Name: El trasplante de células ensheathing olfativo para evaluar la recuperación funcional después de la lesión del nervio periférico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-23T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Aprende el trasplante de células ensheathing olfativo para evaluar la recuperación funcional tras lesión del nervio laríngeo recurrente en modelo animal. Este método permite estudiar la regeneración axonal y la restauración de la función vocal mediante laringoscopia, electromiografía e histología.

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Los autores desean agradecer ADIR (Aide à domicile aux Insuffisants respiratoires) y Fondation de l&#39;Avenir, por su apoyo financiero y el Dr. Fanie Barnabé-Heider para la edición del manuscrito.

1. Los cultivos primarios de la mucosa olfativa y olfativa Bulbos <ol><li> Antes de la disección <ol><li> Hacer medio, para 50 ml, mediante la adición de 44 ml de libre de calcio de Eagle modificado por Dulbecco / medio de Ham F12 (DMEM/F12), suplementado con 5 ml de suero fetal bovino (FBS) y 1 ml de penicilina / estreptomicina. </li><li> Escudo 75 cm 2 frascos con poli-L-lisina (50 g / ml, 1,5 mg / cm 2), 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague frascos con PBS 1x. </li><li> Guarde los frascos revestidos en el refrigerador hasta por 1 semana. </li></ol></li><li> Disección <ol><li> Cualquier método de eutanasia debe ser aprobado previamente por el cuidado de los animales y el uso comité de la institución y llevado a cabo por personal cualificado. </li><li> Elija puras ratas como ratas Fischer. </li><li> Después de la rata se ha confirmado que han entrado en anestesia profunda con pentobarbital de sodio o de otras formas inyectables de anestesia, tales como ketamina / xilazina, él y R decapitarquítelo de la piel. </li><li> Abra el cráneo desde la parte anterior a la parte posterior. </li><li> Retire la toma OB cuidado para evitar las meninges. </li><li> En la misma rata, abra la sagittaly cavidad nasal. </li><li> Eliminar la OM teniendo cuidado de evitar la mucosa respiratoria. Tenga en cuenta que el epitelio OM se puede identificar fácilmente por su color amarillento. </li><li> Protocolos más detallados sobre la disección de OM se pueden encontrar en una anterior <a href="https://www.jove.com/video/2762/isolating-nasal-olfactory-stem-cells-from-rodents-or-humans">J. Vis. Exp</a> . publicación 13. </li></ol></li><li> Cultura <ol><li> Coloque OB en solución de Hank tamponada de sal (HBSS) que contiene 0,1% de tripsina durante 45 min a 37 ° C. </li><li> Coloque OM en HBSS que contiene 0,05% de colagenasa A durante 45 min a 37 ° C. </li><li> Detener la digestión enzimática mediante la adición de 2 ml de medio caliente. </li><li> Lavar las células con medio y centrifúguelas a 300 xg durante 3 min. </li><li> Se tritura muestras de 2ml de medio con una pipeta P1000 hasta que se obtuvo una suspensión celular homogénea. </li><li> Placa de las células en los frascos previamente recubiertos (5-10 x 10 6 células / frasco) con 25 ml de medio caliente. </li><li> Incubar y cultivar las células a 37 ° C con 5% de CO 2. </li><li> Cambiar la mitad del medio cada 2 días. </li><li> Después de 6-8 días in vitro, comprobar la proporción de células p75 positivas en muestras de células pequeñas, se supone que es la OECO en roedores, por citometría de flujo o por inmunocitoquímica. Para estos análisis, otros marcadores se pueden estudiar tales como GFAP y S100β. </li></ol></li><li> El análisis de citometría de flujo <ol><li> Recoger las células como se describe en &quot;El trasplante celular&quot; (sección 2.2). </li><li> Incubar con p75 anticuerpo primario (1:100) durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Lavar las células con 2 ml de PBS-EDTA y centrifúguelas a 300 xg durante 3 min. </li><li> Se incuban las células con PE anti-ratón anticuerpo secundario conjugado durante 15min a 4 ° C en la oscuridad (1:200). </li><li> Lavar