lett. 10, 1677-1681 (2010).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

1. Modificación y solución de problemas
En este estudio, el primer objetivo fue evaluar la cantidad y la localización de los CNT en las células. La microscopía confocal podría haber sido a priori el método de oro para evaluar la distribución intracelular de los CNT funcionalizados con el marcador fluorescente FITC8,14. Sin embargo, el principal inconveniente es la limitación de las imágenes unicelulares y, por lo tanto, la falta de datos estadísticamente relevantes. El ImageStream permite trabajar más allá de estos obstáculos: de hecho, al examinar un gran número de células (5.000-10.000) en poco tiempo (<min), produce resultados estadísticamente robustos, mejorados también por las imágenes de alta resolución que proporcionan imágenes para cada célula con una resolución subcelular (0,5 μm). Permite analizar una gran cantidad de datos basados en el análisis de una sola imagen.
En comparación con la citometría de flujo convencional, la ventaja única de ImageStream es proporcionar imágenes multiespectrales de cada célula y una comparación píxel por píxel de la intensidad de la señal. Por lo tanto, ImageStream combina el poder estadístico de la citometría de flujo de alto rendimiento con las ventajas analíticas de las imágenes confocales para cada célula analizada. Es crucial para una cuantificación y localización relativa sin etiquetas de los CNT en las células.
2. Pasos críticos dentro del protocolo
El paso crítico consiste en la elección de los parámetros más adecuados para cada estudio. En nuestro caso, la mejor manera fue basar el análisis en las propiedades de absorción y dispersión de los nanotubos: la buena correlación entre la localización de las manchas oscuras en BF y los puntos brillantes en DF respalda que el método desarrollado es relevante y confiable, y puede que no haya sido posible sin imágenes celulares.
3. Limitaciones de la técnica
Debe enfatizarse que la visualización de los CNT en las células fue posible solo porque tienden a acumularse en las vesículas intracelulares endosomales y luego aparecen como fuertes puntos de absorción y dispersión. Los nanotubos individuales no deben detectarse con este método, mientras que eventualmente podrían detectarse con fluorescencia, lo que constituye una clara limitación. En segundo lugar, la cuantificación no es "absoluta" sino relativa para diferentes concentraciones de etiquetado y en comparación con las células de control no marcadas. Algunas características cuantitativas (píxel medio, intensidad, etc.) son parámetros absolutos, mientras que otras dependen de la elección de las máscaras (máscara de umbral, máscaras de localización).
4. Importancia con respecto a los métodos existentes
En lo que respecta a la fluorescencia, el análisis de ImageStream destaca la mala colocalización de los grupos de CNT entre la señal brillante FITC y los puntos en los otros canales. Por lo tanto, parece que la fluorescencia no fue un indicador confiable para la cuantificación y localización de CNT. Sin embargo, superando la limitación de la citometría de flujo convencional, que se basa principalmente en la cuantificación de fluorescencia, el ImageStream multiespectral de alto rendimiento allana el camino para una cuantificación estadística sin etiquetas , al tiempo que proporciona la localización de nanotubos de carbono dentro de las células.
5. Aplicaciones futuras
Este método de nanometrología estadística de alto rendimiento podría generalizarse a cualquier nanomaterial, que muestra una alta absorción y dispersión de la luz al interactuar con las células. Por lo tanto, puede tener aplicaciones importantes para las investigaciones de la nano-bio-interfaz, la nanotoxicología y la nanomedicina.

Durante las últimas décadas, el lugar de las nanopartículas ha ganado en importancia en una amplia gama de aplicaciones. En particular, los nanotubos de carbono (CNT) se exploran cada vez más como nanoherramientas para diversas aplicaciones diagnósticas y terapéuticas; gracias a sus particulares propiedades eléctricas, térmicas y espectroscópicas, los CNT pueden actuar como vehículos de administración de diversos fármacos o agentes de contraste, o también pueden participar en la ingeniería de tejidos1.
