Aislamiento Manual de células madre derivadas de tejido adiposo de Lipoaspirates Humanos
26 de septiembre de 2013
En 2001, investigadores de la UCLA describen el aislamiento de una población de células madre adultas, denominada células madre o las ASC derivadas de tejido adiposo, a partir de tejido adiposo. En este artículo se describe el aislamiento de las ASC de lipoaspirates utilizando un protocolo de digestión manual, enzimática utilizando colagenasa.
El objetivo general de este procedimiento es aislar las células madre derivadas del tejido adiposo de la grasa obtenida en forma de lipoaspirado. Esto se logra eliminando primero la solución quirúrgica y lavando el aspirado de los glóbulos rojos contaminantes. El segundo paso es liberar las células madre a través de la digestión enzimática del lipoaspirado lavado con colagenasa.
A continuación, las células liberadas en forma de fracción vascular estromal o SVF se recogen por centrifugación. El paso final es eliminar el sobrenadante y la placa, las células SVF para la selección y el cultivo de las ASC adherentes. En última instancia, la inducción in vitro de estos ASC cultivados hacia el hueso, la grasa y el cartílago.
Los linajes se pueden utilizar para confirmar la presencia de estas células dentro del cultivo, además de confirmar su multipotencialidad. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la logística de trabajar con grandes volúmenes de lipoaspirina antes de la recolección de células. Prepare una solución estéril de colagenasa tipo uno y un medio de control estéril.
Recoja el aspirado de lippo en un recipiente de aspiración. Decantar cuidadosamente el lippo aspirado en un altavoz de vidrio estéril de un litro. Cuando las capas de lippo aspirado se hayan separado por gravedad, aspire la capa superior de aceite si está presente.
Además, retire la parte inferior inate. Evaluar el volumen de la capa de tejido adiposo resultante. Agregue un volumen igual de un XPBS estéril y revuelva con la pipeta utilizada para la aspiración.
Cuando las dos capas se hayan asentado, aspire el inado con una pipeta serológica de 10 mililitros. Continúe lavando la fracción de tejido adiposo con PBS hasta que la capa adiposa tenga un color amarillo dorado. Aspirar el inado por última vez, dejando la fracción de tejido adiposo.
En el altavoz de cristal. Deje que las capas de aspirado de lippo se asienten durante cinco minutos después del último lavado y antes de la aspiración final. En una unidad de filtro, prepare la colagenasa estéril en una solución.
Añadir un volumen igual al de la fracción adiposa y filtro estéril. A continuación, vierta con cuidado la fracción adiposa lavada en la solución de colagenasa y cierre bien el frasco. A continuación, incubar la mezcla adiposa de colagenasa en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 30 minutos con un suave remolino cada cinco a 10 minutos, evaluar la capa de tejido adiposo para obtener una apariencia más suave a medida que avanza la digestión y, si es necesario, aumentar el tiempo de reacción para disolver los trozos sólidos de grasa.
Esterilice la unidad de filtro que contiene la mezcla adiposa de colagenasa digerida con etanol al 70% y vuelva a colocarla en el gabinete de bioseguridad. Ahora pipetee 25 mililitros de alícuotas del inato que contiene la fracción vascular estromal en tubos de centrífuga estériles de 50 mililitros. Agregue 25 mililitros de medio de control a cada tubo e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos para inactivar la colagenasa.
A continuación, centrifugar durante 10 minutos a 1.200 veces G para recoger la fracción vascular estromal en forma de gránulos en la cabina de bioseguridad. Aspire el sobrenadante de cada tubo. Asegúrese de que la capa superior de aceite y los adipocitos flotantes sean aspirados con este sobrenadante.
A continuación, combine los gránulos SVF en un tubo de centrífuga utilizando 30 mililitros de medios acondicionados y divídalos en partes iguales en dos nuevos tubos de centrífuga de 50 mililitros después de que la centrifugación aspire los sobrenadantes de los dos gránulos. Si se desea la lisis de glóbulos rojos, estos dos gránulos se pueden resuspender en 10 mililitros de un tampón de lisis de glóbulos rojos y se pueden incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de la centrifugación, aspire los sobrenadantes para producir gránulos de la fracción vascular estromal.
