Name: Aislamiento, Purificación y Etiquetado de neutrófilos de médula ósea de ratón de Estudios funcionales y experimentos de transferencia adoptivos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Aprende a aislar y etiquetar neutrófilos de médula ósea de ratón mediante centrifugación en gradiente de densidad y colorantes CellTracker. Este protocolo económico permite estudios funcionales y transferencias adoptivas.

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Este trabajo fue apoyado por la División de Investigación Intramural del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID), el Instituto Nacional de Salud (NIH), EE.UU.. Todos los ratones fueron mantenidos a una Asociación Americana para la Acreditación de la instalación para animales acreditado Cuidado de Animales de Laboratorio del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID) y alojados de conformidad con los procedimientos establecidos en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio bajo los auspicios de un protocolo aprobado por el Cuidado de Animales y el empleo del NIAID.

1. Aislamiento de células de médula ósea de ratón <ol><li> La eutanasia a los ratones que usan el protocolo de cuidado de animales de la institución comité aprobado y rociar la superficie del animal con 70% de etanol. </li><li> Hacer una incisión de la piel en la mitad del abdomen y quitar la piel de la parte distal del ratón incluyendo la piel que cubre las extremidades inferiores. </li><li> Cortar los músculos de las extremidades inferiores con unas tijeras y dislocar cuidadosamente el acetábulo de la articulación de la cadera, evitando romper la cabeza del fémur. </li><li> Quitar los músculos restantes del fémur y de la tibia con un bisturí y tijeras y separar del fémur de la tibia en la rodilla cuidado de las articulaciones ejercicio para no romper los extremos del hueso. Coloque los huesos en una placa de Petri que contiene medio RPMI enfriado con hielo 1640 1X suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina / estreptomicina. </li><li> Continúe con los siguientes pasos bajo una campana de cultivo de tejidos. Tome precauciones adicionales para mantener estrictas técnicas estériles para evitar neutrophiactivación l. </li><li> Enjuague cada hueso con 70% de etanol (en una placa de Petri) seguido de tres lavados posteriores en PBS enfriado en hielo estéril (dentro de placas de Petri) para enjuagar el etanol a partir de la superficie de los huesos. </li><li> Dentro de una caja de Petri estéril limpio, cortar las epífisis de los huesos y mantener a un lado. </li><li> Utilice una aguja de calibre 25 y una jeringa de 12 cc llena con medio RPMI suplementado con 10% de FBS y 2 mM de EDTA, y lavar las células de médula ósea de ambos extremos de los ejes de hueso en un tornillo ml de la tapa del tubo Falcon de 50 equipado con un 100 micras filtrar. Con el fin de eliminar de manera eficiente todas las células, raspar la superficie interna de los huesos usando la aguja de calibre 25. </li></ol> NOTA: El blanqueo de los huesos indica que las células han sido suficientemente raspado. NOTA: Utilice aproximadamente 10 ml de medio para eliminar un fémur / la tibia par. Adición de EDTA para el medio es esencial para evitar la aglutinación de las células. <ol start="9"><li> Cortar las epífisis óseasen pequeños pedazos 0.5-1 mm 3 con un bisturí y aplastar a través del filtro de 100 micras utilizando la parte de atrás de un 2,5 ml Eppendorf Combitip Plus Biopur punta de pipeta. </li><li> Centrifugar a 1400 rpm durante 7 min a 4 ° C. </li><li> Lisar las células rojas de la sangre mediante la resuspensión del sedimento celular en 20 ml de NaCl al 0,2% durante aproximadamente 20 segundos seguido por la adición de 20 ml de 1,6% de NaCl. (Crítica: No exceda 20-30 segundos de lisis hipotónica para evitar la muerte de células de médula ósea se recomienda el uso de NaCl para la lisis hipotónica sobre tampón de lisis ACK ya que este último tiene la posibilidad de activar los neutrófilos.). </li><li> Centrifugar durante 7 min a 1400 rpm a 4 ° C para recoger las células. </li><li> Lavar las células con medio RPMI 1640 suplementado con 1X 10% de FBS y 2 mM de EDTA y se centrifuga como en el paso 1,12. </li><li> El rendimiento de células de médula ósea utilizando este método es aproximadamente un 60-80 millones por no infectada 8-12 semanas de edad C57BL / 6 de ratón. </li></ol> 2. La separación de neutrófilospor centrifugación en gradiente de densidad <ol><li> Contar las células de médula ósea y resuspender en 1 ml de PBS enfriado en hielo estéril. </li><li> Añadir 3 ml de Histopaque 1119 (densidad, 1,119 g / ml) en un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Superposición de 3 ml de Histopaque 1077 (densidad, 1,077 g / ml) en el 3 ml de Histopaque 1119. </li></ol> NOTA: Histopaque 1119 y Histopaque 1077 se deben calentar a 18-26 ° C antes de su uso. Paso Crítico: Preparar gradientes inmediatamente antes de su uso como la preparación de la gradiente de antemano dará lugar a la difusión entre las dos capas y la pureza y la recuperación de neutrófilos subóptima. Paso Crítico: Superposición de Histopaque 1077 más de 1.119 necesidades que ser hecho lentamente con el fin de evitar la mezcla de las dos densidades, que se oponen a la separación de células durante la centrifugación. <ol