las células con 2 ml de PBS-EDTA y centrifúguelas a 300 xg durante 3 min. </li><li> Resuspender las células en 500 l de PBS-EDTA. </li><li> Analizar 10-30 x 10 3 células con citómetro de flujo. </li></ol></li><li> Análisis de inmunocitoquímica <ol><li> Placa de las células en placas de 6 pocillos recubiertos previamente durante 48 horas como se describe en la &quot;cultura&quot; (apartado 1.1.2). </li><li> Lavar las células con PBS. </li><li> Fijar las células con PFA al 4% durante 15 min a TA. </li><li> Lavar las células con PBS. </li><li> Se incuban las células con PBS / Triton X100 (0.1%) durante 15 min a TA. </li><li> Lavar las células con PBS. </li><li> Se incuban las células con anticuerpos primarios (1:200): p75, S100β y GFAP durante la noche a 4 ° C. </li><li> Lavar las células con PBS. </li><li> Se incuban las células con los anticuerpos secundarios (1:500) durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Lavar las células con PBS. </li><li> Se incuban las células con Hoechst 10 min a RT en la oscuridad. </li><li> Lavar las células con PBS. </li><li> Analizar las células usando un microscopio de fluorescencia. </li></ol></li><li> Células de etiquetado GFP <ol><li> Cinco días antes del trasplante, infectar cultivos de obstetricia y OM durante la noche con vector lentiviral albergar GFP mejorado (multiplicidad de infección: 20). </li><li> Ante la comprobación del trasplante en muestras pequeñas, la tasa de células GFP positivas por citometría de flujo como se describe anteriormente en la &quot;cultura&quot; (sección 1.1). </li></ol></li></ol> 2. Cirugía y Trasplante <ol><li> Anastomosis del nervio recurrente <ol><li> Todos los experimentos con animales deben ser aprobados previamente por el cuidado de los animales y el uso comité de la institución y llevados a cabo por personal cualificado. </li><li> Antes de la cirugía autoclave todos los instrumentos y mantener la esterilidad durante los procedimientos quirúrgicos. </li><li> Anestesie rata mediante inyección intraperitoneal de clorhidrato de ketamina (12,5 mg / kg) y clorhidrato de clorpromazina (0,625 mg / kg). Evaluar la adecuación de la anestesia por el pellizco del dedo del pie antes de la cirugía. </li><li> Coloque la rata en decúbito dorsal. </li><li> Realizar una incisión media vertical de 2 cm de cuello uterino cutánea con un escalpelo. </li><li> Realice una incisión vertical de los músculos infrahioideos siguiendo la línea blanca medial. </li><li> La exposicion laringe utilizando retractor autoestática entre los músculos infrahioideos. </li><li> Exponer la NLR. </li><li> Bajo control microscópico, cortar el nervio plenamente con micro tijeras a nivel del séptimo anillo traqueal. </li><li> Realice anastomosis utilizando un punto de sutura 11.0 bajo control microscópico. Esta cirugía produce una denervación motora específica de la laringe. </li></ol></li><li> Trasplante celular <ol><li> Justo antes del trasplante, eliminar las células de los platos usando 0,05% de EDTA tripsina durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Detener la digestión enzimática mediante la adición de 2 ml de medio caliente. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 3 min. </li><li&gt; Bajo un microscopio contar las células usando un hemocitómetro y ajustar la concentración celular de acuerdo a protocolo específico. En este modelo, las concentraciones deseadas fueron entre 1,2 a 6 x 10 6 células en 30 l de DMEM/F12. </li><li> Haga de la preparación celular con 1:02 de mezcla (30 y 60 l en este experimento) de DMEM/F12-Matrige l en un tubo de 1,5 ml antes del injerto y colóquelo sobre hielo. Para evitar los efectos no específicos, utilice el factor de crecimiento reducido Matrigel. </li><li> Justo antes del trasplante mantener el tubo en la mano durante unos segundos para calentar la mezcla de Matrigel mediano. </li><li> Deponer a la mezcla en el lugar de la anastomosis con una pipeta y espere hasta que la mezcla se auto-ensambla en el