Name: Proteómica Preparación de muestras de formol fija y embebidos en parafina de tejidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprende a preparar muestras de tejido FFPE para análisis proteómico mediante microdisección láser, digestión enzimática y fraccionamiento SAX. Este protocolo permite identificar hasta 10,000 proteínas a partir de cantidades mínimas de material clínico.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El autor agradece al Dr. Matthias Mann por el apoyo continuo y la Sra. Katharina Zettl para demostrar el método. Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Max-Planck para el Avance de la Ciencia.

1. Instrumental Necesario <ol><li> Preparación de cortes de tejido para microdisección y muestra lisis <ol><li> Bloque térmico ajustado a 99 ° C o un baño con agua hirviendo. </li><li> Microdissector operativo láser (por ejemplo, la palma, Zeiss, Göttingen, Alemania). </li><li> Termostatizada centrífuga de mesa, la temperatura establecida en 20 ° C. </li><li> Cámara húmeda (caja) con un estante para tubos de eliminación de tipo Eppendorf. </li><li> Incubadora ajustado a 37 ° C. </li><li> Spectrofluorometer que permite la medición de la fluorescencia excitada cerca de la luz UV con cubetas de cuarzo micro-escala (0,1-,2 ml). </li></ol></li></ol> 2. Soluciones <ol><li> «Tejido Tampón de Lisis &#39;(TLB): de 0,1 M de Tris-HCl, pH 8,0, DTT 0,1 M, 0,5% (w / v) de polietilenglicol 20.000 y 4% de SDS. </li><li> Solución AU: 8 M de urea en 0,1 M de Tris-HCl, pH 8,5. Prepare 1 ml por 1 muestra. Soluciones de acceso universal y la AAI tiene que ser recién preparadas, se utiliza dentro de un día. </li><li> Solución IAA: 0.05 M iodoacetamide en UA. Preparar 0,1 ml por 1 muestra. </li><li> Endoproteinasa Lys-C, la solución madre. </li><li> Tripsina, solución de reserva. </li><li> &#39;La digestión buffer&#39; (DB): 0,05 M Tris-HCl pH 8,5. Preparar 0,25 ml por 1 muestra. </li><li> &#39;El triptófano solución estándar&#39;: 0,1 mg de triptófano en 1 ml de agua desionizada. </li><li> &#39;El tampón de ensayo B&#39; (ABB): 10 mM de Tris-HCl, pH 7,6. </li><li> Solución madre de Britton y Robinson Universal Buffer (Brub). Preparar una solución que contiene 0,1 M de CH 3 COOH, 0.1 MH 3 PO 4, y 0,1 MH 3 BO 3 y ajustar con NaOH 1 M a pH requerido (2, 4, 5, 6, y 11). Antes de utilizar la dilución 5 veces con agua desionizada. </li><li> Tampón A: 1% (v / v) CH 3 COOH en agua desionizada. </li><li> Tampón B: 60% (v / v) CH3CN, 1% (v / v) CH3COOH en agua desionizada. </li></ol> 3. Pipeta Tip y columnas &quot;StageTip &#39; <ol><li> Preparar SAX punta columna apilando 6 capas de membrana Empore-anión en un common 0,2 ml punta de la pipeta. Haga dos columnas SAX-tip por muestra. </li><li> Preparar &#39;StageTip&#39; apilando 3 capas de Empore-C 18 en una punta de pipeta 0,2 ml. Hacer 6 consejos escenario para cada muestra. </li></ol> 4. Preparación de cortes de tejido para microdisección y Muestra de Lisis <ol><li> Cortar secciones con un microtomo (el espesor de las rebanadas depende de la muestra. Por lo general, la microdisección funciona bien con las rebanadas de 7-10 micras). </li><li> Irradiar diapositivas de membrana (MembraneSlide 1.0 PEN) con luz UV durante 45 min. </li><li> Monte las secciones en las diapositivas de membrana irradiar y seca a 37 ° C durante 2 horas. </li><li> Desparafinar las secciones montadas por dos incubaciones sucesivas en xileno durante 2,5 min y 1,5 min. Rehidratan las secciones por las incubaciones consecutivas en etanol absoluto, etanol al 70%, y agua, cada uno durante 1 min. </li><li> Teñir las secciones con hematoxilina de Mayer durante 20 segundos, enjuague con agua durante 1 minuto, y aire seco. </li><li> Recoge los populati celularesen interés de usar el sistema de microdisección de captura por láser. Cuando se utiliza el instrumento PALMA (Zeiss) recoger las muestras en las tapas adhesivas (Adhesivo CAP 200). </li><li> Pipetear una alícuota de la TLB sobre el material microdissected en la tapa. Cerrar el tubo y recoger la suspensión de una breve centrifugación. Lyse el tejido microdissected a 99 ° C en un bloque de calentamiento con agitación (600 rpm) durante 1 h. Utilice 3 l de tampón de 10 nl del tejido microdissected. </li><li> Aclarar el extracto crudo por centrifugación a 16.000 xg a 18 º C durante 10 min. El lisado se puede almacenar congelado a -20 ° C. </li></ol> 5. Procesamiento de Muestras <ol><li> Mezclar hasta 50 l de lisado clarificado con 200 l de UA en las unidades de ultrafiltración (30k forense) y centrifugar a 14.000 x g hasta menos de 10 l de la solución se mantendrán en el filtro. Por lo general, este