start="4"><li> Superposición de la suspensión de células de médula ósea en la parte superior de la Histopaque 1077. </li></ol> Paso Crítico: overlaying la suspensión de células de médula ósea sobre Histopaque 1077 queda mucho por hacer lentamente con el fin de evitar molestar a la interfaz entre las células y Histopaque 1077. NOTA: La resuspensión células de médula ósea de un ratón no infectado en 1 ml de PBS produce neutrófilos pureza de&gt; 90%. Sin embargo, la puesta en común muchas muestras de médula ósea compromete la pureza de los neutrófilos, por ejemplo, resuspendiendo x 10 6 células 300 en 3 ml de PBS reduce la pureza de neutrófilos a partir de&gt; 90% a ~ 80%. Por lo tanto, los investigadores deben realizar experiencias piloto para identificar las condiciones de conteo / volumen celular ideal para sus experimentos específicos <ol start="5"><li> Centrifugar durante 30 min a 2000 rpm a 25 ° C sin freno. </li></ol> NOTA: La centrifugación del gradiente a temperatura ambiente es crítica y esencial para la separación eficaz de los neutrófilos. <ol start="6"><li> Recoger los neutrófilos en la interfaz de la Histopaque 1119 y Histopaque 1077 capas. </li&gt; <li> Lavar los neutrófilos recogidos dos veces con medio RPMI 1640 suplementado con 1X 10% de FBS y 1% de penicilina / estreptomicina y se centrifuga a 1400 rpm durante 7 min a 4 ° C. </li><li> Cuente los neutrófilos y determinar su viabilidad. </li></ol> NOTA: Los neutrófilos son típicamente&gt; 95% viable y&gt; 90% puro según se determina por análisis FACS. El rendimiento típico de neutrófilos desde la médula ósea (es decir, 2 fémur y la tibia 2 huesos) de una no infectada 8-12 semanas de edad C57BL / 6 del ratón es ~ células 6-12.000.000. Este número es sustancialmente mayor cuando se cosechan los neutrófilos desde la médula ósea de los animales infectados. Por lo tanto, ~ 30-40 millones de neutrófilos / ratón se recuperaron cuando se utilizaron ratones infectados por Candida para la cosecha de 6 celdas. 3. Etiquetado de los neutrófilos con colorantes CellTracker <ol><li> Resuspender los neutrófilos a 5 x 10 6 células / ml en PBS precalentado a 37 º C. </li><li> Añadir un tinte CellTracker a una concent definitivaración de 5 mM. </li></ol> NOTA: CellTracker Green (CMFDA (5 Chloromethylfluorescein Diacetate) y CellTracker Orange (CMTMR (5 - (y-6)-4-clorometil tetrametilrodamina Amino benzoilo) fue utilizada en este protocolo para etiquetar diferencialmente neutrófilos de tipo salvaje y el gen deficiente ratones. NOTA: Se prepara una solución madre de 10 mM de CellTracker verde y CellTracker Orange, alícuota y almacenar a -80 ° C hasta el día del experimento. <ol start="3"><li> Incubar los neutrófilos con 5 M del colorante CellTracker correspondiente durante 10 min a 37 ° C en un baño de agua con agitación en la oscuridad. </li><li> Lavar las células dos veces con helado de medio RPMI 1640 suplementado con 1X 10% de FBS y 1% de penicilina / estreptomicina. </li></ol> NOTA: un lavado eficaz de las células después es esencial el paso marcado con el colorante CellTracker para evitar la contaminación cruzada de tinte antes de mezclar poblaciones de neutrófilos diferencialmente etiquetados para amortizacionesestudios de repoblación competitivos tream. 4. La transferencia adoptiva de neutrófilos en ratones y análisis de neutrófilos transferidos mediante citometría de flujo <ol><li> Volver a suspender las neutrófilos en PBS enfriado en hielo a una concentración de 25 x 10 6 células / ml e inyectar 200 l de la suspensión en la vena lateral de la cola de manera que 5 x 10 6 neutrófilos se transfieren por ratón. Para los estudios de neutrófilos repoblación competitivos, mezcle los neutrófilos de tipo salvaje y el gen deficiente en una proporción de 1:1 y se inyecta un total de 5 x 10 6 neutrófilos por ratón como arriba. </li></ol> NOTA: Por lo menos hasta 10 x 10 6 neutrófilos pueden adoptiva transferidos por ratón sin toxicidad evidente inmediato a los animales. <ol start="2"><li> En diferentes momentos después de la transferencia adoptiva (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4 horas después de la transferencia), la eutanasia a los ratones y la sangre de la cosecha, y / o la médula ósea y / o de otro órgano diana (s) de interés. </li><li> Preparar sisuspensiones de células NGLE de estos tejidos para el análisis cuantitativo y cualitativo de los neutrófilos transferidas adoptivamente etiquetados utilizando protocolos publicados 6,15. </li><li> Tras la tinción vivo / muerto viabilidad y bloqueo Fc, marcar células con CD45 (clon 30-F11), Ly6G (clon 1A8) y CD11b (clon M1/70) y la puerta en vivo + CD45 + CD11b + Ly6G neutrófilos. Los neutrófilos en esta puerta incluyen neutrófilos nativas del ratón receptor, así como los neutrófilos marcados adoptivamente transferidas, que son FITC + (si etiquetado con CellTracker verde) o PE + (si etiquetado con la célula Rastreador de naranja). </li></ol> NOTA: Los neutrófilos pueden ser rastreados en la sangre, la médula ósea y el riñón de los ratones infectados con Candida durante al menos 4 horas después de la transferencia. NOTA: La fijación con 2% de paraformaldehído en PBS no afecta adversamente a la intensidad de fluorescencia media de los neutrófilos marcados con Gr. CellTrackereen o CellTracker naranja durante al menos 48 horas.

