Proteómica Preparación de muestras de formol fija y embebidos en parafina de tejidos

El objetivo general de este procedimiento es generar y prefraccionar péptidos a partir de material formal y fijo e incluido en parafina o FFPE para el análisis proteómico. Esto se logra mediante el aislamiento del tejido deseado mediante microdisección, seguido de lisis celular. El segundo paso es generar péptidos mediante el procesamiento de muestras.

El uso de un filtro de digestión multienzimática ayudó a la preparación de la muestra. A continuación, los péptidos se cuantifican midiendo su fluorescencia de triptófano. El paso final es el fraccionamiento de los péptidos utilizando una técnica de separación basada en un intercambiador de aniones fuerte para el fraccionamiento de péptidos.

En última instancia, las muestras preparadas permiten el análisis de proteomas desde cantidades diminutas de material hasta una profundidad de 10.000 proteínas. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la digestión en gel o en solución, es que es aplicable a cantidades mínimas de muestras clínicas, como las células de microdisección láser. El método proporciona muestras que contienen péptidos perfectos y puros.

¿Qué facilita la exploración proteómica de los tejidos humanos y las enfermedades? Todo el protocolo consta de técnicas desarrolladas y publicadas en el pasado. Estos incluyen FASP de alta recuperación, punteado de pipeta y determinación del contenido de péptidos basada en la fluorescencia de triptófano, lo que demuestra que el procedimiento será la Sra.

Catina establecerá un técnico de nuestro laboratorio Para comenzar a preparar cortes de tejido para secciones de corte de microdisección con un micrótomo. El grosor de las rodajas depende de la muestra. Por lo general, la microdisección funciona bien con cortes de siete a 10 micrómetros.

Después de irradiar los portaobjetos de membrana con luz ultravioleta durante 45 minutos, monte las secciones en ellos antes de secar a 37 grados centígrados durante dos horas. Separar las secciones montadas por dos incubaciones sucesivas en frascos consecutivos de xileno durante dos minutos y medio y un minuto y medio. A continuación, rehidratar las secciones por secuencias.

Incubaciones de un minuto en etanol absoluto, 70% etanol. Y por último, el agua. Después de teñir las secciones con Hematin de Meyer durante 20 segundos.

Enjuague con agua durante un minuto y deje secar al aire. Recoja la población celular de interés utilizando un sistema de microdisección de captura láser. Cuando utilice el instrumento de la palma de la mano, recoja las muestras en las tapas adhesivas utilizando tres microlitros de tampón de lisis tisular para 10 nanolitros del tejido de microdisección.

Aplique el tampón al material micro diseccionado en la tapa y cierre el tubo. Recoja la suspensión después de una breve centrifugación. A continuación, pique el tejido disecado a 99 grados centígrados en un bloque calefactor con agitación durante una hora.

Clarificar el extracto crudo por centrifugación a 16, 000 Gs y 18 grados centígrados durante 10 minutos. Mezcle hasta 50 microlitros del lisado clarificado con 200 microlitros de la solución de UA en una unidad de ultrafiltración. A continuación, centrifugar a 14.000 GS hasta que queden menos de 10 microlitros de la solución en el filtro.

Por lo general, este paso requiere de 10 a 15 minutos de centrifugación. A continuación, pipetee 200 microlitros de la solución de UA en la unidad de ultrafiltración y la centrífuga. Al igual que antes, vacíe el tubo colector antes de pipetear 50 microlitros de la solución I A A en la unidad de ultrafiltración.

Mezclar a 600 RPM en una termobatidora a temperatura ambiente durante un minuto y centrifugar. Como antes, continúe con los pasos de ultrafiltración y centrifugación como se describe en el protocolo de texto que acompaña a este video. A continuación, transfiera las unidades de filtración a nuevos tubos de recolección.

Pipetear 40 microlitros de tampón de digestión con endoproteinasa lic C antes de mezclar a 600 RPM en el termomezclador durante un minuto. Incubar las unidades en una cámara húmeda a 37 grados centígrados durante 18 horas. Después de centrifugar las unidades de filtrado como se hizo anteriormente, pipetee 160 microlitros del tampón DB y centrifuga.