Sin embargo, las preocupaciones sobre la toxicidad potencial de tales nanomateriales aún están bajo debate, principalmente porque el destino de los CNTs en el organismo sigue siendo muy controvertido. De hecho, hay una falta de métodos apropiados para detectarlos y cuantificarlos en células y tejidos vivos: por ejemplo, se han sugerido técnicas como la espectroscopia Raman, la fotoacústica y la fotoluminiscencia en el infrarrojo cercano, pero cada método muestra limitaciones según el tipo de nanotubos y/o su entorno2-8.
Aquí, el método propuesto podría ser aplicable para la detección y cuantificación de nanopartículas en células. Esto fue posible gracias al uso de ImageStream, un dispositivo que combina citometría de flujo e imágenes de alta resolución. Combina las ventajas de adquirir una gran cantidad de celdas (hasta 5000 eventos/seg) y los beneficios de los datos estadísticos y las imágenes de alta resolución de cada celda al mismo tiempo (resolución espacial de 0,5 μm). Generalmente, las imágenes se recopilan utilizando una cámara CCD y son una representación bidimensional en escala de grises de la célula. La luz se cuantifica para cada píxel de la imagen e identifica tanto la intensidad como la ubicación de la fluorescencia o de los componentes con un tamaño subcelular (en BF, por ejemplo), lo que permite una poderosa capacidad para discriminar las células en función de su apariencia9,10. 
El objetivo era diseñar un método de nanometrología que permitiera una evaluación cuantitativa de la distribución y el comportamiento de los CNTs en las células. En particular, este método se desarrolló para estudiar la absorción, el procesamiento y la exocitosis celular de los CNT por parte de las células. Evidenciamos, en primer lugar, el complejo tráfico celular de CNTs y, en segundo lugar, la transferencia de estos nanomateriales entre células: los CNTs internalizados escapan de sus células huésped cuando están estresados, se diseminan en el espacio extracelular y son reinternalizados por células naif, ya sean homotípicas o heterotípicas11
.
Un estudio previo mostró que podrían ocurrir diferentes mecanismos de absorción celular, ya sean activos o pasivos, dependiendo de la funcionalización de CNT y el estado de agregación12. Aquí, los CNT de pared múltiple se funcionalizaron a través de cicloadición y amidación 1,3-dipolar y luego se derivatizaron con una sonda fluorescente, fluoresce en isotiocianato (FITC). En la microscopía electrónica de transmisión, parecen ser internalizados por las células, ya sea individualmente con localización citosólica o como haces, que se encuentran principalmente en los compartimentos endosomales y lisosomales11. En ImageStream, los CNT agrupados aparecen con una alta correlación como manchas oscuras en BF y puntos brillantes en DF, lo que permite una distinción clara entre las células marcadas con CNT y las células de control. Por otro lado, la distribución de la señal fluorescente emitida por el marcador fluorescente funcionalizado con CNTs no estaba tan bien colocalizada: de hecho, probablemente debido a un fenómeno de extinción, las manchas fluorescentes verdes no coinciden necesariamente con las manchas en BF y DF. Esto indica que, en primer lugar, una sonda fluorescente no es obligatoria para la detección de CNTs con el ImageStream, y en segundo lugar, a fortiori, que no es totalmente representativa tanto para la cuantificación como para la localización de CNTs.
Más allá de proporcionar una cuantificación relativa estadística de las nanopartículas, este método también proporciona información sobre la localización de los CNTs en las células, lo que significa que discrimina, por ejemplo, los CNTs en el interior de la célula frente a los que están unidos a la membrana plasmática. La capacidad de localizar CNTs en imágenes celulares supera claramente la limitación del análisis convencional de citometría de flujo13. El procedimiento se desarrolló aquí mediante la creación de máscaras que se ajustan a regiones específicas de la célula y seleccionando también las manchas oscuras correspondientes a los CNT cargados.