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Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

En este documento se presenta un protocolo fiable, sencillo, rápido y económico para el aislamiento de un gran número de neutrófilos desde la médula ósea de ratones con alta pureza y la viabilidad utilizando un enfoque de centrifugación en gradiente de densidad. Cuando este protocolo se lleva a cabo correctamente, ~ 6-12 × 10 6 neutrófilos pueden ser recuperados de un ratón no infectado y un máximo de ~ 30-40 × 10 6 neutrófilos pueden aislarse a partir de un ratón después de la infección 6.</s...

Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes en los seres humanos. Ellos son el principal componente celular del sistema inmune innato y actúan como una primera línea de defensa contra los microorganismos invasores. Los pacientes con neutropenia adquirida y las inmunodeficiencias primarias que afectan el número de neutrófilos y / o la función de desarrollar infecciones bacterianas y fúngicas invasoras que amenazan la vida, destacando la importancia de estas células en la defensa de acogida 1. El reconocimiento inmune de patógenos invasores en el sitio de la infección por sus receptores de reconocimiento de patrones resultados análogos en la inducción de una respuesta inmune innata orquestada, lo que conduce a la secreción de factores quimiotácticos que generan un gradiente quimiotáctico capaz de reclutar neutrófilos de la circulación sanguínea en el tejido inflamado 2 . Después de neutrófilos entran en el sitio de la infección, que se activan, lo que conduce a la producción de citoquinas y quimioquinas, la absorción de patógeno, y matar a través de mí oxidativo y no oxidativocanismos 3. Además de su papel bien conocido en la inmunidad innata, los neutrófilos también se ha demostrado recientemente para desempeñar papeles importantes como iniciadores de la respuesta inmune adaptativa eficaces 4. Por otro lado, además de sus funciones de protección en la inmunidad, los neutrófilos también pueden mediar la lesión tisular e inmunopatología debido a la acumulación excesiva y / o la activación a sitios de inflamación, como se muestra en una variedad de enfermedades infecciosas y autoinmunes 5-7. A pesar del papel indispensable de los neutrófilos en el montaje de la respuesta inmune innata eficaces y sus funciones efectoras pleiotrópicos en varias enfermedades infecciosas y afecciones inflamatorias, dificultades técnicas con el manejo de estas células y la falta de protocolos experimentales fiables ha dificultado la investigación con los neutrófilos en las últimas décadas. Por lo tanto, el uso de ensayos reproducibles para el aislamiento de los neutrófilos debería facilitar aún más la investigación sobre los neutrófilos mediada por inmunofunciones de lógica ex vivo e in vivo. Hasta la fecha, varios métodos han sido descritos para el aislamiento de neutrófilos, tales como centrifugación en gradiente de densidad de la sangre humana y la sangre o la médula ósea del ratón 8,9, enriquecimiento inmunomagnética positivo o negativo de los neutrófilos de la sangre o la médula ósea del ratón 10,11, y la cosecha de los neutrófilos de la cavidad peritoneal de los ratones después de la inyección intraperitoneal de tioglicolato o otros agentes inflamatorios 12. Aunque los neutrófilos pueden ser fácilmente aislados en grandes cantidades a partir de sangre humana, este método es subóptima en ratones debido al volumen limitado de sangre de ratón que se opone a aislamiento de neutrófilos suficientes para estudios funcionales o experimentos de transferencia adoptiva 13. Además, aunque el rendimiento de tioglicolato-suscitó las células de la cavidad peritoneal es mayor en comparación con la de la sangre del ratón, la pureza de los neutrófilos en el lavado peritoneal inflamatoria varía entre60-90%, y los neutrófilos aislados exhiben un fenotipo activado. Por lo tanto, las células recogidas usando este método sólo se puede utilizar para llevar a cabo estudios funcionales de activado, pero no de los neutrófilos no estimulados, como la cavidad peritoneal del ratón tiene pocos neutrófilos en el estado estacionario 12. En su lugar, la médula ósea es un depósito conveniente para la recolección de un gran número de neutrófilos no estimulados o activados ya sea 11,14, que luego se pueden utilizar para los estudios funcionales aguas abajo tales como la fagocitosis, la desgranulación y la matanza, o para la transferencia adoptiva en ratones receptores. Aquí se describe un protocolo simple y rápido (~ 2 h), que proporciona un alto rendimiento (~ 6-12 × 10 6 neutrófilos / ratón no infectado, o hasta 30-40 × 10 6 neutrófilos / ratón infectado) puro de (80 -95%) los neutrófilos con&gt; 95% de viabilidad de la médula ósea. Este método utiliza Histopaque disponibles comercialmente, que son la densidad de separación celular gradientemedios de racionamiento que consisten de Ficoll y diatrizoato de sodio, para separar los neutrófilos desde la médula ósea de los ratones. Este método produce un número significativamente mayor de neutrófilos por ratón en comparación con la sangre o la cavidad peritoneal, que puede ser utilizado para recoger los neutrófilos de ratones, tanto en estado estacionario o después de la infección, y es más fácil a la capa en comparación con el método de centrifugación en gradiente de densidad discontinuo que utiliza gradientes de Percoll que consisten de 55% / 65% / 75% de Percoll en PBS 9. Además, el tiempo y los recursos necesarios para recoger los neutrófilos puras se redujo significativamente en comparación con el uso de aislamiento de neutrófilos activados por fluorescencia de clasificación de células. También, ya que este método no implica una etapa de