Name: Codificados genéticamente-sondas moleculares para Estudiar G receptores acoplados a proteínas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-13T16:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 16 s
Description: Aprende a incorporar sondas moleculares codificadas genéticamente en receptores acoplados a proteínas G mediante la aminoácido no natural p-azido-L-fenilalanina. Este método permite estudios estructurales con fotoenlace y marcaje bioortogonal específico.

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Damos las gracias al generoso apoyo de varias fundaciones y donantes filantrópicos (ver SakmarLab.org).

1. Sitio específico de incorporación genética de Unnatural Aminoácidos en GPCRs <ol><li> Mantener las células HEK293T en medio DMEM (4,5 g / l de glucosa, glutamina 2 mM) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5%. </li><li> Transfectar las células cultivadas a 60-80% de confluencia en una placa de 10 cm usando reactivo Lipofectamine Plus. <ol><li> Para 750 l de DMEM, añadir 10 l de reactivo Plus, 3,5 g de ADNc de GPCR (pMT4. Rho o pcDNA 3.1. CCR5) que contiene el codón de parada ámbar en una posición deseada, 3,5 g de ADNc supresor de ARNt (pSVB.Yam) y 0,35 g de ADNc sintetasa mutante-amino acil ARNt para p-azido-L-fenilalanina (pcDNA.RS). Incubar a temperatura ambiente durante 15 min. También realizar una transfección similar utilizando el ADNc de GPCR en peso (que no contiene un codón de parada ámbar) para servir como un control. Añadir esta mezcla a 750 l de DMEM con 17 l Lipofectamine. Después de equilibrar 15 min a temperatura ambiente, llevar elvolumen total de 4 ml. </li><li> Aspirar los medios sobre 10 cm de placa, se aplican mezcla de transfección a las células, y volver a 37 ° C en el 5% atmósfera de CO 2. Después de 4-6 horas, complementar las células con 4 ml de DMEM que contiene 20% de SFB y 1 mM AZF. </li></ol></li><li> Al día siguiente, vuelva a colocar el medio de cultivo por DMEM que contiene 10% de SFB y 0,5 mM AZF. </li><li> Células de cosecha 48 horas después de la transfección, para analizar la expresión o proceder a procedimientos fotorreticulación o de etiquetado descritos en las siguientes secciones. <ol><li> Confirmar la expresión de la mutante ámbar de GPCR en presencia de la SAU en el medio de crecimiento. Hacemos esto mediante la detección de inmunotransferencia Western. Lyse el sedimento celular en 1% (w / v) de dodecil-β-D-maltósido (DDM) en 20 mM de Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 100 mM durante 1 hora a 4 ° C. Centrifugar el lisado a 16.000 xg y resolver el sobrenadante en condiciones reductoras por SDS-PAGE. Transferencia a una membrana de PVDF y llevar a cabo el análisis de inmunoblot para detectar la expresión del receptor de longitud completa utilizando the 1D4 mAb (Nacional de Cultivo Celular Center), que reconoce un epítopo de ingeniería en el extremo C-terminal del receptor. 31 </li></ol></li></ol> 2. Asignación de un sitio de unión al ligando Usando Targeted fotorreticulación <ol><li> 48 horas después de la transfección, los medios de comunicación el aspirado de células y reemplazar con 4 ml 1x Tampón fosfato salino (PBS). Volver a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Resuspender las células con PBS 1x y transferir a un tubo Falcon. Centrifugar a 1500 rpm durante 2 min para sedimentar las células y aspirar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento de células en solución salina tamponada de Hank 1x que contenía HEPES, pH 7,5, 0,2% de BSA y el ligando tritiado a concentraciones saturantes de unión para la longitud requerida de tiempo y temperatura para asegurar la formación del