Combine estos dos gránulos en un nuevo tubo de centrífuga. Usando de cinco a 10 mililitros de medios de control, las partículas grandes de tejido se pueden filtrar usando un filtro de malla de 100 micrones colocado encima de un nuevo tubo de centrífuga de 50 mililitros. Ahora alícuota la fracción filtrada que contiene las células madre adiposas en placas de cultivo de tejidos.
A continuación, complemente cada plato con un volumen adecuado de control. Cultura mediática. Las células durante tres a cuatro días sin cambio de medio aspiran el cultivo, el medio y lavan las células una vez con PBS estéril para eliminar cualquier glóbulo rojo contaminante, luego reponen el medio y continúan con el cultivo cuando se usa este enzimático manual para el aislamiento de una fracción vascular estromal de una muestra de aspirado de lippo de gran volumen.
La población SC A cultivada resultante es relativamente homogénea en apariencia y está compuesta por células similares a fibroblastos como el medio más popular de validación. La inducción in vitro de la población A SC utilizando condiciones de cultivo definidas, da como resultado su diferenciación en linajes mesodérmicos, ectodérmicos y endodérmicos. Mientras que el potencial de la capa germinal triple in vitro ha dado lugar al uso de ASC para una amplia variedad de sistemas modelo regenerativos.
La diferenciación en células adipogénicas, osteogénicas y congénitas es generalmente suficiente para identificar la A SC y confirmar su multipotencia. Además, las ASC también se pueden diferenciar en linajes esqueléticos, miogénicos y miogénicos lisos, células del linaje ectodérmico o linaje de células hepáticas endodérmicas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar una fracción vascular estromal de Lipos.
A los efectos de Turing, es un componente SC.
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Resumen
Este artículo describe el aislamiento de células madre derivadas del tejido adiposo (ASC) a partir de lipoaspirados mediante un protocolo manual de digestión enzimática con colagenasa. El proceso incluye lavar el aspirado, realizar la digestión enzimática y cultivar las células para su posterior estudio.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología de Células Madre
- Medicina Regenerativa
- Ingeniería de Tejidos
Antecedentes
- Las células madre derivadas del tejido adiposo (ASC) son una fuente prometedora para terapias regenerativas.
- Las ASC pueden diferenciarse en diversos tipos celulares, incluyendo hueso, grasa y cartílago.
- El aislamiento de las ASC a partir del tejido adiposo es crucial para su aplicación en investigación y terapia.
- Estudios previos han establecido métodos para el aislamiento de ASC, pero la optimización continúa en curso.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para el aislamiento de CEA a partir de lipoaspirados.
- Mejorar la eficiencia del aislamiento de CEA con fines de investigación.
- Facilitar el estudio de la diferenciación de CEA y sus posibles aplicaciones terapéuticas.
Métodos Utilizados
- Eliminación de la solución quirúrgica y lavado del lipoaspirado.
- Digestión enzimática del lipoaspirado lavado utilizando colagenasa.
- Recolección de la fracción vascular estromal (SVF) mediante centrifugación.
- Siembra de las células de la SVF para selección y cultivo de ASCs adherentes.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de CEA a partir de lipoaspirados utilizando el protocolo descrito.
- Se obtuvieron CEA viables y se cultivaron para estudios posteriores de diferenciación.
- El método demostró eficiencia en la eliminación de contaminantes y en la maximización del rendimiento celular.
- Las CEA mostraron potencial para diferenciarse en múltiples linajes celulares in vitro.
Conclusiones
- El protocolo de digestión enzimática descrito es eficaz para el aislamiento de ASC.
- Los ASC aislados pueden utilizarse para diversas aplicaciones en medicina regenerativa.