enriquecimiento inmunomagnética, es más rentable, y que evita la exposición de las células a la columna magnética y anticuerpos, disminuyendo así la probabilidad de activación de neutrófilos. Además de realizar estudios funcionales de neutroph aisladoILS ex vivo y la transferencia adoptiva de células en ratones receptores, este protocolo también describe un método para el etiquetado de los neutrófilos aislados utilizando diferentes colorantes CellTracker. Etiquetado diferencial de los neutrófilos de ratones de diferentes orígenes genéticos se puede adaptar en los estudios de repoblación competitivos para el seguimiento de los neutrófilos transferidos en los tejidos de los ratones receptores usando citometría de flujo, que puede proporcionar una visión mecanicista sobre el papel directo de los genes específicos en el tráfico de neutrófilos de la sangre en órganos diana inflamadas 6.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><reactivos fuertes></fuerte></td></tr><tr><td>RPMI 1640 1X con L-glutamina y 25 mM HEPES</td><td>Cellgro</td><td>10-041-CV</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (inactivado por calor)</td><td>GemCell</td><td>100500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina (10.000 unidades de penicilina / 10.000 mg/ml de estreptococo)</td><td>GIBCO</td><td>15140</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Calidad Biológica Inc</td><td>351-027-101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio al 0,2% y al 1,6%</td><td>JT Baker</td><td>3624</td><td>Las soluciones de cloruro de sodio preparadas con agua destilada y estéril filtradas</td></tr><tr><td>Histopaque estéril 1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td>Histopaque 1077 deben llevarse a 18-26 &deg; C antes de usar</td></tr><tr><td>Histopaque filtrado estéril 1119</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>Histopaque 1119 debe llevarse a 18-26 &deg; C antes de usar</td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin calcio y magnesio</td><td>Cellgro</td><td>210-40-CV</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Alcohol etílico (200 grados)</td><td>The Warner Graham Company</td><td>64-17-5</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CellTracker Green (CMFDA, diacetato de 5-clorometilfluoresceína)</td><td>Invitrogen</td><td>C-7025</td><td>Prepare soluciones madre de 10 mM en DMSO, alícuota y almacene a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>CellTracker Orange (CMTMR, 5-(y 6)-4-Clorometil Benzoyl Amino Tetrametilrodamina)</td><td>Invitrogen</td><td>C-2927</td><td>Prepare soluciones madre de 10 mM en DMSO, alícuota y almacene a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD45 (Clon 30-F11)</td><td>eBioscience</td><td>170451-82</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-ratón Ly6G (Clon 1A8)</td><td>BD Pharmingen</td><td>551461</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-ratón Ly6G (Clon 1A8)</td><td>BD Pharmingen</td><td>560599</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD11b (Clon M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>47-0112-82</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD16/CD32 (Ratón BD Fc Block)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553141</td><td>Uso con dilución 1:100</td></tr><tr><td>VIVO/MUERTO Kit de tinción de células muertas azules fijables</td><td>Sondas moleculares</td><td>L-23105</td><td>Uso con dilución 1:1000</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>67-68-5</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Solución de paraformaldehído, 4% en PBS</td><td>USB Corporation</td><td>19943</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><fuerte>Tabla 1. Reactivos para el aislamiento, marcaje y seguimiento de neutrófilos transferidos adoptivamente.</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Materials</td></tr><tr><td>C57BL/6 ratones</td><td>Taconic</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 ml</td><td>Corning</td><td>430053</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipetas serológicas de 25 ml</td><td>Celltreat</td><td>229225B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipetas serológicas de 10 ml</td><td>Celltreat</td><td>229210B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipetas serológicas de 5 ml</td><td>Celltreat</td><td>229205B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur (3 ml)</td><td>BD Falcon</td><td>357575</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Jeringas de 12 ml</td><td>Kendall monoject</td><td>512878</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>25 g x 5/8 pulg. Agujas (agujas de deslizamiento de precisión)</td><td>BD</td><td>305122</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtros de celdas de 100 mm</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Placas de Petri bactericidas</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Combitips Plus Biopur</td><td>Eppendorf</td><td>2249608-5</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Instrumentos de disección de ratones (tijeras, fórceps, bisturí)</td><td>Instrumentos de investigación biomédica</td><td>10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000</td><td>Instrumentos esterilizados antes de su uso</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Tissue culture hood</td><td>The Baker Company</td><td>SG403</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>75004521</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>37 y s&deg; C baño de agua agitable</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>3166721</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><fuerte>Tabla 2. Lista de Materiales y Equipos utilizados en este protocolo.</td></tr></tbody></table>

