El trasplante de células ensheathing olfativo para evaluar la recuperación funcional después de la lesión del nervio periférico

El objetivo general de este procedimiento es presentar un modelo de trasplante celular basado en el uso de células olfativas y de sostén en un modelo de lesión del nervio laríngeo. Esto se logra primero mediante la sección y realización de anastomosis del nervio laríngeo recurrente. A continuación, se trasplantan las células olfativas y de sostén obtenidas del epitelio olfativo o de los bulbos olfativos.

Luego, de dos a tres meses después de la cirugía, los animales se evalúan mediante laringoscopia y electromiografía. Finalmente, se aísla el nervio laríngeo recurrente para estudios histológicos. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran que las células olfativas y las células de envainamiento mejoran el crecimiento axonal del nervio laríngeo recurrente y la recuperación funcional de las cuerdas vocales mediante laringoscopia, electromiografía y mediciones histológicas.

Este método puede responder preguntas clave en el campo de la lesión de nervios periféricos que implican la medición del crecimiento axonal y la capacidad de cuantificar la funcionalidad de la recuperación. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la anastomosis del nervio laríngeo recurrente requiere habilidades microquirúrgicas. Después de generar cultivos primarios marcados con GFP de bulbos olfatorios, o BO, y mucosa olfatoria, o MO, según se describe en el protocolo escrito, prepárese para la cirugía autoclavando todos los instrumentos.

Una vez que la rata haya sido anestesiada mediante inyección intraperitoneal de ketamina y clorpromacina, verifique el nivel de sedación realizando una compresión del dedo del pie. Afeite el sitio quirúrgico y coloque a la rata en decúbito dorsal, desinfecte la piel con lavados alternados de alcohol y solución de Betadine. A continuación, prepare un entorno quirúrgico estéril y mantenga procedimientos estériles durante toda la cirugía.

Utilice un escalpelo para realizar una incisión cutánea cervical medial de dos centímetros. A continuación, siguiendo la línea blanca medial, realice una incisión vertical de los músculos infrahiodeos utilizando un retractor ortostático entre los músculos infrahiodeos. Exponga la laringe y luego el nervio laríngeo recurrente o NLR.

Luego, bajo un microscopio quirúrgico, use tijeras microquirúrgicas para cortar completamente el nervio a nivel del séptimo anillo traqueal con un punto de sutura 11 T. Realice una anastomosis para desinervar la laringe justo antes del trasplante. Use tripsina EDTA al 0,05 % para eliminar las células OB y OM de las placas.

Luego, para detener la digestión, agregue cinco mililitros de medio tibio tras centrifugar las células a 432 G durante cinco minutos. Utilice un citómetro de hemocitómetro para contar las células y ajuste la concentración celular en este modelo entre 1,2 y seis veces 10 a la seis células en 30 microlitros de D-M-E-M-F 12, que se usaron en un tubo microfuge. Prepare una proporción de uno a dos de células respecto al factor de crecimiento, Matrigel reducido y coloque en hielo justo antes del trasplante.

Saque el tubo del hielo y sosténgalo para calentar la mezcla. Usando una pipeta, deposite la solución de Matrigel celular en el sitio de anastomosis y permita que la mezcla se autoensamble en el nervio lesionado cuando se solidifique. Utilice suturas de calibre 4-0 para cerrar los músculos y la piel.

Coloque la rata en una jaula individual y manténgala bajo una lámpara de calor durante 24 horas. Administre analgésicos durante los siguientes cinco días, aproximadamente dos meses después de la cirugía, tras anestesiar al animal. En las ratas, como se describió anteriormente en este video, utilice un pellizco en el dedo del pie para confirmar la sedación.

Coloque la rata en decúbito dorsal antes de insertar un video de 30 grados. Ajuste el laringoscopio para obtener la mejor vista de la laringe, reproduciendo así la misma imagen en cada grabación. Determine los puntos de referencia anatómicos, como la comisura posterior, la cuerda vocal derecha en su inserción en la apófisis vocal del OID y la cuerda vocal izquierda en su inserción en la hipótesis vocal del oid.

Registre los movimientos de las cuerdas vocales seleccionando tres secuencias de abducción máxima sucesiva y abducción máxima. Para analizar la función laríngea, determine el movimiento angular absoluto midiendo la diferencia entre el movimiento de abducción máxima y abducción máxima de las cuerdas vocales. Determine la puntuación dinámica midiendo la amplitud del movimiento y la puntuación funcional midiendo las movimientos de sincinesia y paradójicos para realizar la electromiografía.

Coloque un electrodo sobre el músculo isquiotibial de la rata después de exponer la laringe y la tráquea, como se demostró para la anastomosis del nervio recurrente. Exponga el cartílago cricotiroideo. A continuación, utilizando tijeras microquirúrgicas, abra el cartílago cricotiroideo para exponer el músculo cricotiroideo posterior o músculo PCA.

Inserte un electrodo de aguja monopolar en el músculo con el animal bajo ventilación espontánea. Utilice un sistema de adquisición para registrar la actividad muscular eléctrica del músculo PCA. Analice la actividad muscular en términos de riqueza y sincronización con la respiración asignando una puntuación cualitativa de cero a tres utilizando la siguiente escala.

Cero equivale a un trazado no probado sin aumento durante la inspiración. Uno equivale a un trazado rítmico con aumento durante la inspiración, pero pobre; dos equivale a un trazado rítmico con actividad más rica; y tres equivale a un trazado rítmico muy intenso, que constituye un patrón de interferencia similar al de una actividad voluntaria máxima.

A continuación, para evitar dañar el NRL debido a su pequeño tamaño, exponga el nervio vago, coloque un electrodo y estimule en este sitio. Registre la latencia y la duración del potencial en el músculo CPA. Finalmente, tras la eutanasia del animal mediante sobredosis de pentobarbital bajo microscopio, localice la anastomosis, sutúrela y retire el muñón distal del NRL entre la anastomosis y la laringe.

Realice el análisis histológico según el protocolo descrito aquí tras el trasplante de células procedentes de cultivos primarios de mucosa olfativa y bulbos olfativos, que son ejemplos de trazas de EMG obtenidas en el músculo PCA durante la respiración. Los animales del grupo control presentaron una actividad muscular eléctrica rica, con un aumento durante la inspiración que no estaba presente en el grupo tratado con Rer. En esta figura, los análisis histológicos del NLR mediante tinción con azul de toluidina muestran perfiles típicos de fibras de animales normales, reinnervados y trasplantados.

Esta medición permite cuantificar el número de fibras mielinizadas, el tamaño medio de las fibras y el grosor medio de la mielina, como se muestra aquí. Para completar los análisis histológicos, se realizó el seguimiento de células positivas para GFP tras el trasplante intra-nervioso en el nervio ciático.

Este sitio fue elegido en lugar del NRL porque el pequeño tamaño del NRL impide el trasplante intra-nervioso. La anastomosis de Hans al nervio perineal recurrente puede realizarse en 15 minutos si se realiza adecuadamente después de su desarrollo. Estas técnicas allanaron el camino para que los investigadores en el campo de las lesiones de nervios periféricos exploraran el uso del trasplante celular en un modelo de rata.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo trasplantar células en el modelo de lesión del nervio recurrente y evaluar la recuperación funcional de las cuerdas vocales mediante electromiografía, endoscopia de laboratorio y mediciones histológicas.