complejo receptor-ligando 20. </li><li> Transferir la suspensión celular a una placa de 24 pocillos o de 96 pocillos para la fotoactivación del AZF a 365 nm (por ejemplo, usar una lámpara UV-A) durante 15 min a 4 ° C. Mantenienn de la placa en hielo para evitar el calentamiento de la muestra y la lisis celular. </li><li> Transfiera las células a un tubo Eppendorf, centrifugar para sedimentar las células, separar el sobrenadante y proceder a su análisis. Los gránulos se pueden almacenar a -20 ° C para su uso futuro. </li><li> Resuspender los sedimentos celulares en tampón de lisis que contiene 1% (w / v) de DDM, mM de Tris-HCl 20, pH 7,5 y los inhibidores de la proteasa. Después de la incubación de 1 hora a 4 ° C, centrifugar el lisado de células durante 10 min a 16.000 xg, y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. </li><li> Añadir resina 2B mAb 1D4-Sepharose al sobrenadante y se incuba durante la noche a 4 ° C a immunopurify el GPCR usando el C-terminal 1D4 mAb epítopo de ingeniería. Al día siguiente, lavar las perlas varias veces con tampón de lisis. Muestras se eluye con 1% SDS a 37 º C durante 1 hora con agitación. </li><li> Transferir una porción del eluyente a un vial que contiene 15 ml de fluido de centelleo y contar en un contador beta de centelleo para cuantificar la cantidad de unión específica del ligando tritiado a thcorreo del receptor. </li><li> Resolver el restante 1D4 mAb eluyente purificado por electroforesis en gel estándar. Nosotros usamos un gel SDS-PAGE al 4-12% y luego la transferencia semiseco a una membrana de PVDF para inmunotransferencia. También se incluyen un carril con la escala estándar de proteínas para guiar aproximación visual de peso molecular. <ol><li> Bloquear la membrana de PVDF con leche 5% en tampón TBS que contiene 0,05% de Tween-20. Sonda de la membrana para confirmar la expresión del receptor de longitud completa con mAb 1D4 seguido por el anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con HRP. </li><li> Tratar con un aumento de quimioluminiscencia reactivo (ECL) y exponer la membrana a autorradiografía película para visualizar las bandas. </li></ol></li><li> Cortar la membrana con una hoja de afeitar para separar cada carril muestra, seguido por el corte en marcadores específicos de peso molecular. Transferir los segmentos de membrana a viales que contenían fluido de centelleo. Cuantificar la cantidad de tritio en cada segmento de la membrana mediante el recuento en un contador de centelleo beta. </li><li> Identificar lo positivophotocrosslink con la detección de tritio en la masa molecular aparente igual a la suma de la del GPCR y el ligando. </li></ol> 3. Targeted Epitope Etiquetado y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas Superficie Celular (ELISA) <ol><li> 24 horas después de la transfección, lavar las células con 1 ml de PBS 1X y trypsinize con 1 ml de tripsina al 0,25% durante 3 min. Complementar con 9 ml de DMEM que contiene 10% de SFB y 0,5 mM AZF. Resuspender las células y contar la densidad celular. Utilizamos un hemocitómetro estándar. </li><li> Pre-tratamiento de una placa de 96 pocillos de alto vinculante, de fondo claro con 100 ml de 0,01 mg / ml de poli-D-lisina por pocillo. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente, se lava varias veces con 1x PBS y secar al aire. </li><li> Placa de 200 l de las células transfectadas a una densidad de 6 x 4 al 08 10 x 10 4 células / pocillo a la placa de 96 pocillos y se vuelven a 37 ° C en 5% de CO 2 atmósfera. </li><li> Al día siguiente preparar células para el etiquetado. Lave suavemente tres veces con 100 l / pocillo de PBS 1x to eliminar cualquier que contiene medio de crecimiento del AZF. Asegúrese de células permanecen adheridas, por ejemplo, mediante el uso de PBS que contenía Ca 2 + y Mg 2 +. </li><li> Preparar 50-200 M reactivo marcador FLAG-triarilfosfina en 1x HBSS / PBS a partir de una acción mantenida a 5-20 mM en PBS. Aplicar 60 ml a cada pocillo (por triplicado para cada mutante ámbar) y volver a 37 ° C durante 30 min a 4 h. Mantener un conjunto de pozos sin tratamiento en la etiqueta 1x HBSS / PBS. También incluya un control de GPCR en peso para comparar con variantes AZF-GPCR. </li><li> Lavar las células 3 veces con 100 l / pocillo de tampón de bloqueo, BB (1x PBS, 0,5% de BSA), para eliminar por completo la etiqueta sin reaccionar. </li><li> Aplicar 100 l / pocillo de 4% de paraformaldehído (preparado a partir de una población 16% en 1x PBS) a las células. Incubar durante 20 min a temperatura ambiente. Lavar tres veces con BB. </li><li> Realizar el protocolo de ELISA de la superficie celular estándar para detectar receptor marcado y la expresión del receptor. Incubar con el anticuerpo primario durante 1,5 h en hielo seguido de una secundariatibody incubación a temperatura ambiente durante 1 h. <ol><li> Añadir 100 l de anticuerpo anti-FLAG M2 (por ejemplo, 1:2.000 dilución de anticuerpo realizados en BB) para detectar el epítopo Flag péptido del reactivo etiquetado con FLAG triarilfosfina. También sondear los pocillos tratados que no tiene etiqueta como un control negativo. Añadir anti-CCR5 2D7 (usamos una dilución 1:500) de anticuerpos a un conjunto separado de pozos para determinar en peso o azf-GPCR expresión en la superficie celular. </li><li> Lavar las células tres veces con BB, y se incuba con 100 l de anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con HRP (1:2000 dilución). </li><li> Lave cuidadosamente las células cinco veces con BB. Añadir 50 l de tampón de detección: Amplex Red, 20 mM de H 2 O 2, 1x PBS (1:10:90 relación) e incubar 15 min a temperatura ambiente. Recopilar datos espectrales en un lector de placas de pocillos múltiples fluorescencia a λ ex = 530 y λ em = 590. </li></ol></li></ol> 4. Bioorthogonal Marcaje fluorescente de un GPCR <ol><li> Lyse10 7 células cosechadas expresan en peso o azf-rodopsina variantes en 1 ml de tampón de solubilización que contiene 1% (w / v) de DM, HEPES 50 mM o Tris-HCl, pH 6,8, NaCl 100 mM, CaCl2 1 mM e inhibidores de proteasa para 1 horas a 4 ° C. Centrifugar el lisado de células a 15.000 xg durante 10 min y recoger la fracción sobrenadante. </li><li> Añadir 100 l de resina Sepharose 2B 1D4-mAb para capturar el receptor usando el C-terminal epítopo 1D4 de ingeniería. Incubar durante 12 horas a 4 ° C. La resina se lava tres veces con 0,1% (w / v) de DDM en 0,1 M de tampón de fosfato de sodio, pH 7,3. </li><li> Añadir 0,1 mM de fluoresceína-fosfina en un volumen total de 0,3 a 0,5 ml para etiquetar receptor inmovilizado en la matriz de inmunoafinidad (1D4-mAb Sepharose 2B). Incubar durante 12 horas a temperatura ambiente. Centrifugar y eliminar el sobrenadante. La resina se lava para quitar la etiqueta que no ha reaccionado. </li><li> Eluir el receptor marcado con tampón de elución que contiene 100 ml de 0,1% (w / v) de DDM y 0,33 mg / ml de nonapéptido (C9 péptido contra el epítopo 1D4)en tampón de fosfato 2 mM, pH 6,0 mediante incubación en hielo durante 1 h. </li><li> Resolver muestras marcadas por SDS-PAGE en condiciones reductoras. Lavar geles brevemente en PBS y luego visualizar etiquetado de azf-GPCR por fluorescencia en gel. Por ejemplo, utilizar un escáner de fluorescencia confocal con un láser de longitud de onda de 488 nm para detectar el receptor modificado con fluoresceína. </li></ol>