nervio lesionado. </li><li> Cierre los músculos y la piel con una sutura 4.0. </li><li> Casa de las ratas individualmente y mantener bajo una lámpara de calor durante 24 horas. </li></ol></li></ol> 3. Evaluación <ol><li> La laringoscopia <ol><li> Anestesie ratas por intraperitinyección oneal de clorhidrato de ketamina (12,5 mg / kg) y clorhidrato de clorpromazina (0,625 mg / kg). Confirmar ratas se anestesian con una pizca dedo del pie antes de proceder con el protocolo. </li><li> Coloque la rata en decúbito dorsal. </li><li> Inserte un 30 ° videolaryngoscope ajustadas para proporcionar la mejor vista de la laringe. Determinar puntos de referencia anatómicos para reproducir el mismo punto de vista para cada grabación. </li><li> Registre los movimientos de las cuerdas vocales con el videolaryngoscope (5-10 secuencias / animal). Para cada animal seleccionar tres secuencias sucesivas de aducción y abducción máxima máxima. </li><li> Analizar la función laríngea el uso de software de análisis de imágenes. Determinar movimiento angular absoluta mediante la medición de la diferencia entre el movimiento de abducción y aducción máxima máxima de las cuerdas vocales. Determine la puntuación dinámico midiendo la amplitud de movimiento. Determine la puntuación funcional midiendo la synkinesis y movimientos paradójicos. </li></ol></li><li> La electromiografía (EMG) <ol><li&gt; Coloque un electrodo en los músculos isquiotibiales de la rata para el aislamiento eléctrico. </li><li> La exposicion laringe y tráquea mediante la apertura de la piel y los músculos, como se describe anteriormente en &quot;anastomosis del nervio recurrente&quot; (sección 2.1). </li><li> Exponer el cartílago cricotiroidea. </li><li> Abra el cartílago cricotiroidea para exponer la cricoaritenoide posterior (ACP) músculo con micro tijeras. </li><li> Introducir un electrodo de aguja monopolar (38 x 0,45 mm) en el músculo PCA. </li><li> Registrar la actividad eléctrica muscular del músculo PCA utilizando un sistema de adquisición durante la ventilación espontánea. </li><li> Analizar la actividad muscular en términos de riqueza y la sincronización con la respiración. Analizar EMG, asignar una puntuación cualitativa 0-3 utilizando la siguiente escala: 0: el rastreo sin rima, sin aumento durante la inspiración, 1: rimada trazando con inspiración en aumento, pero pobre rastreo (Neurogen), 2: rimada trazando con la actividad más rico, 3: rimada localización, muy rica, lo que constituye un ipatrón nterferenc, similar a una actividad intencional máxima. </li><li> Exponer el nervio vago para medir la duración de latencia y potencial. El nervio vago es elegido como el sitio de estimulación del NLR porque puede dañarse durante la estimulación debido a su pequeño tamaño. </li><li> Estimular el nervio vago con un electrodo. </li><li> Registre las señales eléctricas en el músculo PCA. Medir la latencia y la duración del potencial. Si es posible utilizar un módulo de adquisición para registrar la actividad muscular, la latencia y la duración del potencial como sistema Powerlab. </li></ol></li><li> Histología <ol><li> La eutanasia a los animales usando sobredosis de pentobarbital. </li><li> Retire el muñón distal del NLR bajo control microscópico. La parte distal del NLR se define como la parte entre la anastomosis y la laringe. Tenga en cuenta que es posible encontrar el sitio de la anastomosis varias semanas después de la cirugía debido a que el 11,0 sutura es una sutura absorbible. </li><li> Coloque la porción distal del NLR en 2% de glutaraldehído con 0,1 M de fosfato(PH = 7,3) durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Orientar cuidadosamente las muestras para realizar cortes coronales. </li><li> Lavar las muestras en tampón de fosfato. </li><li> Cortar en segmentos más pequeños (3-4 mm de longitud) y posfijo durante 60 min a temperatura ambiente en 1% de cacodilato tamponadas OsO4 y deshidratados con etanol. </li><li> Muestras Orient en moldes de silicona