aislamiento, purificación y etiquetado de neutrófilos de médula ósea de ratón de estudios funcionales y experimentos de transferencia adoptivos

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Los neutrófilos son las células efectoras críticas del sistema inmune innato. Ellos son reclutados rápidamente en sitios de inflamación aguda y ejercen efectos protectores o patógenos dependiendo del medio inflamatorio. No obstante, a pesar de la función indispensable de los neutrófilos en la inmunidad, la comprensión detallada de los factores moleculares que median efectos efectoras y inmunopatogénico neutrófilos &#39;en diferentes enfermedades infecciosas y condiciones inflamatorias que aún falta, en parte debido a su corta vida media, las dificultades con la manipulación de estos las células y la falta de protocolos experimentales fiables para la obtención de un número suficiente de neutrófilos para los estudios funcionales aguas abajo y los experimentos de transferencia adoptiva. Por lo tanto, los métodos simples, rápidos, económicos y fiables son muy deseables para la recolección de un número suficiente de los neutrófilos de ratón para evaluar funciones como la fagocitosis, la matanza, la producción de citoquinas, degranulación y la trata. Para ese fin,se presenta un protocolo basado en centrifugación de gradiente de densidad reproducible, que se puede adaptar en cualquier laboratorio para aislar un gran número de neutrófilos desde la médula ósea de ratones con alta pureza y viabilidad. Por otra parte, se presenta un protocolo simple que utiliza colorantes CellTracker para etiquetar los neutrófilos aislados, que pueden entonces ser transferidos de manera adoptiva en ratones receptores y rastreados en varios tejidos durante al menos 4 horas después de la transferencia usando citometría de flujo. El uso de este enfoque, el etiquetado diferencial de los neutrófilos de ratones de tipo salvaje y deficiente en el gen con diferentes colorantes CellTracker se puede emplear con éxito para llevar a cabo estudios de repoblación competitivos para evaluar el papel directo de los genes específicos en el tráfico de los neutrófilos de la sangre a los tejidos diana in vivo .