paso requiere de 10-15 minutos de centrifugación. </li><li> Pipetear 200 l de UA a la unidad de ultrafiltracióny se centrifuga como en 5.1. Vacíe el tubo de recogida. </li><li> Pipetear 50 l de solución de IAA y la mezcla a 600 rpm en un termo-mezclador durante 1 min y se centrifuga como en 5.1. </li><li> Pipetear 100 l de UA a la unidad de ultrafiltración y se centrifuga como en 5.1. Repita este paso dos veces </li><li> Pipetear 100 l de la DB a la unidad de ultrafiltración y centrifugar a 5.1. Repita este paso dos veces. </li><li> Transfiera las unidades de filtración de nuevos tubos de recolección. Pipetear 40 l DB con endoproteinasa Lys-C (proteinasa a la proporción de proteína total de 1:100) y mezclar a 600 rpm en termo-mezclador durante 1 min. Incubar las unidades en una cámara húmeda a 37 ° C durante 18 horas. </li><li> Centrifugar las unidades de filtro a 14.000 xg, como en 5.1. </li><li> Pipetear 160 l de agua desionizada y centrifugar las unidades de filtro como en 5.1. El flujo a través combinado (5,7 y 5,8 pasos) contiene los péptidos liberados por endoproteinasa Lys C </li><li> Transferir la unidad de ultrafiltración a un nuevo tubo de recogida. Añadir 40 lDB con tripsina (relación enzima a proteína de 1:100) y mezclar a 600 rpm en termo-mezclador durante 1 min. Incubar las unidades en una cámara húmeda a 37 ° C durante 4 horas. Repita los pasos 5.7 y 5.8 para recoger los péptidos trípticos. </li></ol> 6. La cuantificación de los péptidos <ol><li> La medición del contenido de péptido en los digestos de proteínas puede llevarse a cabo en tampón diluido debido a que los residuos de triptófano son bien accesibles para el disolvente. </li><li> Pipetear 0,2 ml de ABB en la cubeta de cuarzo y registrar el espectro de emisión de &#39;blanco&#39;. </li><li> Preparar la curva de calibración y empleando 0,1 g pasos añadiendo 1 ml de alícuotas de TSS a la cubeta y mezcla suave con la ABB. </li><li> Limpie la cubeta. </li><li> Vierta la muestra y registrar el espectro (la muestra). </li><li> Calcular la concentración de proteína y péptido Desde 0,1 g de triptófano corresponde a aproximadamente 9 g de proteína (sobre la base de la media 1,1% del contenido de triptófano en mezclas de proteínas obtenidas By lisar las células humanas) el contenido de proteína de la muestra o en el péptido contenido en el producto de digestión es igual a: <img alt="Ecuación 1" fo:content-width="2.787in" fo:src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1.jpg" /> donde F (Estándar1) es la fluorescencia de 0,1 g estándar triptófano. El contenido de péptido permite el cálculo del rendimiento del procedimiento de digestión y proporciona información esencial para la siguiente fraccionamiento péptido y análisis de espectrometría de masas. </li></ol> 7. El fraccionamiento de los Lys-C y trípticos Péptidos <ol><li> Diluir las soluciones de péptidos obtenidos por las digestiones con Lys-C y tripsina con 0,2 ml de Brub pH 11 y pH 5, respectivamente. </li><li> Instale la boquilla-columna SAX en la centrífuga tapa adaptador de tubo. </li><li> Lava y se equilibra la columna de la punta-SAX sucesivamente con 0,1 ml de metanol, 0,1 ml de 1 M de NaOH, y 3 veces con 0,1 ml de Brub, pH 11 para la separación de Lys-C Peptides y con Brub, pH 5 para los péptidos trípticos. El flujo de las soluciones a través de la material de la columna se facilita por centrifugación a 4.000 x g. </li><li> Lava y se equilibra los C 18 - &#39;StageTips&#39; posteriormente con, 0,05 ml de metanol, y luego con 0,05 ml de tampón B y con 0,05 ml de tampón A. Preparar seis C - 18 &#39;StageTips&#39;; 4 para la separación de la Lys- péptidos C y dos para la separación de los péptidos trípticos. </li><li> Ensamble Tip-columna SAX en el C 18 - &#39;StageTip&#39;. Cargue las soluciones de muestra en el saxo Tip-columnas equilibradas y centrifugar las columnas a 5.000 xg durante 3 min. </li><li> Equilibrar las columnas &#39;pipeta de punta &quot;con 0,1 ml de la Brub, pH 11 o pH 5, respectivamente a la Lyc-C y las muestras trípticos. Facilitar el flujo por centrifugación a 5.000 x g. </li><li> Traslado Tip-columna SAX al siguiente C 18 - &#39;StageTip&#39;. </li><li> Continuar de elución de los péptidos con Brub pH 6, 4, y 2 para la muestra Lys C y con BRUB pH 2 para la muestra con péptidos trípticos. Para cada etapa de elución utilizar un C separada 18 - &#39;StageTip&#39;. </li><li> Lávese las C 18 - &#39;StageTips&#39; con 0,05 ml de tampón A. </li><li> Eluir fracciones con 0,05 ml de Tampón B en viales utilizados directamente para la inyección de las muestras en el sistema LC ensambladas con un espectrómetro de masas. </li></ol>