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</ol>

Los autores tienen nada que revelar.

Se describe aquí una metodología sólida para la incorporación específica de sitio de una sonda reactiva, AZF, en GPCRs y demostrar tres aplicaciones útiles de esta herramienta para el estudio de la estructura y dinámica de los GPCRs. Nuestro método para sitios específicos incorporar UAAs elude un problema fundamental con una estrategia alternativa basada en el etiquetado químicamente 32, 33 o adjuntar photocrosslinkers 34 a un solo mutante cisteína accesible. Aunque, las químicas que se dirigen a g...

Receptores acoplados a proteínas G (GPCRs heptahelical) comprenden una superfamilia de proteínas de la membrana altamente dinámicos que median señales extracelulares importantes y diversos. En el paradigma clásico, la activación del receptor se acopla con los cambios conformacionales inducidos por ligando. 1, 2 avances recientes en biología estructural de los GPCR han proporcionado información significativa sobre los mecanismos moleculares de la señalización transmembrana. 3-5 Sin embargo, para entender con mayor precisión la química mecanismo funcional y dinámica estructural de señalización de GPCR, se requiere un conjunto de herramientas de enfoques para incorporar sondas moleculares y químicas informativas para interrogar a los complejos de señalización activo. Para este fin, se adaptó un método para introducir específicamente en el sitio no o mínimamente sondas perturbadores en receptores expresados ​​sobre la base de aminoácido no natural (SAU) mutagénesis usando codón ámbar tecnología de supresión previamente por primera vez por Schultz y C. oworkers 6 Hemos optimizado la metodología de mutagénesis SAU para lograr una expresión de alto rendimiento y sistema de mutagénesis para las proteínas tales como los GPCR, que son difíciles de expresar en sistemas más heterólogas distintas de las células de mamíferos. El uso de un supresor ARNt ortogonal diseñado y desarrollado aminoacil-ARNt-sintetasa par de UAA específica, hemos introducido específicamente en el sitio UAAs en GPCRs objetivo expresado. La incorporación con éxito de UAAs, p-acetil-L-fenilalanina (ACF), p-benzoil-L-fenilalanina (BZF), y p-azido-L-fenilalanina (AZF) se ha demostrado en nuestros GPCR modelo - rodopsina humana y receptor de quimiocinas CC, CCR5. 7, 8 En principio, un UAA puede ser codificada genéticamente en cualquier posición dentro de la secuencia de la proteína, y esta propiedad es una herramienta bioquímica invaluable, ya que permite el escaneo de un solo codón de un GPCR diana. Nos centramos aquí específicamente en la versatilidad de la UAA, AZF, que tiene un azi reactivahacer fracción. Además de servir como un (IR) de la sonda única de infrarrojos, 8, 9 azf también puede servir como un agente de reticulación fotoactivable por reacción con aminas primarias vecinas o hidrógenos alifáticos. Además, el grupo azido biológicamente inerte puede participar como un asa química selectiva en las reacciones de etiquetado bioorthogonal. Aquí se presentan ejemplos que ilustran las aplicaciones útiles de la incorporación específica de sitio de AZF en GPCRs, como fotorreticulación dirigida a atrapar a un complejo receptor-ligando, y la modificación de los GPCRs de etiquetado epítopo bioorthogonal y estrategias de marcaje fluorescente. Reactivos fotoactivables se han utilizado para estudiar los sistemas biológicos desde la década de 1960. 10 En este período, se ha informado de una gran cantidad de experimentos de reticulación de receptor-ligando para estudiar complejos de GPCR, la mayoría de las cuales implicó el uso de ligandos de fotoafinidad. 11, 12 Sin embargo, estos las aplicaciones son técnicamente limitados, ya que requiere síntesis de ligandos que portan un grupo de reticulación. 