Codificados genéticamente-sondas moleculares para Estudiar G receptores acoplados a proteínas

El objetivo general del siguiente experimento consiste en introducir una sonda informativa única en receptores acoplados a proteínas G diana para facilitar estudios estructurales y dinámicos de complejos de señalización. Esto se logra mediante la transfección de células con los plásmidos necesarios para expresar la maquinaria traduccional requerida que incorpore el aminoácido no natural zeto fenilalanina, o zeto fee, en un RCPG expresado. La variante de RCPG con zeto fee puede entonces aplicarse de tres maneras diferentes para investigar la estructura y función del receptor.

Primero, el zeto fee se utiliza como un fotoactivador de entrecruzamiento en el RGPC, lo que permite la identificación del sitio de unión de un ligando tritiado. A continuación, el zeto fee puede emplearse como un grupo químico reactivo para unir un péptido conjugado o una sonda fluorescente al RGPC mediante químicas de etiquetado bioortogonal. Los resultados obtenidos demuestran el uso de la sonda molecular zeto fee en el entrecruzamiento foto-dirigido, la etiqueta de epítopo dirigida y la marcación fluorescente de RGPCs, basados en métodos bioquímicos y en células vivas. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como el uso de ligandos de afinidad fotoreactivos o la marcación de cisteínas, es la flexibilidad para introducir de forma específica un aminoácido no natural, biológicamente inerte y reactivo, la p-zeto fenilalanina, en una posición conocida de un receptor diana.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la señalización de los receptores acoplados a proteínas G, incluyendo la identificación de los sitios de interacción en un complejo receptor LIG en su entorno nativo de membrana, y facilitar estudios fluorescentes a nivel de molécula individual mediante la identificación de posiciones en el A-G-P-C-R adecuadas para marcado bioortogonal. Tercero, este método puede proporcionar información sobre el mecanismo molecular de los receptores acoplados a proteínas G y también puede aplicarse a otros sistemas, como diversas proteínas celulares y de membrana. Antes de comenzar este experimento, mantenga las células HEC 293T en medio de Eagle modificado por KO, suplementado con 10% de suero bovino fetal a 37 grados Celsius en una atmósfera de 5% CO2.

Transfecte las células al 60-80 % de confluencia en una placa de 10 centímetros con G pcr, r CD, NA utilizando el reactivo lipectomy plus según se describe en el protocolo del texto. Al día siguiente, sustituya el medio de crecimiento por DMEM que contenga 10 % de FBS y 0,5 milimolar de fee. 48 horas después de la transfección, analice la expresión según se describe en el texto.

Continúe con los procedimientos de foto, reticulación o etiquetado según se describe en el resto de este video. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, aspire el medio de las células y reemplácelo con cuatro mililitros de solución salina tamponada con fosfato al uno x o PBS, y devuelva a 37 grados Celsius durante 15 minutos para que las células se desprendan de la placa. Luego, re suspenda las células con uno XPBS y transfiera a un tubo Falcon. Centrifugue a 1500 RPM durante dos minutos.

Para obtener el sedimento celular, aspire el sobrenadante antes de resuspender el sedimento en una solución salina tamponada con Hanks 1x que contenga el ligando tritiado a concentración saturante de unión, preparada según se describe en el protocolo del texto. Incube el sedimento a 37 grados Celsius durante el tiempo necesario para asegurar la formación del complejo receptor-ligando, lo cual depende del receptor y ligando específicos. A continuación, transfiera la suspensión celular a una placa de 24 o 96 pocillos.

Luego, active fotoquímicamente el zeto fee utilizando una lámpara de ultravioleta a 365 nanómetros durante 15 minutos a cuatro grados Celsius, manteniendo la placa sobre hielo para evitar el calentamiento de la muestra y la lisis celular. Tras la activación fotoquímica, transfiera las células a un tubo einor y centrifugue para formar el pellet celular tras la centrifugación. Retire el sobrenadante y continúe con el análisis.

Re-suspender el pellet celular en tampón de lisis e incubar las células durante una hora a cuatro grados Celsius. A continuación, centrifugar el lisado celular durante 10 minutos a 16.000 × g. Antes de transferir el sobrenadante a un nuevo tubo, añadir SROs modificadas con anticuerpo monoclonal 1D cuatro unidas a resina B a la muestra y dejar incubar toda la noche a cuatro grados Celsius para inmunopurificar el RCPG utilizando el epítope monoclonal 1D cuatro en el extremo C modificado. Al día siguiente, lavar varias veces las perlas con tampón de lisis. Eluir las muestras con SDS al 1 % a 37 grados Celsius durante una hora con agitación.