En términos generales, este método podría aplicarse a una amplia gama de experimentos que impliquen la necesidad de visualización, o cuantificación, en células con la condición de que las nanopartículas utilizadas sean capaces de absorber (y/o dispersar) fuertemente la luz.

<table><tbody><tr><td>ImageStream</td><td><a href="https://www.amnis.com/imagestream.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Amnis</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

localización y cuantificación relativa de nanotubos de carbono en las células con multiespectral de imágenes de citometría de flujo

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Nanomateriales a base de carbono, como los nanotubos de carbono (CNT), pertenecen a este tipo de nanopartículas que son muy difíciles de diferenciar de las estructuras celulares ricos en carbono y de hecho todavía no hay método cuantitativo para evaluar su distribución en los niveles de células y tejidos. Lo que proponemos aquí es un método innovador que permite la detección y cuantificación de los nanotubos de carbono en las células usando un flujo de imágenes multiespectrales citómetro (ImageStream, Amnis). Este dispositivo recién desarrollado integra tanto un alto rendimiento de las células y formación de imágenes de alta resolución, proporcionando de este modo imágenes para cada celda directamente en el flujo y por lo tanto el análisis de imágenes estadísticamente relevante. Cada imagen de la célula se adquiere en campo claro (BF), campo oscuro (DF), y los canales de fluorescentes, que da acceso, respectivamente, con el nivel y la distribución de la absorción de la luz, la luz dispersa y fluorescencia de cada célula. El análisis consiste entonces en una comparación píxel por píxel de cada imagen, de la 7,000-10,000 células adquiridas para cada condición del experimento. La localización y cuantificación de los nanotubos de carbono se hace posible gracias a algunas propiedades intrínsecas particulares de CNT: fuerte absorción de luz y la dispersión, de hecho CNT aparecen como absorbe fuertemente las manchas oscuras en BF y puntos brillantes en DF con una colocalización precisa. Esta metodología podría tener un impacto considerable en los estudios acerca de las interacciones entre los nanomateriales y las células ya que este protocolo es aplicable a una amplia gama de los nanomateriales, en la medida en que son capaces de absorber (y / o difusión) con suficiente fuerza a la luz.

En la Figura 1 se muestra una visión general del principio del dispositivo ImageStream. Este genera múltiples imágenes de alta resolución de cada célula en flujo, incluyendo campo brillante (BF), campo oscuro (DF o luz dispersada lateralmente) y canal(es) de fluorescencia, como se ejemplifica en la Figura 2 con tres células diferentes marcadas con CNTs. También se muestran las superposiciones de estos canales, que a primera vista ilustran la correlación.
Dado que todo el análisis posterior se basa en imágenes celulares, la selección de células enfocadas es crucial para el estudio (Figura 3). De hecho, la presencia de CNTs induce cambios tanto en el contraste como en el gradiente en comparación con células no marcadas: las células enfocadas, que han internalizado una cantidad importante de CNTs, tienden a tener un gradiente rms bajo (parámetro que normalmente se utiliza de forma única para discriminar entre células enfocadas versus desenfocadas), pero también un contraste elevado, lo que explica por qué un gráfico biparamétrico es esencial. En la Figura 3 se muestra la discriminación entre células desenfocadas (área amarilla) versus células enfocadas (área azul).
Los CNT internalizados por las células son claramente distinguibles, especialmente en el campo brillante, donde aparecen como puntos oscuros de fuerte absorción (véase el efecto de diversas concentraciones de marcado, Figura 4). Además, se analizó la señal media de píxeles en el campo brillante, obteniéndose una cuantificación relativa de la incorporación: las gráficas de la Figura 5 muestran un aumento significativo con la concentración de marcado de los CNT (resultados de aproximadamente 7.000 células por condición experimental).
En segundo lugar, la cuantificación de los CNT también es posible mediante el uso de máscaras, aplicadas ya sea sobre un rango restringido de píxeles oscuros del BF o sobre los píxeles de alta intensidad del DF (véanse ejemplos en la Figura 6), correspondientes a los puntos resultantes de la presencia de CNT. Así, graficar el área de estas máscaras permite resaltar, así como observar el aumento en la absorción (ejemplificado en la Figura 7 con el área de la máscara en BF, seleccionando píxeles en el rango de 0-533).