y embebido en resinas que consisten en Polybed 812, DDSA y MNA, al que se añadió 2% de acelerador de la BDMA. </li><li> Hacer cortes transversales semi-delgadas (-1μm de espesor) utilizando un Sistema Ultramicrotomía Pyramitome. </li><li> Teñir con 0,1% de azul de toluidina en tetraborato de sodio al 1% durante 75 segundos a 70 ° C. </li><li> Analizar las muestras del NLR con un sistema de análisis de conteo. Contar el número de fibras y medir perfiles de fibras nerviosas mielinizadas mediante la determinación del límite exterior e interior de la vaina de mielina. </li></ol></li><li> Trasplante <ol><li> Preparar las células para el trasplante y trasplantar las células descritas anteriormenteen &quot;el trasplante celular&quot; (sección 2.2). </li><li> Análisis </li><li> La eutanasia a los animales usando sobredosis de pentobarbital. Tenga en cuenta que la fijación de los animales se puede realizar utilizando la inyección intracardíaca de PFA 4%. </li><li> Retire alrededor de 2 cm de NLR. Utilice partes proximales y distales del NLR. </li><li> Fijar la muestra del NLR en nitrógeno líquido. </li><li> Almacene las muestras a -80 ° C. </li><li> Las muestras cortadas longitudinalmente mediante criostato (10-20 m de espesor). </li><li> Analizar las muestras bajo el microscopio fluorescente para detectar células GFP positivas. Tenga en cuenta que el anticuerpo anti-GFP se puede utilizar para aumentar la emisión de fluorescencia y para llevar a cabo costainings. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Barraud, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+origin+of+olfactory+ensheathing+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neural crest origin of olfactory ensheathing glia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21040-21045 (2010).</li>
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<li>Paviot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+laryngeal+motor+nerve+repair+is+greater+with+bulbar+than+with+mucosal+olfactory+ensheathing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Efficiency of laryngeal motor nerve repair is greater with bulbar than with mucosal olfactory ensheathing cells.</a> Neurobiol. Dis. 41, 688-694 (2011).</li>
<li>Girard, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+nasal+olfactory+stem+cells+from+rodents+or+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Nash, H. H., Borke, R. C., Anders, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+of+purification+for+establishing+primary+cultures+of+ensheathing+cells+from+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb.</a> Glia. 34, 81-87 (2001).</li>
<li>Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin+3+promotes+purification+and+proliferation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+human+nose%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose.</a> Glia. 45, 111-123 (2004).</li>
<li>Paviot, A., Bon-Mardion, N., Duclos, C., Marie, J. P., Guerout, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Although+olfactory+ensheathing+cells+have+remarkable+potential+to+sustain+nerve+regeneration%2C+they+cannot+be+applied+to+a+severe+vagus+nerve+section%2Fresection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Although olfactory ensheathing cells have remarkable potential to sustain nerve regeneration, they cannot be applied to a severe vagus nerve section/resection model.</a> Muscle Nerve. 43, 919-920 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las técnicas presentadas aquí hacen OECs un modelo útil para estudiar los trasplantes celulares en modelos de lesión del nervio periférico. El protocolo de cultivo de células es relativamente sencillo y se puede llevar a cabo fácilmente. Por otro lado, los procedimientos quirúrgicos, en particular la sección / anastomosis del NLR, requieren experiencia y deben ser realizadas por personal cualificado. Los procedimientos descritos en este protocolo destacan factores importantes para centrarse ...

