Aislamiento, Purificación y Etiquetado de neutrófilos de médula ósea de ratón de Estudios funcionales y experimentos de transferencia adoptivos

El objetivo general de este procedimiento es aislar y marcar neutrófilos a partir de médula ósea de ratón para estudios funcionales posteriores y experimentos de transferencia adoptiva. Esto se logra primero recolectando las células de la médula ósea de fémures y tibias de roedores. En el segundo paso, los glóbulos rojos se lisan osmóticamente suspendiéndolos sucesivamente en soluciones de cloruro de sodio al 0,2 % y al 1,6 %, respectivamente.

A continuación, los neutrófilos se aíslan mediante centrifugación en gradiente de densidad. En el paso final, los neutrófilos se marcan con colorantes trazadores de células. En última instancia, la citometría de flujo puede utilizarse para determinar el número de neutrófilos transferidos adoptivamente que se reclutan en diversos tejidos de ratón.

La principal ventaja de aislar neutrófilos de ratón a partir de la médula ósea frente a la sangre o el peritoneo es que se puede obtener un gran número de células suficiente para estudios funcionales posteriores y experimentos de transferencia adoptiva, tanto durante el estado estable como tras una infección. La ventaja de utilizar una técnica de centrifugación en gradiente para aislar neutrófilos de ratón frente a la selección inmunomagnética o la clasificación de células activadas por fluorescencia es que es rápida, económica y evita la marcación de los neutrófilos con anticuerpos, lo cual podría inducir su activación. La demostración del procedimiento estará a cargo de Muca Swami Us, un técnico de mi laboratorio, tras rociar a un ratón sacrificado con etanol al 70 %.

Realice una incisión en la región abdominal media de la piel del animal y luego retire el tejido cutáneo de la parte distal del animal, incluyendo las extremidades inferiores. A continuación, use tijeras para cortar los músculos de las extremidades traseras del animal y luego desloque cuidadosamente el hueso acetabular de la articulación de la cadera, evitando romper la cabeza del fémur. Luego, use las tijeras como un bisturí para eliminar el músculo restante del fémur y la tibia.

Separar los huesos de la pata en la articulación de la rodilla, teniendo cuidado de no romper los extremos óseos, y luego colocar los huesos en una placa de Petri que contenga RPMI 1 6 4 oh frío con hielo. Suplementar con FBS y antibióticos. Transferir la placa a una cabina de cultivo celular y luego esterilizar el exterior de cada hueso con etanol al 70 % en una placa de Petri nueva.

Después de aproximadamente 10 a 15 segundos, enjuague el etanol de la superficie de cada hueso con tres lavados sucesivos en PBS estéril frío con hielo. Luego, corte y coloque la epífisis de cada hueso en una nueva placa de Petri estéril. A continuación, coloque una aguja de calibre 25 en una jeringa de 12 cc llena con 10 mililitros de RPMI.

Suplemente con FBS y EDTA. Luego, lave las células de la médula ósea desde ambos extremos del eje de cada par de fémur-tibia hacia un tubo cónico de 50 mililitros con tapón roscado Falcon, tamizado con un filtro de 100 micrómetros para eliminar todas las células. Raspe las superficies internas de los huesos con la punta de la aguja.

Cuando los huesos aparezcan decolorados, las células habrán sido eliminadas suficientemente. Ahora use un escalpelo para cortar las epífisis óseas en pequeños fragmentos Q de 0,5 a un milímetro, y luego use el extremo posterior de una punta de pipeta de 2,5 mililitros einor comb tip plus BioPure para triturarlos a través del filtro de 100 micrómetros. Después de centrifugar las células recolectadas durante siete minutos a 427 ×g y 4 grados Celsius, lise las células rojas de la sangre en 20 mililitros de cloruro de sodio al 0,2 % durante aproximadamente 20 segundos.

Luego detenga la lisis con 20 mililitros de cloruro de sodio al 1,6 %, centrifugue las células y resuspenda el botón en RPMI 1640 suplementado con FBS y EDTA. Cuente las células y, tras centrifugarlas nuevamente, resuspenda el botón lavado en no más de 100 × 10⁶ células por un mililitro de PBS estéril frío. Ahora distribuya tres mililitros de histopaque 1119 opaco a 18-26 °C en un tubo cónico de 15 mililitros, y luego superponga lentamente tres mililitros de histopaque 1119 opaco a 18-26 °C.

Su his opaco 1 0 7 7. Evite mezclar las dos densidades inmediatamente después de preparar el his opaco; coloque cuidadosamente por encima la suspensión de células de médula ósea sobre el his opaco 1 0 7 7 y centrifugue el gradiente de densidad durante 30 minutos a 834 ×g y 25 °C sin freno, y luego recoja los neutrófilos en la interfase entre las capas de his opaco 1 1 1 9 y 1 0 7 7. Después de lavar los neutrófilos recolectados dos veces en RPMI 1 6 4 0 FBS y antibióticos, re suspenda las células a una concentración de cinco veces 10⁶ células por mililitro en PBS precalentado a 37 °C.

Después de contar las células, reserve una pequeña alícuota de cada muestra experimental para determinar la pureza y viabilidad mediante citometría de flujo y luego marque los neutrófilos restantes con un colorante rastreador celular a una concentración final de cinco micromoles durante 10 minutos a 37 grados Celsius en un baño de agua agitado y en la oscuridad. Finalmente, lave las células dos veces con RPMI 1 6 4 0 frío suplementado con FBS y antibióticos para evitar la contaminación cruzada del colorante antes de mezclar las poblaciones de neutrófilos marcados diferencialmente para estudios posteriores de repoblación competitiva. En este panel, se muestran gráficos representativos de citometría de flujo de neutrófilos aislados del médula ósea mediante separación en gradiente de densidad, obtenidos de un ratón C 57 negro seis no infectado. La selección inicial utilizada para las células de médula ósea recolectadas de la interfase de histopat 1 1 1 9 e histopat 1 0 7 7.

Mediante la dispersión directa y lateral, se demuestra que los neutrófilos separados por gradiente de densidad tienen una pureza mayor al 90 % y una viabilidad superior al 95 % durante al menos cuatro horas tras la transferencia adoptiva con marcador celular. Los neutrófilos marcados con DIA pueden rastrearse mediante citometría de flujo en diversos tejidos del ratón. Por ejemplo, en sangre, médula ósea y riñones del ratón receptor infectado con Candida C57BL/6 mostrado en este experimento, al seleccionar las células viables CD45 LY6G CD11b, estos neutrófilos representativos transferidos adoptivamente y marcados con CMTMR pueden diferenciarse de los neutrófilos nativos del ratón receptor, negativos para CMTMR y PE, por su expresión de PE.

Una vez dominado, el aislamiento y etiquetado de los neutrófilos de la médula ósea de ratón puede completarse en tres horas.