Además, la correlación entre los puntos en BF y DF se puede evaluar graficando la intensidad de DF frente a la señal media de píxeles en BF (como en la Figura 8) (análisis independiente de máscara) o el área de la máscara en BF (Máscara 1) frente al área en DF (Máscara 2).
Con respecto al procedimiento creado para la localización de los CNT dentro de las células, la figura 9A muestra las diferentes máscaras que se generaron. Téngase en cuenta que la robustez de las máscaras de localización (basadas en la erosión de la máscara celular predeterminada) debe verificarse visualmente en un conjunto de células marcadas y no marcadas. Las mismas máscaras se utilizan para todas las muestras.
Graficar el área total de los puntos negros en la membrana celular versus el área total en toda la célula proporciona una puntuación de internalización para células incubadas durante 20 h a 37 °C en comparación con una incubación de 2 h a 4 °C (véase Figura 9B); esto indica que los CNT se localizan principalmente en la membrana a 4 °C, mientras que a 37 °C los CNT se internalizan en más del 90 % de las células.
Finalmente, en cuanto a la fluorescencia, este parámetro no se utilizó como indicador para la cuantificación de los CNT debido a una correlación demasiado baja entre los puntos fluorescentes y los puntos en campo claro (y campo oscuro). De hecho, la correlación entre la intensidad de FITC y el valor medio de píxeles en campo claro indica un coeficiente de correlación de Pearson de -0,2. En la Figura 10, se ilustran dos casos en los que la señal de fluorescencia coincide adecuadamente o no con el punto negro en campo claro.
<img alt="Distribución óptica del ImageStream: diagrama que muestra la configuración de citometría de flujo con excitación láser y detección." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Visión general del funcionamiento del ImageStream. El sistema de imágenes multiespectrales adquiere hasta 12 imágenes/célula en tres modos diferentes: campo claro, campo oscuro y fluorescencia. La configuración consta de 5 láseres de excitación, incluyendo 405, 488, 560 y 658 nm. La luz se recoge de las células que fluyen en la cubeta mediante diferentes objetivos (en este estudio se utilizó el objetivo de 40X) y se dirige al elemento de descomposición espectral, que consiste en un conjunto de filtros paso alto dispuestos en una configuración angular. La cámara CCD que capta las imágenes celulares opera mediante una técnica denominada integración con retardo temporal para evitar el desenfoque de las imágenes. La profundidad extendida de campo (EDF) es una opción.
<img alt="Imagen de células, microscopía de fluorescencia, marcado con FITC, campo claro, campo oscuro, escala de 2 μm, análisis." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Galería de imágenes de células marcadas con nanotubos de carbono (50 μg/mL) capturadas mediante ImageStream a través de diversos canales (campo claro (BF), campo oscuro (DF), fluorescencia (FITC) y sus superposiciones). Los nanotubos de carbono confinados dentro de lisosomas intracelulares aparecen como grandes puntos negros en las imágenes de campo claro. Por el contrario, generan puntos brillantes en las imágenes de campo oscuro y en las de fluorescencia.
<img alt="Análisis de imágenes celulares; gráficos de dispersión de gradiente RMS frente a contraste; diagrama con datos de morfología celular." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. Selección de células enfocadas. El gráfico de puntos bivariado que representa el gradiente de la raíz cuadrada media (rms) frente al contraste en las imágenes de campo claro permite excluir las células desenfocadas. Aquí, el área amarilla representa células desenfocadas, mientras que las células enfocadas se muestran en azul. Las células desenfocadas se caracterizan por tener tanto bajo contraste como bajo valor rms del gradiente en la imagen de campo brillante. Además del gradiente rms, se requiere la característica de contraste para discriminar las células enfocadas tras su marcado con nanotubos de carbono (CNTs).