Este protocolo se ha optimizado para la cosecha de células de médula ósea de los ratones y la posterior separación de los neutrófilos de estas células por centrifugación en gradiente de densidad utilizando Histopaque medios de separación de células disponibles comercialmente. Los neutrófilos aislados utilizando este método se puede utilizar para una variedad de estudios de aguas abajo funcional ex vivo y para los experimentos de transferencia adoptiva en ratones receptores. El rendi...

Se describe un protocolo para el aislamiento y purificación de los neutrófilos de médula ósea de ratón por centrifugación en gradiente de densidad y para el etiquetado de neutrófilos usando colorantes CellTracker. Esto representa un método sencillo, rápido, reproducible y económico para la obtención de un gran número de neutrófilos para los estudios funcionales aguas abajo o experimentos de transferencia adoptivos y seguimiento.

Aislamiento, Purificación y Etiquetado de neutrófilos de médula ósea de ratón de Estudios funcionales y experimentos de transferencia adoptivos

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar y marcar neutrófilos a partir de médula ósea de ratón para estudios funcionales posteriores y experimentos de transferencia adoptiva. Esto se logra primero recolectando las células de la médula ósea de fémures y tibias de roedores. En el segundo paso, los glóbulos rojos se lisan osmóticamente suspendiéndolos sucesivamente en soluciones de cloruro de sodio al 0,2 % y al 1,6 %, respectivamente.A continuación, los neutrófilos se aíslan mediante centrifugación en gradiente de densidad. En el paso final, los neutrófilos se marcan con colorantes trazadores de células. En última instancia, la citometría de flujo puede utilizarse para determinar el número de neutrófilos transferidos adoptivamente que se reclutan en diversos tejidos de ratón.La principal ventaja de aislar neutrófilos de ratón a partir de la médula ósea frente a la sangre o el peritoneo es que se puede obtener un gran número de células suficiente para estudios funcionales posteriores y experimentos de transferencia adoptiva, tanto durante el estado estable como tras una infección. La ventaja de utilizar una técnica de centrifugación en gradiente para aislar neutrófilos de ratón frente a la selección inmunomagnética o la clasificación de células activadas por fluorescencia es que es rápida, económica y evita la marcación de los neutrófilos con anticuerpos, lo cual podría inducir su activación. La demostración del procedimiento estará a cargo de Muca Swami Us, un técnico de mi laboratorio, tras rociar a un ratón sacrificado con etanol al 70 %.Realice una incisión en la región abdominal media de la piel del animal y luego retire el tejido cutáneo de la parte distal del animal, incluyendo las extremidades inferiores. A continuación, use tijeras para cortar los músculos de las extremidades traseras del animal y luego desloque cuidadosamente el hueso acetabular de la articulación de la cadera, evitando romper la cabeza del fémur. Luego, use las tijeras como un bisturí para eliminar el músculo restante del fémur y la tibia.Separar los huesos de la pata en la articulación de la rodilla, teniendo cuidado de no romper los extremos óseos, y luego colocar los huesos en una placa de Petri que contenga RPMI 1 6 4 oh frío con hielo. Suplementar con FBS y antibióticos. Transferir la placa a una cabina de cultivo celular y luego esterilizar el exterior de cada hueso con etanol al 70 % en una placa de Petri nueva.Después de aproximadamente 10 a 15 segundos, enjuague el etanol de la superficie de cada hueso con tres lavados sucesivos en PBS estéril frío con hielo. Luego, corte y coloque la epífisis de cada hueso en una nueva placa de Petri estéril. A continuación, coloque una aguja de calibre 25 en una jeringa de 12 cc llena con 10 mililitros de RPMI.Suplemente con FBS y EDTA. Luego, lave las células de la médula ósea desde ambos extremos del eje de cada par de fémur-tibia hacia un tubo cónico de 50 mililitros con tapón roscado Falcon, tamizado con un filtro de 100 