- Se necesitan estudios adicionales para explorar el potencial completo de los ASC en contextos terapéuticos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento de células madre derivadas del tejido adiposo (ASC) a partir de lipoaspirados proporciona una fuente ampliable de células multipotentes para la investigación en medicina regenerativa en fases iniciales. Este protocolo permite la validación de dianas y el cribado fenotípico en sistemas relevantes para enfermedades, generando poblaciones adherentes de ASC con capacidad de diferenciación multilinaje. El método apoya la reducción mecanicista de riesgos y la confianza predictiva en modelos preclínicos al producir células homogéneas derivadas de la fracción estromal vascular para aplicaciones posteriores.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de la heterogeneidad de las células estromales mesenquimales y la validación funcional de la multipotencialidad de las CEA mediante ensayos de diferenciación definidos.
- Valor operativo: Proporciona un método reproducible para aislar CEA a partir de tejido adiposo humano, reduciendo la variabilidad en el abastecimiento de células primarias para estudios de validación de dianas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera poblaciones adherentes de ASC adecuadas para la selección de alto contenido de compuestos que modulan las vías adipogénica, osteogénica o condrogénica.
- Valor operativo: Produce pellets de la fracción vascular estromal (SVF) que pueden estandarizarse en diferentes volúmenes de lipoaspirado, favoreciendo la escalabilidad de ensayos y la reproducibilidad entre laboratorios.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: La diferenciación en linajes adipogénicos, osteogénicos y condrogénicos confirma la potencia funcional, lo que permite su uso en modelos preclínicos de regeneración tisular.
- Valor operativo: El aislamiento escalable a partir de lipoaspirados de gran volumen respalda un suministro constante de células para estudios preclínicos longitudinales y trabajos orientados a la obtención de autorización para ensayos clínicos (IND).
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El flujo de trabajo de aislamiento de ASC se integra en el continuo de descubrimiento, desde la identificación del blanco hasta la optimización del fármaco líder, proporcionando una fuente renovable de células para ensayos mecanicistas y cribado fenotípico antes de la validación preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis sobre la función de las células estromales y la modulación de vías en poblaciones mesenquimales derivadas de humanos.
- Cribado: Proporciona monocapas adherentes de ASC con morfología consistente para el cribado de bibliotecas de compuestos y el perfilado de respuesta a la dosis.
- Análisis: Permite la cuantificación de la eficiencia de diferenciación mediante tinciones específicas de linaje (por ejemplo, rojo de oil O, alizarina rojo) como lectura cuantitativa de los efectos de los compuestos.
- Investigación Traducional: La capacidad de diferenciación en linajes mesodérmicos favorece la continuidad hacia modelos preclínicos de reparación ósea, adiposa y cartilaginosa.
- Reutilización Empresarial: La adaptabilidad del protocolo a diferentes volúmenes de lipoaspirado permite su reutilización en múltiples proyectos y áreas terapéuticas sin necesidad de reoptimización.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reducción de la ambigüedad mecanicista mediante la evaluación validada de la multipotencialidad de las ASC aisladas.
- Valor operativo: La estandarización de los pasos de digestión enzimática y lavado minimiza la variabilidad entre lotes en el rendimiento del SVF.
- Valor estratégico: Decisiones informadas de continuar o descartar basadas en el potencial de diferenciación reducen la pérdida en etapas avanzadas de los programas regenerativos.
- Impacto en la cartera: La priorización ajustada al riesgo de terapias derivadas de ASC, permitida por métricas fiables de potencia obtenidas mediante diferenciación in vitro.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de células primarias y técnica estéril para mantener la viabilidad de las ASC durante el aislamiento.
- Depende del acceso a colagenasa Tipo I estéril, cabinas de seguridad biológica y centrífugas refrigeradas para el procesamiento de la FSV.
- Necesita la estandarización de los protocolos de lavado para lograr una coloración uniforme del tejido adiposo y la eliminación de glóbulos rojos.
- Las consideraciones de adaptación incluyen el ajuste de la concentración de colagenasa y el tiempo de incubación según la densidad del lipoaspirado y la variabilidad del donante.
- Las limitaciones prácticas incluyen la variabilidad en el rendimiento celular relacionada con la edad del donante, el IMC y la técnica de liposucción, como se indica en el material fuente.