13-15 Además, con el resto reticulante en el ligando, es un reto para identificar la ubicación de la reticulación en el GPCR. La introducción específica de sitio grupos fotorreticulación como UAAs en proteínas utilizando el codón ámbar tecnología de supresión es un avance valioso. 16, 17 Hemos desarrollado una técnica fotorreticulación para identificar la interfaz de unión sobre un receptor que está implicado en la formación de un complejo receptor-ligando en células vivas mediante la introducción de grupos fotolábiles en los GPCR. 18, 19 Aquí se describe el protocolo experimental y método de análisis de datos para la aplicación de esta tecnología fotorreticulación dirigido a identificar el sitio de unión de un ligando de molécula pequeña, maraviroc tritiada, en el CCR5. Este método aprovecha la cuantificación precisa de la manija radiactivo en el ligando, además de retener la estructura química nativa del ligando. Las técnicas basadas en la fluorescencia apoyan la comprensión precisa de la base estructural de la activación del receptor mediante el sondeo directamente el estado conformacional del receptor. 20, 21 Sin embargo, las técnicas que poseen la flexibilidad para introducir etiquetas fluorescentes en los GPCR específica de sitio son limitados. Estamos interesados ​​en el empleo de estrategias de modificación química bioorthogonal para facilitar la detección de moléculas individuales (SMD) de complejos de señalización de GPCR. 22 El grupo azido puede participar en las químicas bioorthogonal como la ligadura de Staudinger-Bertozzi, 23, 24 azida-deformación-promovido sin cobre cicloadición alquino (SpAAC) 25 y azida alquino cicloadición catalizada por cobre (CuAAC). 26 Nos centramos aquí en la reacción de ligación Staudinger-Bertozzi que implica la reacción específica entre una azida y una fosfina. Se demuestra el uso de dos derivados de fosfina diferentes, conjugados a un epítopo de péptido (péptido FLAG) o un marcador fluorescente(Fluoresceína) para lograr la modificación específica de sitio de los GPCR. Previamente Hemos optimizado las condiciones para el etiquetado específico del sitio de la rodopsina AZF variantes utilizando la estructura cristalina de rayos X y simulaciones dinámicas para elegir los sitios de destino que estén expuestos al disolvente. 27, 28 también ilustra la factibilidad de lograr un etiquetado fondo libre por Staudinger- ligadura Bertozzi. 29 Se demuestra aquí el procedimiento general empleado para conseguir el marcaje fluorescente de un receptor solubilizada con detergente que está inmovilizado sobre una matriz de inmunoafinidad y posteriormente visualizada por fluorescencia en gel. Además, demostramos una útil extensión de esta estrategia de etiquetado para identificar posiciones susceptibles de etiquetado en un receptor de estructura desconocida, CCR5. Esto se lleva a cabo utilizando una estrategia de marcado epítopo de péptido dirigido que se basa en la modificación de bioorthogonal azf-GPCR variantes en un formato semi-alto rendimiento basado en células. 30 Estamétodo explota las propiedades de detección de varios pasos de un ELISA de la superficie celular para monitorear eventos de etiquetado. Las metodologías que se discuten aquí son generales y, en principio, se pueden aplicar a cualquier GPCR incorporado con AZF utilizando el codón ámbar tecnología de supresión. En los protocolos presentados aquí detallamos los pasos involucrados en la expresión de células de mamíferos de los receptores incorporados con UAAs como AZF utilizando el método de mutagénesis de aminoácidos no naturales y sus aplicaciones posteriores para facilitar los estudios estructurales y dinámicas de los GPCRs.