<ol><li>Nagaraj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+proteome+and+transcriptome+mapping+of+a+human+cancer+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 548(2011).</li>
<li>Beck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantitative+proteome+of+a+human+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">The quantitative proteome of a human cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 549(2011).</li>
<li>Wisniewski, J. R., Dus, K., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+workflow+for+analysis+of+archival+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+clinical+samples+to+a+depth+of+10+000+proteins.+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">Proteomic workflow for analysis of archival formalin-fixed and paraffin-embedded clinical samples to a depth of 10 000 proteins. Proteomics.</a> Clin. Appl. 7 (3-4), 225-233 (2013).</li>
<li>Magdeldin, S., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+deciphering+proteomes+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues.</a> Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).</li>
<li>Ostasiewicz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome%2C+phosphoproteome%2C+and+N-glycoproteome+are+quantitatively+preserved+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+and+analyzable+by+high-resolution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 9 (7), 3688-36700 (2010).</li>
<li>Wisniewski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature. 6 (5), 359-362 (2009).</li>
<li>Wisniewski, J. R., Ostasiewicz, P., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+recovery+FASP+applied+to+the+proteomic+analysis+of+microdissected+formalin+fixed+paraffin+embedded+cancer+tissues+retrieves+known+colon+cancer+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+proteome+research%22%5BJournal%5D)">High recovery FASP applied to the proteomic analysis of microdissected formalin fixed paraffin embedded cancer tissues retrieves known colon cancer markers.</a> Journal of proteome research. 10 (7), 3040-3049 (2011).</li>
<li>Wisniewski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+quantitative+remodeling+of+the+proteome+between+normal+colon+tissue+and+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extensive quantitative remodeling of the proteome between normal colon tissue and adenocarcinoma.</a> Mol. Syst. Biol. 8, 611(2012).</li>
<li>Wisniewski, J. R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consecutive+proteolytic+digestion+in+an+enzyme+reactor+increases+depth+of+proteomic+and+phosphoproteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Consecutive proteolytic digestion in an enzyme reactor increases depth of proteomic and phosphoproteomic analysis.</a> Anal. Chem. 84 (6), 2631-2637 (2012).</li>
<li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+FASP+and+StageTip-based+fractionation+allows+in-depth+analysis+of+the+hippocampal+membrane+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Combination of FASP and StageTip-based fractionation allows in-depth analysis of the hippocampal membrane proteome.</a> J. Proteome Res. 8 (12), 5674-5678 (2009).</li>
<li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stop+and+go+extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization%2C+nanoelectrospray%2C+and+LC%2FMS+sample+pretreatment+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal. Chem. 75 (3), 663-670 (2003).</li>
<li>Thompson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+pre-analytical+factors+on+the+proteomic+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">Impact of pre-analytical factors on the proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue.</a> Proteomics Clin. Appl. , (2012).</li>
</ol>

El autor no tiene nada que revelar.

La capacidad para estudiar el material FFPE por la tecnología proteómica a una profundidad comparable con la secuenciación de ácidos nucleicos y técnicas de microarrays abre nuevas perspectivas en el descubrimiento de biomarcadores y blanco de la droga. El protocolo descrito permite la caracterización y la cuantificación de los proteomas de las poblaciones de células microdissected en una escala de 10.000 proteínas. Cuando se utiliza menos del material microdissected un conjuntos de datos más pequeños se pueden generar, pero tal vez en muchos casos también pueden proporcionar los datos clínicos valiosos. Por lo tanto, cualquiera de las muestras pueden ser analizadas directamente después del procedimiento-FASP MED o se pueden separar en fracciones menos. Desde procedimiento FASP es compatible con cualquier tipo de proteasa, otras enzimas o su combinación se pueden utilizar de digestiones de proteínas 6. La calidad del material FFPE parece ser el problema más crítico del análisis. Hemos experimentado que el tejido fijado del mismo origen, pero procedentes de diferentesclínicas tes tenían propiedades diferentes. El uso de tejido de una fuente hemos sido capaces de generar péptidos en altos rendimientos, mientras que el material similar de otra clínica era casi inútil. Es probable que la fijación aplicado y procedimientos de incrustación, así como las condiciones de almacenamiento son los principales factores que afectan a las propiedades del material clínico 12. Por lo tanto, es aconsejable probar las propiedades de algunas muestras antes de iniciar un proyecto más amplio. Muchas publicaciones informaron de la utilización del material de FFPE en el pasado. Sin embargo, el número de proteínas identificadas en estos estudios no superó nunca más de 1.000-2.000 proteínas 4. Teniendo en cuenta el tamaño de los proteomas específicos de células humanas que comprenden más de 10.000 proteínas, tales estudios fueron capaces sólo para proporcionar una imagen muy superficial, casi limitados a muy abundantes proteínas implicadas en funciones de mantenimiento. Nuestro protocolo permite el aislamiento eficiente del material clínico o biológico from conserva tejido y está optimizado para la lisis, el procesamiento de la proteína y péptido fraccionamiento previo. Como consecuencia de nuestra muestra de flujo de trabajo de preparación, cuando se acopla a la espectrometría de masas de alta gama, permite penetraciones en una casi completa proteomas. Notable, esto es posible a los requisitos de cantidad de muestra minutos. La principal ventaja de utilizar los tejidos conservados es su amplia disponibilidad relativa. FFPE muestras archivadas durante muchos años y décadas, y, a veces considerados como inútiles, ahora, gracias a la tecnología proteómica, aparecen como material de gran valor para la investigación clínica. Mientras que muchas enfermedades se pueden estudiar usando fresco o congelado investigación de material de material FFPE parece ser particularmente importante para el estudio de enfermedades raras 12, fueron colección de un conjunto representativo de la muestra tarda generalmente un tiempo largo.