<img alt="Respuesta celular a concentraciones crecientes; imagen de microscopio; estudio de cambios en la morfología celular." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4. Captación dependiente de la dosis de CNT visualizada mediante ImageStream. El número y el área de los puntos negros en las imágenes de campo claro aumentan con la dosis de CNT durante la incubación con las células (que varía de 0 a 50 µg/ml). Obsérvese que las células control carecen de puntos negros.
<img alt="Gráfico de intensidad promedio de píxeles en equilibrio estático; frecuencia normalizada; respuesta a la dosis; análisis de datos." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5. Cuantificación relativa de la incorporación de CNT basada en las imágenes de campo brillante. Los histogramas de la característica media de píxeles aplicada a la máscara «objeto», que incluye toda la célula, muestran claramente un comportamiento dependiente de la dosis, que puede utilizarse para la cuantificación. El rango R9 incluye las células positivas para CNT.
<img alt="Imágenes de microscopía de campo claro y oscuro, análisis de intensidad de máscara, diferenciación de estructuras celulares." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 6"> 
Figura 6. Creación de máscaras para seleccionar puntos oscuros en imágenes de campo claro y puntos brillantes en imágenes de campo oscuro. Dado que los nanotubos de carbono (CNT) aparecen como puntos oscuros fuertemente absorbentes en la imagen de campo claro, se crea una máscara de umbral para seleccionar un rango restringido de píxeles con baja intensidad comprendida entre 0-533 en este estudio (Máscara 1, notación: Intensity(M01, BF, 0-533)). Por el contrario, se utiliza una máscara que se ajusta a los píxeles de alta intensidad (150-4095 en este caso) en la imagen de campo oscuro (Máscara 2, notación: Intensity (M06, DF, 150-4095)) para seleccionar puntos brillantes en campo oscuro, correspondientes a áreas de alta dispersión.
<img alt="Gráfico de distribución de frecuencia de la intensidad del área a concentraciones variables; control hasta 50 μg/mL." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 7"> 
Figura 7. La absorción dependiente de la dosis de CNTs se demuestra mediante la cuantificación del área de los puntos negros en las imágenes de BF. Mediante la aplicación de una máscara de umbral (máscara 1) sobre BF, se puede cuantificar el área de los puntos negros para cada célula, mostrando una distribución dependiente de la dosis.
<img alt="Scatter plot showing pixel intensity and object area analysis for image data comparison." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 8"> 
Figura 8. Los métodos de cuantificación de CNT basados en imágenes BF (absorción) y DF (dispersión) están correlacionados. A la izquierda, píxel medio en la imagen de BF versus intensidad en la imagen de DF, muestran una buena correlación para células marcadas con CNTs (50 µg/ml) (coeficiente de correlación de Pearson r = -0.68). A la derecha, área de la máscara que ajusta las manchas oscuras en BF versus área del ajuste de la máscara a los puntos brillantes en campo oscuro (DF) para células marcadas con CNTs (50 µg/ml). El coeficiente de correlación de Pearson es r = -0,83. Se representan valores de 7.000 células.
<img alt="Diagrama de análisis celular con efectos de temperatura, gráficos de dispersión, evaluación del área de la membrana en distintas condiciones." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 9"> 
Figura 9. Localización de CNT en células utilizando máscaras específicas. (A) Se crean máscaras para ajustarse a una ubicación particular de la célula, de izquierda a derecha: toda la célula, solo la membrana y el interior de la célula. Otra máscara ajusta las manchas negras gracias a un umbral de intensidad (Máscara 1, notación: Intensity(M01, BF, 0-533)). (B) La evaluación de la localización de los CNT se puede obtener midiendo el área de las manchas negras en diferentes localizaciones de las células, utilizando las máscaras de localización descritas en A. La incubación con CNT (50 µg/ml) se realizó tanto a 37 °C como a 4 °C para inhibir la vía de internalización. El gráfico que representa el área negra en la membrana frente al área negra en toda la célula muestra una absorción dependiente de la dosis de CNT en la membrana a 4 °C, mientras que la internalización completa de los CNT es efectiva a 37 °C.