<table><tbody><tr><td>Plásmido pSVB. Yam</td><td></td><td></td><td>(Ye et al., 2008)</td></tr><tr><td>pcDNA.RS de plásmidos para azF</td><td></td><td></td><td>(Ye et al., 2009)</td></tr><tr><td>Plásmidos pMT4.Rho y pcDNA 3.1.CCR5</td><td></td><td></td><td>Opcionalmente contienen el codón de parada ámbar (TAG) en la posición deseada</td></tr><tr><td>Células</td><td></td><td></td> HEK 293T <td>Células adherentes</td></tr><tr><td>Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10566</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato</td><td>Gibco</td><td>14200</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gemini Bioproductos</td><td>100-106</td> <td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectamine Plus</td><td>Invitrogen</td><td>Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>p-azido-L-fenilalanina</td><td>Chem-Impex International</td><td>6162</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><fuerte>Tabla 1.</fuerte> Incorporación genética específica de sitio de aminoácidos no naturales en materiales GPCRs</td></tr><tr><td>Lámpara UV-A Maxima ML-3500S</td><td>Spectronics Corporation</td><td></td><td>azF se activa con luz de 365 nm</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada de Hank (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14065</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Irvine Scientific</td><td>9319</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Roche</td><td>3117405001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr>ligando <td></td><td></td><td>marcado con tritio</td><td>De un colaborador (Grunbeck et al., 2012)</td></tr><tr><td>1% (p/v) n-dodecil-&beta;-D-maltósido</td><td>Anatrace</td><td>D310LA</td><td>&nbsp;</td></tr><tr>Resina <td></td><td></td><td>de 1D4-sefarosa</td><td>1D4 mAb inmovilizada en resina de sefarorosa 2B activada por CNBr</td></tr><tr><td>1% (p/v) dodecil sulfato de sodio (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% de los geles SDS</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td>SDS-PAGE realizados en el aparato NuPAGE</td></tr><tr><td>Aparato Trans-Blot SD</td><td>Biorad</td><td></td><td>Aparato para transferencia semiseca</td></tr><tr><td>Membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) de Immobilon</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Leche descremada</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9934262</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Preadolescente-20</td><td>Aldrich</td><td>274348</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ecoscint A</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-273</td><td>Fluido de centelleo</td></tr><tr><td>Viales de centelleo</td><td>Fisher Scientific</td><td>333726</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>LKB Wallac 1209 Rackbeta Contador de centelleo líquido</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Contador de centelleo</td></tr><tr><td>beta Anti-rodopsina 1D4 mAb</td><td>Centro Nacional de Cultivo Celular</td><td>personalizado</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado anti-ratón IgG</td><td>KPL, Inc.</td><td>474-1806</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Pico</td><td>Thermo Scientific</td><td>34080</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hyblot CL AR película</td><td>Denville</td><td>E3018</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><fuerte>Tabla 2.</fuerte> Materiales de fotoreticulación dirigidos</td></tr><tr><td>0,25% Tripsina</td><td>Invitrogen</td><td>15050065</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FLAG-triarilfosfina</td><td>Sigma</td><td>GPHOS1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BANDERA M2 mAb</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-CCR5 2D7 mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>555990</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Poly-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>Costar</td><td>3601</td><td>Fondo transparente, alta unión EIA/RIA</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (calcio, magnesio)</td><td>Gibco</td><td>14040</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehído</td><td>EMS</td><td>28908</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>KPL, Inc.</td> <td>conjugada con HRP</td>.<td>474-1516</td> <td>y nbsp;</td></tr><tr><td>IgG anti-conejo KPL</td><td>, Inc.</td><td>474-1516</td> <td>y nbsp;</td></tr><tr><td>Amplex Red</td><td>Invitrogen</td><td>A12222</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno</td><td>DE Productos para el cuidado de la salud</td><td>97-93399</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lector de placas multipocillo de fluorescencia CytoFluor II</td><td>Perseptive Biosystems</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><fuerte>Tabla 3.</fuerte> Marcado dirigido de péptidos-epítopos y materiales ELISA de superficie celular</td></tr><tr><td>Fluoresceína-fosfina</td><td></td><td></td> <td>(Huber et al., presentado en 2012)</td></tr><tr><td>Nonapéptido (péptido C9)</td><td>AnaSpec</td><td>62190</td><td>Péptido que imita el epítopo 1D4 NH2-TETSQVAPA-COOH</td></tr><tr><td>1% (p/v) n-dodecil-&beta;-D-maltósido</td><td>Anatrace</td><td>D310LA</td><td>&nbsp;</td></tr><tr>Resina <td></td><td></td><td>1D4-sepharose</td><td>1D4 mAb inmovilizado en resina de sepharose 2B activada por CNBr</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% SDS geles</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td>SDS-PAGE realizado en aparatos NuPAGE</td></tr><tr><td>Escáner de fluorescencia Confocal Typhoon 9400</td><td>GE Healthcare</td><td>descatalogado</td><td>Escáner con láser de longitud de onda de 488</td></tr> <tr><td>nm&nbsp;</td><td></td><td></td><td><fuerte>Tabla 4. Materiales de etiquetado </fuertes>fluorescentes</td></tr></tbody></table>