La fijación con paraformaldehído y la incrustación en parafina (FFPE) es el método estándar para la preservación y la investigación patomorfológicas de material tejido clínica. Microscopía del tejido preservado permite la identificación de las enfermedades relacionadas con los cambios morfológicos, y la detección y la puntuación de la aparición de antígenos relacionados con la enfermedad. Puesto que típicamente sólo una pequeña porción de la muestra FFPE se utiliza en estos análisis, grandes cantidades de material clínico permanecen archivados y pueden ser explotados en otros tipos de estudios. Durante la última década la investigación en ciencias de la vida se ha visto reforzada por la potente tecnología proteómica. Esta tecnología permite la identificación y cuantificación de miles de proteínas en mezclas complejas de proteínas. Una característica importante de la tecnología es que se necesitan cantidades sólo minutos de material para análisis a gran escala. Estudios proteómicos recientes han demostrado que las proteínas se pueden estudiar en una escala de un borrador casilete proteomas 1, 2. Este tipo de investigaciones permite amplios conocimientos del sistema en la composición de las células y la identificación de grupos de proteínas que se producen a niveles anómalos en enfermedades. Mientras que estos estudios requieren grandes capacidades de espectrometría de masas, el trabajo reciente ha demostrado que la medida similar de identificación puede lograrse en un solo día de la medición 3. El requisito de la cantidad relativamente baja de la muestra y la amplia disponibilidad de las muestras clínicas conservadas nosotros y otros tentados a desarrollar métodos que permitan la exploración proteómico del material FFPE (para una revisión ver 4). Tomando ventaja de la reversibilidad de la fijación con formalina bajo un tratamiento térmico hemos desarrollado un protocolo que permite la extracción cuantitativa de las proteínas del tejido fijo 5. Hemos demostrado que el procedimiento de fijación conserva no sólo las proteínas, sino también por lo menos algunas modificaciones postraduccionales. Phosphorylation y N-glicosilación se pueden estudiar usando las muestras de FFPE 5, sin embargo un requisito previo para ello es un bien controladas las condiciones de recogida de tejidos, almacenamiento y fijación. A continuación, se ha optimizado el método para una microdisección de captura por láser del tejido fijo y para el reactor basado en proteómica procesamiento de la muestra 6, 7. Un estudio a gran escala sobre el cáncer colorrectal permite el análisis cuantitativo de 7.500 proteínas de microdissected de material clínico 8. Finalmente, se ha mejorado la forma de exploración de material microdissected aplicando consecutivo de dos protocolos de digestión de proteínas paso 9. En comparación con las estrategias de digestión comunes utilizando sola enzima, este procedimiento permite la generación de más péptidos de secuencia única y, en consecuencia, se traduce en una mayor profundidad de la identificación de proteínas. Análisis de microdissected adenoma de colon humano permitió el análisis proteómico a una profundidad de 9.500 proteínas por muestra 3. En esta ganaderíay trazamos 55.000 péptidos por muestra que permitan la identificación de las proteínas 88-89% con un mínimo de 2 péptidos. Aquí presentamos un protocolo optimizado para la preparación de muestras a partir del material FFPE para el análisis LC-MS/MS. Este protocolo comprende la preparación de cortes de tejido para microdisección, la lisis de las células aisladas, y procesamiento de la muestra en un formato de reactor de (FASP) 6. A continuación se describe la determinación de los rendimientos espectrofluorométrico péptidos; una tarea con gran importancia para la identificación óptima péptido mediante la espectrometría de masas. Por último, demostrar un intercambiador aniónico fuerte (SAX)-basada en las técnicas de separación para el fraccionamiento de los péptidos. En este método tanto la separación de péptidos y limpieza final se llevan a cabo usando microcolumnas pipeta de punta 10, 11. Este paso es opcional pero se recomienda en estudios en los que más de unos pocos microgramos de péptidos se pueden obtener a partir de una sola muestra. El SAX-fraccionamiento puede aumentar sustancialmente el número y el rango dinámico de identcaciones y extienden la proteína secuencia de cobertura de 3, 10.

<table><tbody><tr><td>MembraneSlide 1.0 PEN</td><td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Alemania</td><td>415190-9041-000</td><td></td></tr><tr><td>Tapón adhesivo 200 opaco</td><td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Alemania</td><td>415190-9181-000</td><td></td></tr><tr><td>Solución de hematoxilina de Mayer </td><td>Sigma-Aldrich St. Louis, MO</td><td>MHS32</td><td></td></tr><tr><td>Forensic 30k </td><td>Merck Millipore Darmstadt, Alemania</td><td>MRCF0R030</td><td>(Anteriormente vendido como Microcon YM-30) </td></tr><tr><td>Empore Anion Tecnologías</td><td>bioanalíticas 3M Compañía ST. Paul, MN</td><td>2252</td><td></td></tr><tr><td>Empore C18</td><td>Tecnologías bioanalíticas 3M Compañía ST. Paul, MN</td><td>2215</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina </td><td>Promega</td><td>2014-06-27</td><td></td></tr><tr><td>Endoproteinasa Lys-C</td><td>Wako</td><td>129-02541</td><td></td></tr></tbody></table>

proteómica preparación de muestras de formol fija y embebidos en parafina de tejidos