<img alt="Microscopía de fluorescencia, análisis de células, tinción con FITC, superposición de campo brillante y fluorescencia." fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig10.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 10"> 
Figura 10. Colocalización de puntos negros inducidos por CNT en campo brillante (BF) con puntos brillantes de fluorescencia en la imagen de FITC. Los puntos brillantes de fluorescencia no siempre se colocalizan con los puntos negros en el campo brillante. Coinciden adecuadamente en las primeras dos células mostradas, pero no en las últimas dos células.

En este estudio, el objetivo principal fue monitorear la absorción celular y la eventual exocitosis de los nanotubos de carbono (CNTs). Desde esta perspectiva, propusimos aquí un método único que utiliza la citometría de flujo de imágenes multiespectrales que permite la cuantificación y localización de CNTs en un número estadísticamente relevante de células.

Localización y cuantificación relativa de nanotubos de carbono en las células con multiespectral de imágenes de Citometría de Flujo

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

El objetivo general del siguiente experimento es proporcionar un método nanometrológico para monitorear y cuantificar la absorción celular de nanotubos de carbono en un número estadísticamente relevante de células. Esto se logra primero tratando las células con nanotubos de carbono dispersables en agua, los cuales ingresan a las células de manera dependiente de la concentración. Estos nanotubos de carbono eventualmente se marcan con un indicador fluorescente.Luego de la fijación, cada célula se imagina en campo claro, campo oscuro y canales fluorescentes de un citómetro de flujo con imágenes multiespectrales. Para visualizar la distribución de los nanotubos de carbono y el nivel de absorción de luz, luz dispersada y fluorescencia que la marcación con nanotubos induce en cada célula, píxel por píxel. En última instancia, la absorción y dispersión intrínsecas de la luz dentro de las células permiten la localización y cuantificación de los nanotubos de carbono.Por lo tanto, este método puede ayudar a responder nuevas preguntas en los campos de la nanotoxicología y la nanomedicina, como el impacto y el destino de los materiales a base de carbono en células vivas, así como el potencial de los nanotubos de carbono como sistema de administración de fármacos. Comience por dispersar los nanotubos de carbono, eventualmente acoplados a una etiqueta fluorescente, en agua para cultivo celular. Luego, someta los nanotubos a sonicación en un baño de agua a 20 grados Celsius durante 20 minutos. A continuación, diluya los nanotubos en concentraciones de 0, 10, 20 y 50 microgramos por mililitro en medio completo, e incube dos mililitros de cada dilución con las células de interés en una placa de 25 centímetros cuadrados por dilución a 37 grados Celsius. Después de 20 horas, retire el medio de incubación de cada placa y lave las células marcadas con nanotubos de carbono con PBS.Después del lavado, la tripsina actúa sobre las células de cada placa y luego se resuspenden en medio DMEM completo. A continuación, transfiera cada muestra a tubos cónicos individuales de 15 mililitros, y luego centrifugue las células durante cinco minutos a 200 ×g y temperatura ambiente. Resuspenda cada pellet en paraformaldehído al 4 % a cuatro grados Celsius durante una hora.Después de la fijación, centrifugar nuevamente las células y resuspender cada muestra sedimentada en 15 veces 10 a la quinta células en 150 microlitros de PBS. A continuación, filtrar las muestras a través de filtros de malla individuales de 50 micrones para adquirir imágenes de las células con un sistema de flujo de imágenes. Citómetro de flujo de imágenes multiespectral.Primero, seleccione una magnificación adecuada y luego obtenga imágenes de las muestras de interés. Utilice un láser de 685 nanómetros para obtener imágenes en campo oscuro y configure el citómetro de flujo. El canal número seis recopilará la emisión en campo oscuro con un filtro de paso de banda de 745 a 800 nanómetros.Imaginar las muestras en los canales de campo claro número uno y de campo oscuro número seis para el análisis de imágenes. Primero, crear un gráfico de puntos paramétrico de relación de aspecto