codificados genéticamente-sondas moleculares para estudiar g receptores acoplados a proteínas

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Para facilitar los estudios estructurales y dinámicas de proteína G-receptor acoplado (GPCR) de señalización complejos, se necesitan nuevos enfoques para introducir sondas o etiquetas informativas en receptores expresados ​​que no perturban la función del receptor. Se utilizó tecnología de supresión de ámbar codón para genéticamente a codificar el aminoácido no natural, p-azido-L-fenilalanina (azf) en varias posiciones específicas en los GPCRs heteróloga expresadas en células de mamífero. La versatilidad del grupo azido se ilustra aquí en diferentes aplicaciones para estudiar los GPCR en su ambiente celular nativo o bajo condiciones de detergente solubilizadas. En primer lugar, demostramos una tecnología fotorreticulación específica basada en células para identificar los residuos en el bolsillo de unión a ligando de GPCR en donde un ligando de molécula pequeña marcada con tritio se reticula a un aminoácido codificado genéticamente azido-. Se demuestra a continuación, la modificación específica de sitio de los GPCR por la bioorthogonal ligadura de reacción de Staudinger-Bertozzición que se dirige el grupo azido el uso de derivados de fosfina. Se discute una estrategia general para el objetivo marcado péptido epítopo de las proteínas de membrana expresadas en la cultura y su detección mediante un enfoque basado en ELISA de células enteras. Por último, se muestra que AZF-GPCR pueden ser etiquetados de forma selectiva con sondas fluorescentes. Las metodologías discutidos son generales, en que pueden, en principio, aplicarse a cualquier posición del aminoácido en cualquiera de GPCR expresado para interrogar a los complejos de señalización activo.

Se empleó la metodología de mutagénesis de aminoácidos no naturales a sitios específicos introducir sondas moleculares en un GPCR utilizando el codón ámbar tecnología de supresión. El esquema de la figura 1 resume los pasos más destacados de la metodología y de las diversas aplicaciones de la incorporación de la SAU versátil, p-azido-L-fenilalanina (AZF), en GPCRs. Expresión de AZF-GPCR en células de mamíferos permite dirigido fotorreticulación a ligandos, y dirigido etiquetado péptido epítopo ...

Nos genéticamente-codificar el aminoácido no natural, p-azido-L-fenilalanina en varias posiciones específicas en los GPCR y mostrar la versatilidad del grupo azido en diferentes aplicaciones. Estos incluyen una tecnología fotorreticulación dirigido a identificar los residuos en el bolsillo de unión a ligando de un GPCR, y la modificación bioorthogonal específica de sitio de los GPCR con una etiqueta de epítopo de péptido o de la sonda fluorescente.

Codificados genéticamente-sondas moleculares para Estudiar G receptores acoplados a proteínas

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en introducir una sonda informativa única en receptores acoplados a proteínas G diana para facilitar estudios estructurales y dinámicos de complejos de señalización. Esto se logra mediante la transfección de células con los plásmidos necesarios para expresar la maquinaria traduccional requerida que incorpore el aminoácido no natural zeto fenilalanina, o zeto fee, en un RCPG expresado. La variante de RCPG con zeto fee puede entonces aplicarse de tres maneras diferentes para investigar la estructura y función del receptor.Primero, el zeto fee se utiliza como un fotoactivador de entrecruzamiento en el RGPC, lo que permite la identificación del sitio de unión de un ligando tritiado. A continuación, el zeto fee puede emplearse como un grupo químico reactivo para unir un péptido conjugado o una sonda fluorescente al RGPC mediante químicas de etiquetado bioortogonal. Los resultados obtenidos demuestran el uso de la sonda molecular zeto fee en el entrecruzamiento foto-dirigido, la etiqueta de epítopo dirigida y la marcación fluorescente de RGPCs, basados en métodos bioquímicos y en células vivas. La principal ventaja de esta técnica fr

genetically-encoded-molecular-probes-to-study-g-protein-coupled

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El ensayo de movilización de calcio basado en fluorescencia que aquí se describe es un sistema de cribado de la farmacología inversa medio de rendimiento para la identificación de ligando funcionalmente la activación (s) de G receptores acoplados a proteínas huérfanas (GPCRs).

Caracterización de G receptores acoplados a proteína por un ensayo de movilización de calcio basado en fluorescencia

Los métodos sencillos para detectar la activación selectiva de proteínas G por receptores acoplados a proteínas G siguen siendo un desafío pendiente en la señalización celular. Aquí, los biosensores de transferencia de energía por resonancia (FRET) de Förster se han desarrollado mediante la unión por pares de un GPCR a péptidos de proteínas G para sondear los cambios conformacionales a concentraciones controladas en células vivas.