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Material clínico en conserva es una fuente única para la investigación proteómica de trastornos humanos. Aquí se describe un protocolo optimizado que permite a gran escala de análisis cuantitativo de formol fija y embebidos en parafina (FFPE) los tejidos. El procedimiento comprende cuatro etapas distintas. La primera es la preparación de secciones de material FFPE y microdisección de las células de interés. En la segunda etapa las células aisladas se lisan y se procesan utilizando &#39;filtro asistido por preparación de la muestra &quot;técnica (FASP). En este paso, las proteínas se agotan a partir de reactivos utilizados para la lisis de la muestra y se digieren en-dos pasos utilizando endoproteinasa LysC y tripsina. Después de cada digestión, los péptidos se recogen en fracciones separadas, y su contenido se determina mediante una medición de fluorescencia de alta sensibilidad. Finalmente, los péptidos se fraccionaron en microcolumnas &#39;pipeta de punta. Los lysC-péptidos se separan en fracciones de 4 mientras que el pe trípticoptides se separan en 2 fracciones. De esta manera muestras preparadas permiten el análisis de proteomas de cantidades diminutas de material a una profundidad de 10.000 proteínas. Por lo tanto, el flujo de trabajo descrito es una poderosa técnica para el estudio de enfermedades en una de todo el sistema de la moda, así como para la identificación de biomarcadores potenciales y objetivos de medicamentos.

El análisis proteómico de material FFPE requiere métodos robustos y reproducibles para la preparación de muestras. En esta publicación se demuestra un protocolo que permite el aislamiento eficaz de poblaciones de células a partir del material fijo y su procesamiento químico resultante en fracciones de péptidos de alta pureza que se pueden utilizar directamente para el análisis LC-MS/MS. El procedimiento consiste en cuatro partes distintas: (1) preparación de las secciones de las muestras FFPE y su microdisección, (2) la lisis de la muestra y el procesamiento de las proteínas usando enfoque MED FASP, y (3) cuantificación y (4) el fraccionamiento de los péptidos (Figura 1). En el primer paso del procedimiento de las muestras FFPE se seccionaron con un microtomo y se montaron en portaobjetos cubiertos de membrana. Para aumentar la adhesión entre las secciones de tejido y la superficie de la membrana de diapositivas es necesario para irradiar la superficie de deslizamiento con la luz UV. Para ello se utiliza la luz de una lámpara UVintegrada en un banco de cultivo celular. Después de este paso los portaobjetos se sometieron a lavados permitiendo la eliminación de la parafina y la rehidratación de las muestras. El material rehidratado se tiñe con hematoxilina durante un corto tiempo. Esto resulta en una débil tinción de la muestra, pero es suficiente para que la visualización de las áreas de muestras para microdisección. El proceso de tinción tiene que ser parado rápidamente por lavado de los portaobjetos con un exceso de agua. Una tinción prolongada de los resultados de las muestras de los rendimientos de péptidos pobres. En el siguiente paso las secciones secas se someten a microdisección. La selección de las áreas de tejido de células individuales depende del tipo de investigación y siempre requiere un conocimiento específico en la histología o patomorfología. El material láser liberado se recoge en las superficies adhesivas de los tubos de recogida de muestras. Dado que la capacidad de unión del material adhesivo se limita es necesario para transferir el material microdissected de la tapa a la tque el tubo después de la disección de cada 3-5 mm 2 de la muestra. Esto se puede hacer fácilmente mediante pipeteo de unos pocos microlitros de tampón de lisis de tejido (LTB) en la tapa y un corto giro del tubo en una centrífuga. Después de la muestra se recoge en la parte inferior del tubo, la microdisección y la recogida de muestras en la tapa se pueden continuar. Una vez que se recoge la muestra de los tubos tienen que ser, además, un tapón con Parafilm y se incubaron en un baño de agua a aproximadamente 99 ° C con agitación continua durante 1 hora. Dado que durante la incubación de agua se condensa en la tapa, cada 15 min los tubos tienen que ser poco centrifuga de nuevo para recoger el agua en el cono del tubo. Para obtener péptidos los lisados ​​tisulares se procesan utilizando el enfoque FASP MED. En este método, las proteínas lisadas se agotan desde el detergente y otras sustancias de bajo peso molecular, carboamidomethylated en los residuos cisteinil, y luego digeridos consecutivamente con dos enzimas DIFFering en sus especificidades de escisión: endoproteinasa LysC y tripsina. Después de