de ancho por alto frente al área celular. Esto permite discriminar las células individuales, que tienen un área estándar y una relación de aspecto cercana a uno, de los eventos multicelulares, que presentan un área grande y una relación de aspecto pequeña, y de los restos celulares, que exhiben un área extremadamente pequeña.Después de utilizar las imágenes de las células para verificar que se han seleccionado correctamente las células individuales, configure un diagrama de puntos bivariado para las células marcadas con nanotubos de carbono altamente contrastadas, representando el contraste frente al gradiente cuadrático medio, lo que permite excluir las células desenfocadas con bajo gradiente cuadrático medio y bajo contraste, y seleccionar las células en el plano enfocado. A continuación, utilice la herramienta de búsqueda de la mejor característica para determinar el parámetro que proporciona la mejor separación estadística entre las células marcadas y no marcadas. Por ejemplo, en este experimento representativo, la característica media de píxeles del objeto es la más adecuada.Luego, grafique este parámetro frente a la frecuencia normalizada para trazar un histograma que permita la cuantificación de los nanotubos incorporados por las células en cada concentración experimental. Ahora, grafique un gráfico biparamétrico del objeto medio de píxeles en campo claro versus la intensidad en campo oscuro. Para comprobar la correlación entre estos dos parámetros, la cuantificación de nanotubos también se evalúa mediante la creación en las imágenes celulares, ya que los nanotubos de carbono aparecen como puntos oscuros intensos. En el canal de campo claro, seleccione un rango restringido de píxeles con baja intensidad, por ejemplo, entre cero y 533, para crear la máscara de umbral, una que ajuste con precisión los nanotubos oscuros, con el fin de crear una segunda máscara denominada máscara dos para visualizar los nanotubos que aparecen brillantes en el canal de campo oscuro.Seleccione un rango de píxeles con alta intensidad. Por ejemplo, para este experimento se eligió un rango de 150 a 4,095. Luego, utilizando el área de la máscara de campo claro uno o la máscara de campo oscuro dos, configure un gráfico de puntos para cuantificar la internalización relativa de los nanotubos.Por ejemplo, grafique el área en el canal seis correspondiente al campo oscuro con la máscara dos frente al área en el canal uno, correspondiente al campo brillante con la máscara uno. Después de determinar la correlación lineal entre la máscara uno y la máscara dos, visualice los nanotubos dentro del citoplasma creando primero una máscara de toda la célula y luego erosionando la máscara. Ahora denote erosionar M 0 1 7 siete píxeles para observar el interior de la célula.Para visualizar los nanotubos de carbono dentro de la membrana celular, utilice la ecuación booleana M cero uno y no erosionar M 0 1 7. Esa es la máscara de toda la célula, sustraída del interior de la célula para crear una máscara únicamente de la membrana, con el fin de evaluar los píxeles oscuros en la membrana. Aplique la máscara de campo brillante uno a la máscara de la membrana.Aplique todas estas máscaras a múltiples células simultáneamente para confirmar una distinción entre las muestras marcadas y no marcadas. Luego, seleccione los píxeles negros sobre la membrana con la herramienta de área de características para cuantificar los nanotubos de carbono en la membrana celular. Finalmente, para discriminar los nanotubos de carbono que han sido internalizados de aquellos que se han absorbido sobre la membrana.Represente gráficamente el área negra de la membrana frente al área negra de toda la célula. Una vez que se hayan creado todas las gráficas para una condición experimental, elabore una plantilla de informe estadístico. Guarde la plantilla como un archivo A ST y procese todos los archivos de datos en lote.El dispositivo de secuencia de imágenes produce múltiples imágenes de alta resolución de cada célula en el citómetro de flujo, incluyendo canales de campo claro, campo oscuro y fluorescencia, como se demuestra aquí con tres células diferentes marcadas con nanotubos. También se muestran las superposiciones de estos canales. La presencia de nanotubos de carbono induce cambios tanto en el contraste como