Conformaciones GPCR Proteína G-selectivos mide usando sensores FRET en un fluorómetro Ensayo de suspensión de células vivas

La unión a trifosfato de guanosina (GTP) es uno de los primeros eventos en la activación de receptores acoplados a proteína G (GPCR). Este protocolo describe cómo caracterizar farmacológicamente las interacciones específicas de GPCR-ligando mediante la monitorización de la unión del análogo de GTP marcado con radio, [35S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPγS), en Respuesta a un ligando de interés.

Medición de la señalización del receptor acoplado a la proteína G mediante unión de GTP marcada con radio

El ensayo celular se describe está diseñado para la identificación del receptor de quimiocina CXC 4 (CXCR4)-agentes interactuantes que inhiben o estimulan, ya sea competitivo o allosterically, la intracelular Ca2 + liberación iniciada por activación de CXCR4.

Un ensayo de cinética basada en fluorescencia Ca2 + movilización para identificar G proteína-juntó el Receptor agonistas, antagonistas y moduladores alostéricos

Un análisis simplista de la fluorescencia se presenta para evaluar la eficiencia de amino-acil-tRNA-sintetasa/tRNA pares no-canónico-aminoácidos (ncAAs) incorporar las proteínas expresadas en células de mamíferos. Se describe la aplicación de ncAAs estudiar receptores acoplado proteína G (GPCRs), incluida la asignación de foto-reticulación de enlace sitios bioorthogonal GPCR etiquetado en células vivas.

Optimizar la incorporación genética de química sondas en GPCRs para foto-reticulación asignación y la química de Bioorthogonal en células de mamífero vivo

Aquí, presentamos protocolos para descubrir compuestos activos en los receptores GABAA , de la Unión a la fisiología y la farmacología.

Métodos para el descubrimiento de nuevos compuestos modular un Receptor del ácido Gamma - Aminobutírico tipo una neurotransmisión

Dado que los GPCR son objetivos atractivos para drogarse, el cribado de ligando GPCR es por lo tanto indispensable para la identificación de compuestos de plomo y para estudios de desorfanización. Hacia estos esfuerzos, describimos PRESTO-Tango, una plataforma de recursos de código abierto utilizada para la elaboración simultánea de perfiles de reclutamiento transitorio de é-arrestin2 en aproximadamente 300 GPCRs utilizando un ensayo de reportero basado en TEV.

Interrogatorio paralelo del reclutamiento de la serie 2 para la detección de ligandos a escala de GPCR a escala mediante el ensayo PRESTO-Tango

En este trabajo, se describe un ensayo de fluorescencia de calcio intracelular de alto rendimiento para placas de 384 pocillos para examinar bibliotecas de moléculas pequeñas en receptores acoplados a proteínas G recombinantes (GPCR). El objetivo, el receptor de cinina de la garrapata de la fiebre del ganado, Rhipicephalus microplus, se expresa en las células CHO-K1. Este ensayo identifica agonistas y antagonistas utilizando las mismas células en un ensayo de "doble adición".

Un ensayo de fluorescencia de calcio de "doble adición" para el cribado de alto rendimiento de receptores acoplados a proteínas G recombinantes

Este protocolo describe el uso de biosensores basados en BRET para la medición en tiempo real de la activación de la proteína G en células HEK293 vivas tras la estimulación del ligando del receptor acoplado a proteína G. Aquí, el receptor β2-adrenérgico y el receptor cannabinoide tipo 1 sirven como ejemplos para demostrar la eficiencia de los sensores para varios subtipos de proteína G y en varios GPCR.

Biosensores de proteína G basados en BRET para medir la actividad del receptor acoplado a proteína G en células vivas

Pruebas de sensibilidad visual de las lagartijas con un paradigma de condicionamiento operante que utiliza la reproducción de vídeo de puntos aleatorios kinematograms e invertebrados generadas por ordenador.

Prueba de sensibilidad visual a la velocidad y dirección del movimiento en lagartos

Aprende a incorporar sondas moleculares codificadas genéticamente en receptores acoplados a proteínas G mediante la aminoácido no natural p-azido-L-fenilalanina. Este método permite estudios estructurales con fotoenlace y marcaje bioortogonal específico.

Codificados genéticamente-sondas moleculares para Estudiar G receptores acoplados a proteínas

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