cada etapa de digestión de los péptidos se recogen en fracciones separadas. En esta parte de la preparación de la muestra es importante para seguir cada una de las etapas de centrifugación hasta más de 95% de la solución inicialmente cargado en la unidad de filtración pasado la membrana. El análisis de tejido colónico y su cáncer se observó que este procedimiento produce 3-6 mg de péptido por 100 nl (tejido 100 g o 10 mm 2 de una sección de 10 micras) del material microdissected (Tabla 1). Desde la proteína total extraíble a partir de tejidos es de aproximadamente 10% del peso del tejido los procedimientos de extracción y de digestión juntos dan como resultado un rendimiento de 30-60% en la relación con el tejido fresco original de. Estos valores reflejan la pérdida de la proteína durante la deshidratación y la tinción, microdisección, y la retención de la porción de la muestra sin digerir en las unidades de ultrafiltración. Debido a que la extracción y el procesamiento de ningúntejido FFPE N-microdissected resultó en un rendimiento de 75% 5 es probable que las pérdidas de muestra críticos se producen durante los pasos antes de MED-FASP-proteína-péptido-a la conversión. Una característica importante de las mezclas de péptidos obtenidos por este procedimiento es su alta pureza que facilita aún más el proceso de fraccionamiento péptido fraccionamiento y la identificación de espectrometría de masas. Esto ha sido demostrado recientemente por un análisis de muestras de adenoma colorrectal 3. En ese estudio sobre 40% de los eventos de MS / MS condujo a la identificación de péptidos a partir de tejido FFPE y resultó en la cartografía de hasta 17.000 péptidos por sola ejecución LC-MS/MS. Las tasas más altas de identificación sólo se han logrado en el análisis de las células congeladas in vitro en cultivo 3. En las dos últimas partes de todo el procedimiento de los péptidos aislados se cuantifican y se fraccionó en microcolumnas pipeta de punta. Dado que las cantidades de péptido aislado del tejido microdissected son serbajo 10 mg que no pueden ser cuantificados mediante ensayos de proteínas basadas en colorantes de uso común. También los A 280 mediciones UV espectral en estas concentraciones no son útiles debido al efecto de dispersión de la luz. En contraste, las mediciones de fluorescencia de los residuos de triptófano ofrecen una forma fiable para la determinación del contenido de péptido. Recientemente hemos demostrado que hasta 5000 las proteínas de las células cultivadas se pueden identificar en una &quot;single shot&quot; 4 análisis LC-MS/MS hr 7. Sin embargo, este tipo de análisis aplicado a los tejidos nativos rara vez permite la identificación de más de 3.000 mil proteínas. Para aumentar la profundidad del análisis de los péptidos generados en MED FASP tienen que ser pre-fraccionada antes de LC-MS/MS. La separación de micro-columna SAX basado es un método de fraccionamiento simple y eficiente 10. Ya se ha aplicado en varios estudios proteómicos incluidos los análisis de tejido fijo 5, 8, 9. El SAX-microcolu &#39;pipeta de punta&#39;mns, y el C 18 - columnas de desalado &#39;StageTip&#39; 9 son fáciles de preparar. Las columnas son ensamblados por el apilamiento de los tapones, cortados por el SAX o C 18 membranas, en una punta de pipeta de 11 l 200. Los ejemplos de los análisis de las muestras FFPE SAX-fraccionadas se muestran en la Tabla 1. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50589/50589fig1.jpg" /> Figura 1. Descripción general del procedimiento. El procedimiento consiste en cuatro partes distintas: (1) preparación de las secciones de las muestras FFPE y su microdisección, (2) la lisis de la muestra y el procesamiento de las proteínas usando enfoque MED FASP, y (3) cuantificación y (4) el fraccionamiento de los péptidos. <table border="1" class="jove_content_small" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.4in"> Muestra </td><td fo:width="1in"> Muestra de pre-fraccionamiento / digestión </strong&gt; </td><td fo:width="1in"> Espectrómetro de masas utilizado </td><td fo:width="1.25in"> Ng rendimiento de péptido / muestra nL (± SD) </td><td fo:width="1.25in"> Las identificaciones de proteínas únicos al sola muestra </td><td fo:width=".75in"> Referencia </td></tr><tr><td> • Adenonocarcinoma • mucosa colónica normal </td><td> SAX / una enzima </td><td> Orbitrap-Velos </td><td> 36 ± 11 (n = 8) 30 ± 8 (n = 8) </td><td> 5985 ± 54 5868 ± 110 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> • Adenoma del colon </td><td> SAX / dos enzimas </td><td> Q Exactive </td><td> 56 ± 6,1 (n = 3) </td><td> 9501 ± 28 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Resultados representativos de los análisis proteómicos del tejido microdissected FFPE.