El sistema olfativo principal se compone de dos partes distintas; la mucosa olfativa (OM) en el sistema nervioso periférico y el bulbo olfatorio (OB) en el sistema nervioso central. El sistema olfativo principal se caracteriza por la capacidad de las neuronas olfativas primarios (PON) de auto-renovación durante toda la vida en las especies de mamíferos. Esta capacidad se hace posible debido a la presencia de células madre neurales en la OM. PON crecimiento y la regeneración de la OM de OB se ve facilitada por las células gliales especializadas llamadas células olfativas ensheathing (OECO). OECs son las células de la cresta neural, que crean un microambiente favorable para la neurogénesis del PON de OM a OB 1. De este modo, OECs se puede encontrar en OM y en el OB constituyendo diferentes subpoblaciones de células 2,3. Las diferentes propiedades de la OECO han principales científicos de utilizarlos para trasplantes celulares en varios paradigmas de lesiones del sistema nervioso 4. De hecho, los factores de crecimiento de productos OECs, reducen la cicatrización glial, prregeneración axonal Omote, y puede mezclarse libremente con astrocitos 5,6. Sin embargo, la gran mayoría de estos estudios se basan en la lesión de la médula espinal (SCI); pocos de ellos han utilizado OECs después de la lesión del nervio periférico (PNI) 7,8. Aunque el sistema nervioso periférico tiene una gran capacidad de regenerarse después de una lesión nerviosa, secciones completas inducir la regeneración axonal aberrante. De hecho, después de transección completa de la cara o de los nervios laríngeos recurrentes (NLR) de los axones mal enrutadas causan cocontractions musculares llamados synkinesis. Por lo tanto, es de importancia primaria a proponer un modelo de PNI no sólo para cuantificar la regeneración axonal, pero también para evaluar la eficacia de las contracciones musculares. En la literatura el modelo más común descrito se basa en 9,10 lesión del nervio facial. En este modelo, las evaluaciones funcionales se basan en la recuperación de los movimientos de la barba 10. Sin embargo, es complicado de demostrar la eficiencia de la movmentos y discriminar los cocontractions fenómenos musculares. Proponemos aquí un modelo basado en una lesión del NLR. Este modelo permite la evaluación no sólo de regeneración axonal y los movimientos de las cuerdas vocales, sino también la eficiencia y la funcionalidad de estos movimientos después de los trasplantes celulares 11,12. Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso a la cultura y el trasplante OECs de OM y OB en un modelo de la sección del NLR / anastomosis y evaluar los animales después de la cirugía.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>E3521T</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>E3387M</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>1152-8876</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>M3467Y</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>M3513P</td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato</td><td>Merck</td><td>1.03256.0100</td><td></td></tr><tr><td>DDSA</td><td>Biovalley</td><td>00563-450</td><td></td></tr><tr><td>MNA</td><td>Biovalley</td><td>00886-450</td><td></td></tr><tr><td>BDMA</td><td>Biovalley</td><td>00141-100</td><td></td></tr><tr><td>Polybed 812</td><td>Biovalley</td><td>08791-500</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-ratón&nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>550589</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel GFR</td><td>BD Bioscience</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa A</td><td>Roche</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>Ratón anti P75</td><td>Chemicon</td><td>MAB 365</td><td></td></tr><tr><td>11.0 Alambre</td><td>Ethicon</td><td>FG 2881</td><td></td></tr><tr><td>Azul de Toluidina&nbsp;</td><td>Ral Diagnostics</td><td>361590-0025</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Sigma</td><td>Sigma 2-16PK</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Campana de flujo laminar</td><td>Faster</td><td>BH-EN 2003 S</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo</td><td>BD Bioscience</td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Videolaringoscopio</td><td>Karl Storz Endoskope</td><td>Telecam SL NLSC Sistema de</td> adquisición 20212120 <td></td></tr><tr><td></td><td>AD Instruments</td><td>Sistema</td><td></td> Powerlab</tr><tr><td>Sistema de ultramicrotomía Pyramitom&nbsp;</td>Sistema de análisis de imagen <td>Leica</td><td>Ultracut S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Explora Nova</td><td>Mercator</td><td></td></tr></tbody></table>