Transfiera una porción del EENT a un vial de 15 mililitros que contenga líquido de centelleo y cuente en un contador de centelleo beta para cuantificar la cantidad de unión específica del ligando tritiado al receptor. Resuelva el EENT purificado restante mediante electroforesis en gel estándar utilizando un gel SDS al 4-12 % con una escala de proteínas estándar. Luego, transfiera semiseca a una membrana A-P-V-D-F para inmunodetección.

Bloquee la membrana de PVDF con leche al 5 % en tampón TBS que contiene Tween 20 al 0,05 %. Sonda la membrana para confirmar la expresión del receptor de longitud completa con el anticuerpo monoclonal 1D cuatro, seguido del anticuerpo secundario anti-US IgG conjugado con HRP. A continuación, trate la membrana con el reactivo de quimioluminiscencia mejorada.

Exponga la membrana a una película de auto radiografía para visualizar las bandas. A continuación, corte la membrana con una cuchilla de afeitar para separar cada carril de muestra y luego corte en los marcadores específicos de peso molecular. Transfiera los segmentos de la membrana a viales que contienen líquido de centelleo y luego cuantifique la cantidad de tritio en cada segmento de membrana mediante conteo en un contador de centelleo beta.

Identifique el enlace cruzado fotográfico positivo mediante la detección de tritio en la masa molecular aparente igual a la suma del receptor acoplado a proteína G (GPCR) y el ligando. Después de lavar y contar las células, trate previamente una placa de 96 pocillos de alta unión con fondo transparente, añadiendo 100 microlitros de 10 microgramos por mililitro de poli-D-lisina por pocillo e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Luego, lave repetidamente con un XPBS antes de dejar secar al aire la placa con las células transfectadas en 200 microlitros a una densidad de 60 a 80.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos y regrese a 37 grados Celsius en una atmósfera de 5% CO2. Al día siguiente.

Prepare las células para la marcación. Lave suavemente las células tres veces con 100 microlitros por pocillo utilizando un XPBS para eliminar cualquier medio de crecimiento que contenga zeto fee. Prepare un tampón que contenga de 50 a 200 micromoles de reactivo de marcación flag Tri AAL PHOSPHINE según se describe en el protocolo del texto.

Aplique 60 microlitros a cada pocillo. Mantenga un conjunto de pocillos sin tratamiento de etiquetado y con tampón. Incluya también un control del receptor acoplado a proteína G de tipo salvaje para compararlo con la variante del receptor acoplado a proteína G con alimentación cero.

Devuelva la placa a 37 grados Celsius entre 30 minutos y cuatro horas después de la incubación. Lave las células tres veces con 100 microlitros por pozo de tampón bloqueador para eliminar completamente la etiqueta no reactiva. A continuación, agregue 100 microlitros por pozo de paraformaldehído al 4 % a las células tras incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Lave las células tres veces con tampón de bloqueo. Realice un protocolo estándar de EISA de superficie celular para detectar el receptor marcado y la expresión del receptor, incubando primero con el anticuerpo primario durante 1,5 horas en hielo. A continuación, realice una incubación con el anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante una hora.

A continuación, agregue 100 microlitros de anticuerpo secundario Anti-Flag M dos diluido para detectar el epítope peptídico Flag del reactivo de etiquetado Flag-Tri AAL con fosfina. También analice los pocillos no etiquetados como control negativo.

Luego, agregue el anticuerpo anti-CCR5 2D7 diluido a conjuntos separados de pocillos para determinar la expresión en la superficie celular de GPCR de tipo silvestre o zeta negativa. Lave las células tres veces con tampón de bloqueo e incube con 100 microlitros de anticuerpo anti-IgG de US conjugado con HRP diluido.

Después de lavar cuidadosamente las células cinco veces con tampón de bloqueo, agregue 50 microlitros de tampón de detección e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, recoja los datos espectrales en un lector de placas multipozo de fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 530 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 590 nanómetros. Comience el procedimiento de etiquetado lisando 10 millones de células recolectadas que expresan tipo silvestre o zeto fee.

Incubar la opsina de bastones en un mililitro de tampón de solubilización durante una hora a cuatro grados Celsius. Recoger la fracción sobrenadante tras la centrifugación del lisado celular a 15.000 × g durante 10 minutos. A continuación, añadir 100 microlitros de anticuerpo monoclonal 1D4 unido a resina Spheros 2B para capturar el receptor mediante el epítopo 1D4 en el extremo C-terminal modificado.

