Aislamiento, Purificación y Etiquetado de neutrófilos de médula ósea de ratón de Estudios funcionales y experimentos de transferencia adoptivos

El objetivo general de este procedimiento es aislar y marcar neutrófilos de la médula ósea de ratón para estudios funcionales posteriores y experimentos de transferencia adoptiva. Esto se logra recolectando primero las células de la médula ósea de la médula ósea, los fémures y la tibia. Durante el segundo paso, los glóbulos rojos se unen osmóticamente suspendiéndolos secuencialmente en soluciones de cloruro de sodio al 0,2% y al 1,6% respectivamente.

A continuación, se aíslan los neutrófilos mediante centrifugación en gradiente de densidad. En el paso final, los neutrófilos se marcan con tintes rastreadores de células. En última instancia, la citometría de flujo se puede utilizar para determinar el número de neutrófilos transferidos adoptivamente reclutados a varios tejidos de ratón.

La principal ventaja de aislar los neutrófilos de ratón de la médula ósea en lugar de la sangre o el peritoneo, es que el gran número de células suficiente para los estudios funcionales posteriores y los experimentos de transferencia adoptiva se puede obtener de la médula ósea tanto durante el estado estacionario como después de la infección. La ventaja de utilizar una técnica de centrifugación en gradiente para aislar neutrófilos de ratón sobre la selección inmunomagnética de la clasificación de células activadas por fluorescencia es que es rápida, económica y evita el marcaje de los neutrófilos con anticuerpos que pueden inducir la activación de los neutrófilos. La demostración del procedimiento estará a cargo de muca swami us, un técnico de mi laboratorio después de rociar un ratón sacrificado con etanol al 70%.

Haga una incisión en la región abdominal media de la piel del animal y luego extraiga el tejido cutáneo de la parte distal del animal, incluidas las extremidades inferiores. A continuación, utilice unas tijeras para cortar los músculos de las extremidades traseras del animal y luego disloque con cuidado el beum ACE de la articulación de la cadera, evitando romper la cabeza del fémur. A continuación, utiliza las tijeras de un bisturí para extraer el músculo restante del fémur y la tibia.

Separe los huesos de la pierna en la articulación de la rodilla, teniendo cuidado de no romper los extremos de los huesos, y luego coloque los huesos en una placa de Petri que contenga RPMI 1 6 4 oh. Suplementar con FBS y antibióticos. Transfiera la placa a una campana de cultivo de tejidos y luego esterilice el exterior de cada hueso con etanol al 70% en una nueva placa de Petri.

Después de unos 10 a 15 segundos, enjuague el etanol de la superficie de cada hueso con tres lavados posteriores en PBS estéril y helado. A continuación, corte y coloque la epífisis de cada uno de los huesos en una nueva placa de Petri estéril. A continuación, conecte una aguja de calibre 25 a una jeringa de 12 cc llena de 10 mililitros de RPMI.

Suplementar con FBS y EDTA. A continuación, enjuague las células de la médula ósea de ambos extremos del eje de cada par de fémur y tibia en un tubo Falcon con tapa de rosca de 50 mililitros desteñido con un filtro de 100 micrómetros para eliminar todas las células. Raspe las superficies internas de los huesos con la punta de la aguja.

Cuando los huesos parecen blanqueados, las células se han eliminado lo suficiente. Ahora use un bisturí para cortar las epífisis óseas en pequeños trozos Q de 0,5 a un milímetro, y luego use el extremo posterior de una punta de peine einor de 2,5 mililitros más la punta de la pipeta BioPure para aplastarlas a través del filtro de 100 micrómetros. Después de centrifugar las células recolectadas durante siete minutos a 427 veces G y cuatro grados Celsius, los glóbulos rojos en 20 mililitros de cloruro de sodio al 0,2% durante aproximadamente 20 segundos.

Luego detenga la lisis con 20 mililitros de cloruro de sodio al 1,6%, gire las células y luego vuelva a suspender el pellet en RPMI 1 6 4 oh suplemento con FBS y EDTA. Cuente las celdas y luego, después de girarlas nuevamente, vuelva a suspender la bolita lavada a no más de 100 veces 10 a las seis celdas por un mililitro de hielo. El PBS estéril frío ahora dispensa tres mililitros de 18 a 26 grados Celsius, su opaco 1 1 1 9 en un tubo cónico de 15 mililitros, y luego superpone lentamente tres mililitros de 18 a 26 grados Celsius.

Su opaco 1 0 7 7. Evitando mezclar las dos densidades inmediatamente después de preparar la suspensión de células de médula ósea opaca en la parte superior de la centrífuga opaca 1 0 7 7, el gradiente de densidad durante 30 minutos a 834 veces G y 25 grados Celsius sin la ruptura, y luego recoger los neutrófilos en la interfaz de las capas opacas 1 1 1 9 y 1 0 7 7. Después de lavar los neutrófilos recolectados dos veces en RPMI 1, 6, 4 oh, FBS y antibióticos, Resus suspende las células a cinco veces 10 a las seis células por mililitro en PBS Precalentar a 37 grados Celsius.

Después de contar las células, reserve una pequeña alícuota de cada muestra experimental para determinar la pureza y la viabilidad mediante citometría de flujo y luego marque los neutrófilos restantes con un tinte rastreador de células a una concentración final de cinco micromolares durante 10 minutos a 37 grados Celsius en un baño de agua agitada en la oscuridad. Finalmente, lave las células dos veces con un suplemento frío de hielo RPMI 1 6 4 oh con FBS y antibióticos para evitar la contaminación cruzada del tinte antes de mezclar las poblaciones de neutrófilos marcados diferencialmente para estudios de repoblación competitivos posteriores. Aquí, en este panel se muestran gráficos representativos de citometría de flujo de neutrofilos separados por gradiente de densidad aislada de médula ósea de un ratón C 57 negro seis no infectado. La compuerta inicial utilizada para las células de la médula ósea recolectadas de la interfaz del histopata 1 1 1 9 y el histopata 1 0 7 7.

Usando dispersión directa y lateral se demuestra que los neutrófilos separados por gradiente de densidad son superiores al 90% de pureza y superiores al 95% de viabilidad durante al menos cuatro horas después de la adopción del rastreador de células de transferencia. Los neutrófilos de la marca DIA pueden ser rastreados por citometría de flujo en varios problemas de ratón. Por ejemplo, en la sangre, la médula ósea y los riñones del ratón C 57 negro seis infectado con cándida que se muestra en este experimento mediante la activación de las células B CD 45 LY seis G CD 11 vivas, estos neutrófilos marcados con C-M-T-M-R transferidos adoptivamente representativos se pueden diferenciar de los neutrófilos C-M-T-M-R nativos y PE negativos del ratón receptor por su expresión de PE.

Una vez dominado, el aislamiento y el marcaje de los neutrófilos de la médula ósea del ratón pueden completarse en tres horas.