el trasplante de células ensheathing olfativo para evaluar la recuperación funcional después de la lesión del nervio periférico

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

<html> Células olfativas ensheathing (OECO) son las células de la cresta neural, que permiten el crecimiento y la regeneración de las neuronas olfatorias primarias. De hecho, el sistema olfativo principal se caracteriza por su capacidad para dar lugar a nuevas neuronas, incluso en los animales adultos. Esta habilidad particular, se debe en parte a la presencia de la OECO que crean un microambiente favorable para la neurogénesis. Esta propiedad de OECs se ha utilizado para el trasplante celular, tales como en modelos de lesión de la médula espinal. Aunque el sistema nervioso periférico tiene una mayor capacidad de regenerarse después de una lesión del nervio que el sistema nervioso central, secciones completas inducir encaminamiento erróneo durante el rebrote axonal en particular, después de la cara de la transección del nervio laríngeo. Específicamente, llena la sección del nervio laríngeo recurrente (NLR) induce el rebrote axonal aberrante que resulta en synkinesis de las cuerdas vocales. En este modelo específico, se demostró que el trasplante OECs aumenta eficazmente el recrecimiento axonal. ve_content &quot;&gt; OECs están constituidos de varias subpoblaciones presentes tanto en la mucosa olfativa (OM-OECO) y los bulbos olfativos (Ob-OECO). Presentamos aquí un modelo de trasplante celular basado en el uso de estas diferentes subpoblaciones de OECs en un modelo de lesión del NLR. Utilizando este paradigma, los cultivos primarios de OB-OECs y OM-OECs se trasplantaron en matrigel después de la sección y anastomosis del NLR. Dos meses después de la cirugía, se evaluaron animales trasplantados por análisis complementarios sobre la base de videolarin-goscopia, la electromiografía (EMG) , y los estudios histológicos. Primero, videolarin-goscopia nos permitió evaluar las funciones de la laringe, en particular cocontractions musculares fenómenos. Entonces, EMG analiza riqueza demostrada y sincronización de las actividades musculares. Finalmente, los estudios histológicos basado en azul de toluidina tinción permite la cuantificación del número y perfil de fibras mielinizadas. Todos juntos, como se describe aquí cómo aislar, cultura, identify y trasplante OECs de OM y OB después NLR sección anastomosis y la forma de evaluar y analizar la eficacia de estas células trasplantadas en las funciones de rebrote y laríngeos axonal.

Ilustraciones con el control y la reinervado (sección / anastomosados) los animales han sido elegidos como los resultados pueden variar dependiendo de los trasplantes celulares realizados (OM, OB o OM + OB). Cultivo celular Las células se adhieren rápidamente a la superficie de plástico y se convirtieron en segregado en franjas paralelas de células que son o que se estrecha alargada, triangular, multipolar, o en forma de huso (Figuras 1A y 1B)....

Células olfativas ensheathing (OECO) son las células de la cresta neural, que permiten el crecimiento de las neuronas olfatorias primarias. Esta propiedad específica se puede utilizar para el trasplante celular. Se presenta aquí un modelo de trasplante celular basado en el uso de OECs en un modelo de lesión del nervio laríngeo.

El trasplante de células ensheathing olfativo para evaluar la recuperación funcional después de la lesión del nervio periférico

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

El objetivo general de este procedimiento es presentar un modelo de trasplante celular basado en el uso de células olfativas y de sostén en un modelo de lesión del nervio laríngeo. Esto se logra primero mediante la sección y realización de anastomosis del nervio laríngeo recurrente. A continuación, se trasplantan las células olfativas y de sostén obtenidas del epitelio olfativo o de los bulbos olfativos.Luego, de dos a tres meses después de la cirugía, los animales se evalúan mediante laringoscopia y electromiografía. Finalmente, se aísla el nervio laríngeo recurrente para estudios histológicos. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran que las células olfativas y las células de envainamiento mejoran el crecimiento axonal del nervio laríngeo recurrente y la recuperación funcional de las cuerdas vocales mediante laringoscopia, electromiografía y mediciones histológicas.Este método puede responder preguntas clave en el campo de la lesión de nervios periféricos que implican la medición del crecimiento axonal y la capacidad de cuantificar la funcionalidad de la recuperación. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la anastomosis d

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Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

La lesión traumática de la médula espinal interrumpe la comunicación con el cerebro. Para restaurar la pérdida de conectividad que utilizan un injerto de nervio periférico para proporcionar un sustrato para la regeneración de las fibras en combinación con factores neurotróficos y las enzimas de la matriz de modulación, para eliminar las moléculas inhibidoras para promover el crecimiento de larga distancia.

La combinación de injerto de nervio periférico y la matriz de modulación para la Reparación de médula espinal de ratas lesionados

Se describe aquí un método para la biopsia de mucosa olfatoria de ratas y humanos cavidades nasales. Estas biopsias se pueden utilizar tanto para la identificación de anomalías moleculares en las enfermedades cerebrales o el aislamiento de células madre adultas multipotentes que pueden ser utilizados para el trasplante de células en modelos animales de trauma cerebral /...

Aislar las células madre olfativo nasal de los roedores o los seres humanos

Este video muestra el procedimiento para aislar neuronas ganglionares de la retina (RGNs) de la retina de una rata y cocultivarlas con células de glía de envoltura olfativa (OEG). Este método permite estudiar el potencial neuro-regenerativo de los OEG después de una lesión neuronal.