Después de incubar durante 12 horas a cuatro grados Celsius, lave la resina tres veces según se describe en el protocolo escrito. A continuación, marque el receptor inmovilizado sobre la matriz de inmunoafinidad añadiendo 0,1 milimolar de fosfina de fluoresceína a un volumen total de 0,3 a 0,5 mililitros, incube durante 12 horas a temperatura ambiente antes de centrifugar tras la eliminación del sobrenadante. Lave la resina para eliminar cualquier marcador no reaccionado y eluya el receptor marcado con 100 microlitros de tampón Elian mediante incubación sobre hielo durante una hora.

Separar las muestras marcadas mediante electroforesis SDS-PAGE en condiciones reductoras. Lavar brevemente los geles en PBS antes de la etiquetación de un zeto fee. GPCR mediante fluorescencia Ingel utilizando un escáner de fluorescencia confocal con un láser de longitud de onda de 488 nanómetros para detectar el receptor modificado con fluoresceína.

Se utilizó la metodología de mutagénesis con aminoácidos no naturales para introducir de manera específica sondas moleculares en el sitio C del A-G-P-C-R mediante la tecnología de supresión del codón ámbar. Luego, se puede emplear la técnica de fotoenlace cruzado para investigar los aspectos estructurales de los complejos de ligandos del GPCR en células vivas, utilizando un ligando pequeño marcado con radioactividad, tritiado. Se utilizó Ravi Rock para identificar su sitio de unión en el G-P-C-R-C-C-R cinco.

En este ejemplo, la irradiación con UV en células que expresan zeto fee. CCR cinco varianza previamente incubadas con Ravi tritiado. Rock da como resultado complejos entrecruzados covalentemente que pueden identificarse mediante la etiqueta radiactiva sensible en el ligando.

Entre las varias posiciones en CCR5, la lucina 28 zeto fí y el triptófano 86 zeto fí mostraron capacidad de fotoenlazar con Ravi Rock tritiado, como se muestra con recuentos de centelleo significativamente más altos. El receptor de tipo silvestre no mostró enlazamiento cruzado con el ligando radiactivo. Las químicas de marcado bioortogonal pueden usarse para modificar específicamente un zeto fí en el sitio C.

Una estrategia de variación de A-G-P-C-R implica la etiquetación dirigida de epítopes en células vivas mediante una etiqueta peptídica conjugada con péptido flag. Se utiliza el reactivo de etiquetado Tri AAL PHOSPHINE para citar y modificar específicamente un zeto fee. La variación de CCR cinco mostrada aquí representa datos procedentes de una estrategia de detección EISA sensible y de múltiples pasos, utilizada para identificar posiciones etiquetadas con el péptido flag.

Entre las posiciones en CCR5 investigadas, todos los zimógenos se analizaron. Las variantes de CCR5 se expresaron en la superficie celular y aproximadamente la mitad de ellas sufrieron con éxito el etiquetado dirigido de epítopes; el CCR5 de tipo salvaje sirvió como control negativo para el etiquetado de epítopes, mostrando la ausencia de señal anti-Flag. En una estrategia alternativa, los receptores acoplados a proteína G de zimógeno solubilizados con detergente y inmovilizados en una matriz de inmunoafinidad, como el anticuerpo monoclonal anti-1D4 conjugado a resina Spheros 2B, se marcaron con una etiqueta conjugada a fluoro4.

La imagen de fluorescencia Ingel demuestra la marcación fluorescente exitosa de la opsina GPCR en tres posiciones diferentes, tal como se esperaba; la opsina de tipo salvaje no mostró marcación de fondo, como se observa por la ausencia de una banda fluorescente en el peso molecular esperado del receptor. Al realizar este procedimiento, es importante recordar confirmar la expresión completa de la GPCR diana con un conjunto específico de ácido introducido AOL Alanina. Después de su desarrollo.

Esta técnica allanará el camino para que los investigadores en el campo de la biología de receptores exploren cualquier complejo receptor-ligando o etiqueten un receptor diana. Mediante el uso del aminoácido no natural introducido específicamente en un sitio, la p-zeto-fenol alanina, como sonda reactiva. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo utilizar la neogénesis de aminoácidos no naturales para introducir una sonda molecular en un A-G-P-C-R y facilitar estudios estructurales y dinámicos de complejos de señalización de GPCR mediante técnicas de fotoenlace dirigido y etiquetado bioortogonal.