Las unidades de filtro a través de las cuales se agrupa el flujo contiene los péptidos liberados por la endoproteasa lic C. A continuación, recoge los péptidos trípticos como se describe en el protocolo de texto. La medición del contenido de péptidos en los digeridos de proteínas se puede realizar en tampón diluido porque los residuos de triptófano son bien accesibles para el solvente. Para cuantificar los péptidos, primero pipetee 0,2 mililitros de tampón de ensayo DB en el cuarzo Q vet.

A continuación, coloque el Q vet en el soporte qve del instrumento y registre el espectro de emisión de la pieza en bruto. Prepare una curva de calibración utilizando pasos de 0,1 microgramos añadiendo una alícuota de microlitros de la solución patrón de triptófano al Q vet y mezclando suavemente con el tampón db. Después de limpiar el Q vet, pipetee la muestra y registre el espectro de la muestra.

Proceda a calcular la concentración de proteínas y péptidos como se describe en el protocolo de texto antes del fraccionamiento. Prepare la columna de punta SAX apilando seis capas de EM. Membrana de iones de importación en una punta de pipeta común de 0,2 mililitros. Haga dos columnas de punta SAX por muestra.

A continuación, prepare la punta del escenario apilando tres capas de M cuatro C 18. En una punta de pipeta de 0,2 mililitros, haga seis puntas de etapa para cada muestra. Comenzar.

Fraccionamiento: diluir las soluciones peptídicas obtenidas por digestiones con ly C con 0,2 mililitros de BRI y tampón universal Robinson. pH 11 diluye de manera similar las soluciones peptídicas obtenidas por digestiones con tripsina con 0,2 mililitros de tampón Britain y Robinson Universal. pH cinco, ensamble la columna de punta SAX en la tapa del adaptador del tubo centrífugo antes de lavar y acumule el equilibrio de la columna de punta SAX y las puntas de la etapa C 18 como se describe en el protocolo de texto.

A continuación, ensamble la columna de punta SAX en la punta de la etapa C 18. Cargue las soluciones de muestra en las columnas de punta SAX equilibradas y centrifugue las columnas a 5.000 Gs durante tres minutos. Lave las columnas de la punta de la pipeta con 0,1 mililitros de las muestras diluidas.

Facilitar el flujo por centrifugación a 5, 000 Gs. Transfiera la columna de punta SAX a la siguiente punta de la etapa C 18 y continúe eluyendo los péptidos como se describe en el protocolo de texto. Después de lavar las puntas de la etapa C 18 con 0,05 mililitros de tampón A, eluir las fracciones con 0,05 mililitros de tampón B en viales, que luego se utilizan para la inyección de las muestras en un sistema de cromatografía líquida ensamblado con un espectrómetro de masas representativo. Aquí se muestran los resultados de la extracción y digestión de proteínas.

La lisis de 250 nanolitros de tejido, que corresponde a un área microdisecada de 25 milímetros cuadrados de un corte de 10 micrómetros, da como resultado aproximadamente 45 microgramos de proteína total después de la digestión consecutiva de dos pasos en el formato rápido con endoproteasa corte C y tripsina da como resultado rendimientos de más del 50% de la proteína total. Aquí se muestra una medición de fluorescencia representativa del contenido de péptidos, los espectros del estándar de triptófano y la muestra muestra máximos de 350 a 360 nanómetros. La intensidad de la fluorescencia es proporcional al contenido de triptófano.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar muestras de tejido alto para el análisis proteómico utilizando la técnica de microdisección, procesamiento de muestras y fraccionamiento de péptidos Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres o cuatro horas más el tiempo necesario para la indigestión de proteínas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar rodajas de pañuelo recién preparadas después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la proteómica exploraran los proteomas de los tejidos y las células y las anomalías en los seres humanos utilizando arval para material incrustado fijo y parén.