Coculturación de neuronas ganglionares de la retina con glía de envoltura olfativa

Fuente: Portela-Lomba, M., et. al. Cocultivo de neuronas ganglionares retinianas de rata axotomizadas con glia envolvente olfativa, como modelo in vitro de regeneración axonal adulta. J. Vis. Exp. (2020).Este video muestra la obtención de imágenes y la cuantificación de la regeneración axonal en neuronas ganglionares de la retina de rata axotomizadas (RGN) co-cultivadas con células gliales de envoltura olfativa humanas inmortalizadas. Las RGN están inmunomarcadas, con somas rojos y axones...

Imagen y cuantificación de la regeneración axonal en neuronas ganglionares de la retina de rata axotomizadas

El análisis de las propiedades fisiológicas de las neuronas sensoriales olfativas aún enfrenta limitaciones técnicas. Aquí los registramos a través de una pinza de parche perforada en una preparación intacta del epitelio olfativo en ratones dirigidos a genes. Esta técnica permite la caracterización de las propiedades de la membrana y las respuestas a ligandos específicos de neuronas que expresan receptores olfativos definidos.

Perforado grabación de patch-clamp de ratón neuronas sensoriales olfativas en neuroepitelio Intacto: Análisis funcional de las neuronas que expresan un odorante del receptor Identificado

Este artículo describe una técnica para insertar un tubo hueco entre los tocones de la médula espinal después de la transección completa y se llenan de células de Schwann (SCs) y matriz inyectable la membrana del sótano para salvar y promover la regeneración del axón a través de la brecha.

Trasplante de Schwann las células dentro de conductos de PVDF-TrFE a puente tocones de médula espinal de rata seccionado para promover la regeneración del axón a través de la brecha

Este protocolo presenta un modelo robusto y reproducible de alotrasplante compuesto vascularizado (VCA) orientado al estudio simultáneo de la inmunología y la recuperación funcional. El tiempo invertido en la técnica meticulosa en un trasplante ortotópico de las extremidades traseras de la parte media derecha con anastomosas vasculares cosidas a mano y coaptación neuronal produce la capacidad de estudiar la recuperación funcional.

Dar el siguiente paso: un modelo de trasplante de extremidades hindópicos ortotópicos de coaptación neuronal para maximizar la recuperación funcional en rata

Presentamos un modelo in vitro para evaluar la capacidad neurorregenerativa olfativa ensheathing glia (OEG), después de una lesión neuronal. Se basa en un cocultivo de neuronas ganglionas de retina adultas axotomizadas (RGN) en monocapas OEG y posterior estudio de regeneración axonal, mediante el análisis de marcadores axoales y somatodendriáticos RGN.

Cocultura de neuronas ganglionas retinal de rata axotomizada con glia olfativa, como modelo in vitro de regeneración axonal adulta

En este artículo, proporcionamos un método reproducible para generar y mantener cortes organotípicos de la médula espinal a largo plazo trasplantados con células madre neurales como modelo ex vivo para probar terapias de reemplazo celular.

Cultivo a largo plazo de cortes organotípicos de médula espinal de ratón como plataforma para validar el trasplante de células en lesiones de la médula espinal

Ganglios de la raíz dorsal (DRG) son estructuras que contienen las neuronas sensoriales del sistema nervioso periférico. Cuando disociado, pueden ser co-cultivadas con células madre-SC como derivadas de tejido adiposo (ASC), que proporciona un valioso modelo para estudiar la regeneración in vitro en los nervios y la mielinización, imitando el entorno en vivo en el sitio de la lesión.

Ganglios de raíz dorsal neuronas y las células madre derivadas de la adiposa diferenciada: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultivo modelo para estudiar la regeneración de los nervios periféricos

Aprende el trasplante de células ensheathing olfativo para evaluar la recuperación funcional tras lesión del nervio laríngeo recurrente en modelo animal. Este método permite estudiar la regeneración axonal y la restauración de la función vocal mediante laringoscopia, electromiografía e histología.

El trasplante de células ensheathing olfativo para evaluar la recuperación funcional después de la lesión del nervio periférico

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