en el gradiente de las células marcadas en comparación con las células no marcadas.Por lo tanto, la creación de un gráfico de puntos biparamétrico es importante para seleccionar las células enfocadas. Las células desenfocadas en amarillo pueden discriminarse por su bajo contraste y bajo gradiente de raíz media cuadrática, independientemente de la presencia o ausencia de marcado con nanotubos. Las células enfocadas sin marca también presentan un bajo contraste, pero muestran una alta raíz media cuadrática del gradiente; cuando las células enfocadas están marcadas con nanotubos, sin embargo, las células muestran un perfil de alto contraste y bajo gradiente medio cuadrático.Los nanotubos de carbono internalizados se distinguen fácilmente, particularmente en el canal de campo brillante, donde aparecen como puntos oscuros intensos, cuyas áreas aumentan con la concentración de nanotubos. Cuando se analizan las señales medias de píxeles de las imágenes de campo brillante, puede determinarse una cuantificación relativa de la absorción de nanotubos. Por ejemplo, estos histogramas demuestran el aumento significativo en la absorción de nanotubos que ocurre con cada incremento en la concentración de marcado de nanotubos, tal como se muestra. Asimismo, la cuantificación de nanotubos de carbono es posible mediante el uso de máscaras aplicadas ya sea en un rango restringido de píxeles oscuros dentro de una imagen de campo claro, o en los píxeles de alta intensidad dentro del campo oscuro, correspondientes a las áreas donde se encuentran los nanotubos.La representación gráfica del área de estas máscaras permite además cuantificar la absorción de nanotubos de carbono. Asimismo, la correlación entre los puntos en las imágenes de campo claro y oscuro puede evaluarse graficando la intensidad de campo oscuro frente a la señal media de píxeles en campo claro, o graficando el área de la máscara dentro del campo claro frente al área dentro del campo oscuro. En las siguientes dos figuras, se muestran análisis de los nanotubos de carbono localizados en el interior de la célula.Estas primeras imágenes muestran las diferentes máscaras que se crearon. Tenga en cuenta que la robustez de las máscaras de localización basadas en la erosión de la máscara celular predeterminada debe verificarse visualmente en el conjunto de células marcadas y no marcadas. Como se acaba de demostrar en estos diagramas de puntos, se representó gráficamente el área total de los puntos negros en la membrana celular frente al área de la célula completa para determinar el puntaje de internalización.Para células que han sido incubadas durante 20 horas a 37 grados Celsius en comparación con células que fueron incubadas durante dos horas a cuatro grados Celsius, los nanotubos de carbono se encuentran principalmente localizados en la membrana, mientras que a 37 grados Celsius, los nanotubos de carbono son internalizados en más del 90 % de las células. La fluorescencia del nanotubo de carbono no es un buen indicador de la internalización del nanotubo de carbono debido a una correlación demasiado baja entre los puntos fluorescentes y los puntos dentro de los canales de campo claro y oscuro. De hecho, la correlación entre la intensidad fitzy y el valor medio de píxeles en campo claro indica un coeficiente de correlación de Pearson de menos 0,2.Como se muestra en estas imágenes, la señal fluorescente no coincide de forma confiable con los puntos negros del campo claro, los nanotubos de carbono, el confinamiento y la agregación dentro de los lisosomas intracelulares, lo que atenúa parcialmente la señal fluorescente. En contraste, los nanotubos dispersos pueden proporcionar una señal fluorescente más fiable tras su desarrollo. Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la nanotecnología y la nanomedicina exploren la interacción de células vivas con nanomateriales basados en carbono o con cualquier nanomaterial que tenga una alta capacidad de absorción y dispersión de la luz, mediante un método estadístico de citometría de alto rendimiento.

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Localización y cuantificación relativa de nanotubos de carbono en las células con multiespectral de imágenes de Citometría de Flujo (Video) | JoVE Journal

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