micrómetros para eliminar todas las células. Raspe las superficies internas de los huesos con la punta de la aguja.Cuando los huesos aparezcan decolorados, las células habrán sido eliminadas suficientemente. Ahora use un escalpelo para cortar las epífisis óseas en pequeños fragmentos Q de 0,5 a un milímetro, y luego use el extremo posterior de una punta de pipeta de 2,5 mililitros einor comb tip plus BioPure para triturarlos a través del filtro de 100 micrómetros. Después de centrifugar las células recolectadas durante siete minutos a 427 ×g y 4 grados Celsius, lise las células rojas de la sangre en 20 mililitros de cloruro de sodio al 0,2 % durante aproximadamente 20 segundos.Luego detenga la lisis con 20 mililitros de cloruro de sodio al 1,6 %, centrifugue las células y resuspenda el botón en RPMI 1640 suplementado con FBS y EDTA. Cuente las células y, tras centrifugarlas nuevamente, resuspenda el botón lavado en no más de 100 × 10⁶ células por un mililitro de PBS estéril frío. Ahora distribuya tres mililitros de histopaque 1119 opaco a 18-26 °C en un tubo cónico de 15 mililitros, y luego superponga lentamente tres mililitros de histopaque 1119 opaco a 18-26 °C.Su his opaco 1 0 7 7. Evite mezclar las dos densidades inmediatamente después de preparar el his opaco; coloque cuidadosamente por encima la suspensión de células de médula ósea sobre el his opaco 1 0 7 7 y centrifugue el gradiente de densidad durante 30 minutos a 834 ×g y 25 °C sin freno, y luego recoja los neutrófilos en la interfase entre las capas de his opaco 1 1 1 9 y 1 0 7 7. Después de lavar los neutrófilos recolectados dos veces en RPMI 1 6 4 0 FBS y antibióticos, re suspenda las células a una concentración de cinco veces 10⁶ células por mililitro en PBS precalentado a 37 °C.Después de contar las células, reserve una pequeña alícuota de cada muestra experimental para determinar la pureza y viabilidad mediante citometría de flujo y luego marque los neutrófilos restantes con un colorante rastreador celular a una concentración final de cinco micromoles durante 10 minutos a 37 grados Celsius en un baño de agua agitado y en la oscuridad. Finalmente, lave las células dos veces con RPMI 1 6 4 0 frío suplementado con FBS y antibióticos para evitar la contaminación cruzada del colorante antes de mezclar las poblaciones de neutrófilos marcados diferencialmente para estudios posteriores de repoblación competitiva. En este panel, se muestran gráficos representativos de citometría de flujo de neutrófilos aislados del médula ósea mediante separación en gradiente de densidad, obtenidos de un ratón C 57 negro seis no infectado. La selección inicial utilizada para las células de médula ósea recolectadas de la interfase de histopat 1 1 1 9 e histopat 1 0 7 7.Mediante la dispersión directa y lateral, se demuestra que los neutrófilos separados por gradiente de densidad tienen una pureza mayor al 90 % y una viabilidad superior al 95 % durante al menos cuatro horas tras la transferencia adoptiva con marcador celular. Los neutrófilos marcados con DIA pueden rastrearse mediante citometría de flujo en diversos tejidos del ratón. Por ejemplo, en sangre, médula ósea y riñones del ratón receptor infectado con Candida C57BL/6 mostrado en este experimento, al seleccionar las células viables CD45 LY6G CD11b, estos neutrófilos representativos transferidos adoptivamente y marcados con CMTMR pueden diferenciarse de los neutrófilos nativos del ratón receptor, negativos para CMTMR y PE, por su expresión de PE.Una vez dominado, el aislamiento y etiquetado de los neutrófilos de la médula ósea de ratón puede completarse en tres horas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Trasplante de médula ósea proporciona una manera de cambiar el genotipo de las células de médula ósea derivadas. Si el gen de interés se expresa tanto en las células derivadas de la médula ósea y no células de médula ósea derivadas, transplante de médula ósea puede cambiar las células de médula ósea derivadas de un genotipo diferente sin cambiar la no de la médula ósea derivada genotipo celular.