Archivo formol fija y embebidos en parafina (FFPE) muestras clínicas son un material valioso para la investigación de enfermedades. Aquí se demuestra un flujo de trabajo de preparación de muestras permite el análisis en profundidad proteómico de tejidos FFPE microdissected.

Proteómica Preparación de muestras de formol fija y embebidos en parafina de tejidos

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

El objetivo general de este procedimiento es generar y prefraccionar péptidos a partir de material fijado con formalina e incluido en parafina, o material FFPE, para su análisis proteómico. Esto se logra mediante el aislamiento del tejido deseado por microdisección, seguido de la lisis celular. El segundo paso consiste en generar péptidos mediante el procesamiento de la muestra.Utilizando la preparación de muestras asistida por filtro con digestión múltiple de enzimas. Luego, los péptidos se cuantifican midiendo su fluorescencia de triptófano. El paso final es la fraccionamiento de los péptidos mediante una técnica de separación basada en intercambiador aniónico fuerte para la fraccionamiento de péptidos.En última instancia, las muestras preparadas permiten el análisis de proteomas a partir de cantidades mínimas de material hasta una profundidad de 10.000 proteínas. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la digestión en gel o en solución, es que es aplicable a cantidades mínimas de muestras clínicas, tales como células obtenidas por microdisección láser. El método proporciona muestras que contienen péptidos perfectos y puros.¿Qué facilita la exploración proteómica de tejidos y enfermedades humanas? Todo el protocolo consiste en técnicas desarrolladas y publicadas anteriormente. Estas incluyen fasp de alta recuperación, atión en punta de pipeta y la determinación del contenido de péptidos basada en la fluorescencia de triptófano, lo que demuestra que el procedimiento será señora.Catina es una técnica de nuestro laboratorio para comenzar a preparar cortes de tejido para microdisección, cortando secciones con un microtomo. El grosor de los cortes depende de la muestra. Por lo general, la microdisección funciona bien con cortes de siete a 10 micrómetros.Después de irradiar las láminas de membrana con luz UV durante 45 minutos, monte las secciones sobre ellas antes de secarlas a 37 grados Celsius durante dos horas. Desparafine las secciones montadas mediante dos incubaciones sucesivas en frascos consecutivos de xileno durante dos minutos y medio y un minuto y medio. Luego rehidrate las secciones de forma consecutiva.Incubaciones de un minuto en etanol absoluto, etanol al 70 % y, finalmente, agua. Después de teñir los cortes con hematoxilina de Meyer durante 20 segundos.Lave con agua durante un minuto y deje secar al aire. Recopile la población celular de interés utilizando un sistema de microdisección con láser. Al usar el instrumento palm, recoja las muestras en las tapas adhesivas usando tres microlitros de tampón de lisis tisular por 10 nanolitros del tejido microdiseccionado.Aplique el tampón al material microdiseccionado en la tapa y cierre el tubo. Recopile la suspensión tras una breve centrifugación. Luego, incube el tejido microdiseccionado a 99 grados Celsius en un bloque calefactor con agitación durante una hora.Clarifique el extracto crudo mediante centrifugación a 16.000 Gs y 18 grados Celsius durante 10 minutos. Mezcle hasta 50 microlitros del lisado clarificado con 200 microlitros de la solución UA en una unidad de ultrafiltración. Luego, centrifugue a 14.000 Gs hasta que queden menos de 10 microlitros de la solución en el filtro.Normalmente, este paso requiere de 10 a 15 minutos de centrifugación. A continuación, pipetee 200 microlitros de la solución UA hacia la unidad de ultrafiltración y centrifugue. Como antes, vacíe el tubo recolector antes de pipetear 50 microlitros de la solución IAA hacia la unidad de ultrafiltración.Mezcle a 600 RPM en un mezclador térmico a temperatura ambiente durante un minuto y centrifugue. Como antes, continúe con los pasos de ultrafiltración y centrifugación según se describe en el protocolo escrito que acompaña a este video. Luego, transfiera las unidades de filtración a nuevos tubos colectores.Pipetee 40 microlitros de tampón de digestión con endoproteinasa Lys C antes de mezclar a 600 RPM en el mezclador térmico durante un minuto. Incube las unidades en una cámara húmeda a 37 grados Celsius durante 18 horas. Después de centrifugar las unidades de filtro como se hizo previamente, pipetee 160 microlitros del tampón DB y centrifugue.Las unidades de filtro por las que pasa el flujo agrupado contienen los péptidos liberados por la endoproteasa lic C. A continuación, recolecte los péptidos trípticos según se describe en el protocolo del texto. La medición del contenido de péptidos en los digestos proteicos puede realizarse en tampón diluido porque los residuos de triptófano están bien accesibles para el disolvente. Para cuantificar los péptidos, primero pipetee 0,2 mililitros de tampón de ensayo DB en la cubeta de cuarzo Q.Luego coloque el Q vet en el portamuestras del instrumento qve y registre el espectro de emisión del blanco. Prepare una curva de calibración utilizando pasos de 0,1 microgramos mediante la adición de alícuotas de un microlitro de la solución patrón de triptófano al Q vet y mezclando suavemente con el tampón db. Después de limpiar el Q vet, aspire la muestra y registre el espectro de la muestra.Proceda a calcular la concentración de proteína y péptido según se describe en el protocolo escrito antes de la fraccionamiento. Prepare la columna con punta SAX apilando seis capas de membrana de iones EM.Import en una punta de pipeta común de 0,2 mililitros. Elabore dos columnas con punta SAX por muestra.A continuación, prepare la punta escalonada apilando tres capas de M cuatro C 18. En una punta de pipeta de 0,2 mililitros, prepare seis puntas escalonadas para cada muestra. Para comenzar.La fraccionamiento diluye las soluciones de péptidos obtenidas mediante digestiones con ly C con 0,2 mililitros de tampón universal BRI y Robinson. pH 11, de manera similar, diluya las soluciones de péptidos obtenidas mediante digestiones con tripsina con 0,2 mililitros de tampón universal BRI y Robinson. pH cinco, arme la columna tipo punta SAX en la tapa del adaptador para tubo centrífugo antes de lavar y equilibrar la columna tipo punta SAX y las puntas tipo C 18 según se describe en el protocolo del texto.A continuación, ensamblar la columna de punta SAX en la punta de etapa C18. Cargar las soluciones de muestra en las columnas de punta SAX equilibradas y centrifugar las columnas a 5.000 G durante tres minutos. Lavar las columnas de punta de pipeta con 0,1 mililitros de las muestras diluidas.Facilite el flujo mediante centrifugación a 5 000 G. Transfiera la columna en punta SAX a la siguiente punta escalonada C18 y continúe eluyendo los péptidos según se describe en el protocolo escrito. Después de lavar las puntas escalonadas C18 con 0,05 mililitros de tampón A, eluya las fracciones con 0,05 mililitros de tampón B hacia viales, que posteriormente se utilizarán para la inyección de las muestras en un sistema de cromatografía líquida acoplado a un espectrómetro de masas representativo. Aquí se muestran los resultados de la extracción y digestión de proteínas.La lisis de 250 nanolitros de tejido, lo que corresponde a un área microdiseccionada de 25 milímetros cuadrados de un corte de 10 micrómetros, produce aproximadamente 45 microgramos de proteína total tras la digestión consecutiva en dos pasos en el formato rápido con la endoproteasa Slice C y tripsina, lo que da rendimientos superiores al 50 % de la proteína total. Aquí se muestra una medición representativa de contenido peptídico mediante fluorescencia; los espectros del estándar de triptófano y de la muestra muestran máximos entre 350 y 360 nanómetros. La intensidad de la fluorescencia es proporcional al contenido de triptófano.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar muestras de tejido para análisis proteómico utilizando la técnica de microdisección, el procesamiento de muestras y la fraccionamiento peptídico. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres a cuatro horas, más el tiempo necesario para la indigestión proteica. Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar cortes de tejido recién preparados tras su obtención. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la proteómica exploraran los proteomas de tejidos y células, así como las anomalías en humanos, mediante el uso de material fijado y embebido en parafina.