Diferenciar los roles funcionales de la expresión génica de las células inmunes y no inmunes en la colitis de ratón por Trasplante de Médula Ósea

Aquí presentamos un protocolo que genera grandes cantidades de monocitos murinos a partir de médula ósea heterogénea para aplicaciones traslacionales. En comparación con otros, este nuevo método ayuda a reducir el número de animales sacrificados y reduce los costos al evitar métodos costosos como la separación de células magnéticas (MACS) de alto gradiente.

Aislamiento y la inyección intravenosa de murino médula ósea derivados monocitos

Este manuscrito proporciona un procedimiento técnico que puede ser utilizado para caracterizar los cultivos de células C1498 in vitro y la leucemia aguda inducida en ratones después de su inyección. Los análisis fenotípicos y funcionales se realizan mediante citometría de flujo, microscopía de inmunofluorescencia, y la tinción citoquímica de May-Grünwald Giemsa.

Un protocolo detallado para la caracterización de la línea celular murina C1498 y su modelo asociado de leucemia de ratón

Aquí se describen nuevos protocolos para aislar y caracterizar micropartículas derivadas de humano y ratón neutrófilos. Estos protocolos utilizan técnicas immunoblotting para analizar contenido de micropartículas, ultracentrifugación y citometría de flujo, y pueden ser utilizados para estudiar el papel de micropartículas derivadas de diversos tipos celulares en función de las células.

Aislamiento y caracterización de micropartículas de neutrófilos derivado de estudios funcionales

Demostramos cómo identificar y aislar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de médula murine usando una combinación de magnético y fluorescencia clasificación (MACS y FACS). Este protocolo puede ser utilizado para RNA/proteína análisis, experimentos de transferencia adoptiva en vivo y en vitro ensayos de cultura (culturas de la pastilla o líquido).

Identificación y aislamiento de Oligopotent y linaje comprometido progenitores mieloides de la médula ósea de ratón

Aquí, presentamos un protocolo para la determinación de en vivo de la activación de las células (células T) CD4 T ingenua, proliferación y diferenciación de Th1 inducida por el GM-CSF de la médula (BM)-derivado de las células dendríticas (DCs). Además, este protocolo describe aislamiento del BM y del T-cell, la generación de C.C. y transferencia adoptiva de DC y del T-cell.

Un modelo de ratón In Vivo a medida ingenuo CD4 células T activación, proliferación y diferenciación de Th1 inducida por las células dendríticas derivadas de la médula ósea

Este método describe la purificación por citometría de flujo de MEP y MKp de fémures, tibias y huesos pélvicos de ratones.

Aislamiento de progenitores de megacariocitos de ratón

Esta investigación describe dos técnicas para aislar abundantes trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) de la médula ósea de rata. Un método combina un kit comercial de aislamiento de neutrófilos con centrifugación en gradiente de densidad, mientras que el otro emplea solo centrifugación en gradiente de densidad. Ambos enfoques producen TNE funcionales que superan a los de los neutrófilos de sangre periférica.

Enfoque único para aislar neutrófilos de médula ósea de rata con capacidad comparable

Este protocolo describe un método sencillo y no enzimático para aislar células de médula ósea de ratón neonatal de 7-9 días de edad y generar macrófagos diferenciados utilizando un sobrenadante de células L929 como fuente de factor estimulante de colonias de granulocitos (M-CSF). Los macrófagos derivados de la médula ósea se analizaron más a fondo para determinar los antígenos de superficie F4/80, CD206, CD11b y la competencia funcional.

Aislamiento de médula ósea de ratón neonatal y preparación de macrófagos derivados de la médula ósea

Este manuscrito describe un protocolo para la preparación de una biblioteca ATAC-seq de neutrófilos de médula ósea murina, con el objetivo de garantizar una viabilidad óptima de los neutrófilos y una alta calidad de la biblioteca. Ofrece instrucciones paso a paso sobre la preparación de BMC, la clasificación inmunomagnética y la construcción de bibliotecas, lo que sirve como una guía valiosa, especialmente para los recién llegados al estudio de los neutrófilos.

Preparación de neutrófilos derivados de la médula ósea murina

Aprende a aislar y etiquetar neutrófilos de médula ósea de ratón mediante centrifugación en gradiente de densidad y colorantes CellTracker. Este protocolo económico permite estudios funcionales y transferencias adoptivas.

Aislamiento, Purificación y Etiquetado de neutrófilos de médula ósea de ratón de Estudios funcionales y experimentos de transferencia adoptivos (Video) | JoVE Journal

Aislamiento, Purificación y Etiquetado de neutrófilos de médula ósea de ratón de Estudios funcionales y experimentos de transferencia adoptivos

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