proteomic-sample-preparation-from-formalin-fixed-paraffin-embedded

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra el protocolo para la extracción de ADN de fijado en formol e incluido en parafina de material. Este es un procedimiento de varios días en los que las secciones de tejido se deparaffinized con xileno, rehidratada con etanol y se tratan con proteinasa K para purificar y aislar el ADN para su posterior análisis de genes específicos o en todo el genoma.

Extracción de ADN a partir de material incluido en parafina para análisis genéticos y epigenéticos

El siguiente video describe cómo preservar la morfología de un tejido con fijación de formol e inclusión de parafina.

Preservación de tejidos embebidos en parafina fijada en formol (FFPE): un método para estudiar la morfología de los tejidos

Este protocolo modificado de extracción mejora de ARN y ADN rendimientos de las regiones seleccionadas, más precisamente de interés en los bloques de tejido histopatológicos.

Preparación de núcleos de tejido incluidas en parafina fijadas con formalina para ambos RNA y DNA Extraction

Este protocolo describe un método simple de corte de tejido de corte híbrido que es útil para tejidos vegetales recalcitrantes. Las secciones de tejido de buena calidad permiten realizar estudios anatómicos y otros estudios biológicos, incluida la hibridación in situ (ISH).

Híbrido-Cut: un método de seccionamiento mejorada para muestras de tejido de la planta recalcitrante

Hibridación in situ de la fluorescencia (pescado) se requiere a menudo en combinación con la histopatología y el diagnóstico molecular para la selección del tratamiento en la medicina personalizada. Fijador de tejido no enlazan a la Cruz, libre de formol novedoso que permite alta calidad morfológica, molecular y análisis de peces de la misma muestra por adición de un paso de la fijación antes de pescado se presenta.

Protocolo para HER2 de los pescados usando un fijador de tejido no enlazan a la Cruz, libre de formol para combinar las ventajas de la criopreservación y la fijación de formalina

Este protocolo describe un método reproducible y confiable para la preparación a base de la sublimación de formalina fijada destinado para el spectrometry total de la proyección de imagen del tejido.

Óptima preparación de formol fijada muestras para péptidos basados en matriz asistida por láser de desorción/ionización espectrometría de masas de flujos de trabajo

Este protocolo proporciona un resumen de los procedimientos para el aislamiento de ARN para los perfiles transcriptómicos de nodo de linfa tejidos de animales grandes, incluyendo pasos en la identificación y extirpación de los ganglios linfáticos de ganado y la fauna, métodos de muestreo para proporcionar consistencia en varios animales y consideraciones más resultados representativos para la conservación de la colección y procesamiento de análisis de ARN.

Recogida y tratamiento de los ganglios linfáticos de animales grandes para el análisis de ARN: preparación para estudios de nodo de linfa transcriptómicos de grandes especies animales

En la era de la inmunoterapia contra el cáncer, el interés en dilucidar la dinámica del microambiente tumoral ha aumentado sorprendentemente. Este protocolo detalla una técnica de imagen de espectrometría de masas con respecto a sus pasos de tinción e imagen, que permiten un análisis espacial altamente multiplexado.

Ampliación de la comprensión del microambiente tumoral mediante imágenes de espectrometría de masas de muestras de tejido fijadas en formalina e incrustadas en parafina

Aquí, establecemos un método proteómico basado en espectrometría de masas utilizando regiones aisladas de interés en secciones de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina. Este protocolo se utiliza para analizar el proteoma de áreas específicas de tejido en secciones de tejido archivadas fijadas en formol e incluidas en parafina.

Un enfoque simplificado para la proteómica basada en espectrometría de masas utilizando regiones de tejido seleccionadas

Este video demuestra la preparación de un diseño ultra-delgado de matriz / analito capa para el análisis de péptidos y proteínas por láser asistida por matriz de desorción ionización espectrometría de masas (MALDI-MS).

MALDI preparación de la muestra: el método de ultra capa fina

Aprende a preparar muestras de tejido FFPE para análisis proteómico mediante microdisección láser, digestión enzimática y fraccionamiento SAX. Este protocolo permite identificar hasta 10,000 proteínas a partir de cantidades mínimas de material clínico.

Proteómica Preparación de muestras de formol fija y embebidos en parafina de tejidos

Explorar más videos