Name: El uso de citometría de imagen para la cuantificación de hongos patógenos en asociación con las células huésped (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Aprende a cuantificar levaduras patógenas en células huésped mediante citometría de imagen como alternativa eficiente a la enumeración de unidades formadoras de colonias. Este método acelera el estudio de la patogénesis fúngica.

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1. La infección de macrófagos con H. capsulatum, C. albicans <ol><li> 16 horas antes de la infección, los macrófagos de semillas a la densidad deseada en placas de 24 pocillos. En este protocolo, se utilizó una densidad de células de 3,0 x 10 5 / pocillo. </li><li> Añadir células de hongos en crecimiento de fase log a una multiplicidad de infección deseada (MOI). Este protocolo se puede acomodar una variedad de MOI (0,2-5,0). Para la infección de macrófagos RAW264.7 con H. capsulatum, se utilizó un MOI de 0,2. </li><li> Después de 1,5 horas para permitir la fagocitosis, los macrófagos lavar tres veces con PBS para eliminar los hongos extracelulares. </li><li> Incubar obtener el número deseado de horas antes del análisis de la muestra. En una MOI baja (0,2 en nuestro experimento), células de macrófagos infectados permanecen viables durante varios días, y las muestras pueden ser analizadas aproximadamente cada 12-24 horas. </li></ol> 2. Lisis del macrófago <ol><li> Para liberar a los hongos de los macrófagos, retire los medios, lavar 3 veces con PBS, yañadir 0,5 ml de agua estéril. En estas condiciones, los macrófagos y lisar células fúngicas permanecerán intactos. </li><li> Incubar durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Traslado lisado de tubo estéril, mantener en hielo. </li><li> Transferencia de 20 l de lisado a un tubo separado, a continuación, añadir 20 l AO / solución PI. Vaya directamente al paso 5: &quot;Preparación de la muestra para el análisis de citometría de imagen&quot; </li></ol> 3. CFU Plating <ol><li> Realizar dilución de diez veces de los lisados ​​(de la etapa 2.3) en los medios de comunicación. </li><li> Placa 100 l de cada dilución por duplicado, en placas HMM-agarosa. Incubar las placas en una cámara humidificada a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 7-8 días. </li><li> Recuento manual de colonias en las placas que muestran un mínimo de 100 y un máximo de 1.000 colonias distintas. </li></ol> 4. Visualización de hongos dentro de los macrófagos en Vivo <ol><li> Para recoger los macrófagos vivos, lavar las células 3 veces con PBS. Añadir 0,5 ml de PBS y se incuba durante 30 min a 4 ° C.</li><li> Para eliminar los macrófagos de los pocillos de cultivo de tejidos, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces. Transfiera el líquido en el tubo estéril, mantener en hielo. </li><li> Transferencia de 20 l de muestra a un tubo separado, a continuación, añadir 20 l AO / solución PI. Vaya directamente al paso 5: &quot;Preparación de muestras para análisis de citometría de imagen&quot;. </li></ol> 5. Preparación de muestras para análisis de citometría de imagen <ol><li> Pipetear la muestra objetivo a fondo y después transferir 20 l de muestra en la cámara de recuento celular desechable. </li><li> Permita que las células se asienten en la cámara durante 30 segundos. </li><li> Insertar cámara de recuento en el citómetro de imagen. </li></ol> 6. Configuración del instrumento Cellometer <ol><li> Inserte la óptica de fluorescencia Módulos: VB-535-402 y VB-660-502 en el sistema y asegurarse de que están bloqueados en su lugar. <ol><li> VB-535-402 (excitación a 475 nm, emisión a 535 nm) se utiliza para el naranja de acridina y detección de GFP. </li><li> VB-660-502 (excitatien a 540 nm, emisión a 660 nm) se utiliza para la detección de yoduro de propidio. </li></ol></li><li> Encienda el citómetro de imagen y abrir el software que lo acompaña. </li></ol> 7. Configuración del software Cellometer <ol><li> Seleccione el preset &quot;Tipo de ensayo&quot; y &quot;Tipo de la célula&quot; en el menú desplegable de ensayo. <ol><li> Para la viabilidad, el ensayo se optimiza para el naranja de acridina y la detección de yoduro de propidio. </li><li> Para la detección de la infección por Candida albicans, el ensayo se optimiza para la detección de GFP. </li></ol></li><li> Seleccione &quot;Opciones&quot; en la parte superior y haga clic en &quot;Take imagen de fondo&quot;, y permitir que se complete la operación. </li><li> Haga clic en &quot;Vista previa de imagen de campo claro&quot;. </li></ol> 8. Procedimiento de adquisición de imágenes <ol><li> Inserte el módulo de la muestra preparada en el citómetro de imagen. </li><li> Utilice el botón de enfoque y ajustar el enfoque. </li><li> Una vez en el foco, haga clic en &quot;Cuenta&quot;, y permitir que la operación de adquisición de imágenes para completar. </li><li> RemoVe la cámara de recuento desechables y disponer de manera adecuada. </li></ol> 9. Análisis de los datos de imagen <ol><li> La concentración y la medición de la viabilidad <ol><li> Una vez que el recuento se ha completado, la concentración y la viabilidad de las células diana se muestran en la página de resultados. </li><li> Haga clic en &quot;Exportar&quot; para exportar los datos en FCS Express 4 para el análisis de la población de células de las buenas prácticas agrarias en el Candida albicans experimento infección. </li></ol></li><li> FCS análisis expreso de las células infectadas por Candida albicans- <ol><li> Importe el archivo &quot;. NXDAT&quot; en FCS Express 4 y la trama de los resultados en un histograma de fluorescencia. </li><li> Aplicar puerta población de células para el histograma para determinar los porcentajes de la población de células infectadas por Candida albicans. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Worsham, P. L., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+plating+of+Histoplasma+capsulatum+without+addition+of+conditioned+medium+or+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Vet.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores.</a> J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).</li>
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<li>Nguyen, V. Q., Sil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-induced+switch+to+the+pathogenic+yeast+form+of+Histoplasma+capsulatum+requires+Ryp1%2C+a+conserved+transcriptional+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).</li>
<li>Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+susceptibility+testing+of+fungi+by+flow+cytometry+using+vital+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).</li>
</ol>

Los autores Leo Li-Ying Chan y Benjamin Paradis son empleados de Nexcelom Bioscience LLC.

Citometría de imagen permite al usuario capturar imágenes de alta calidad y el uso de software especializado, realizar una rápida cuantificación de células. Un reto potencial para la adopción de la citometría de imagen en el campo de la patogénesis microbiana es que los microbios a ser contadas están presentes en una población mixta de células, incluyendo las células huésped de mamífero. Aquí, demostramos que la citometría de imagen se puede utilizar para la cuantificación de levaduras patógenas viables durante la</...

Estudios de hongos patógenos en asociación con sus anfitriones y / o células huésped a menudo requieren la cuantificación de células fúngicas viables durante un transcurso de tiempo o bajo diferentes condiciones de infección. Enumeración de las unidades formadoras de colonias (UFC) es el método estándar por el cual se ha medido el número de células de hongos viables, sin embargo, esta técnica tiene varios inconvenientes y limitaciones. En primer lugar, muchas especies de hongos son de crecimiento lento. El crecimiento de colonias visibles en medios sólidos puede tardar 1-2 semanas, disminuyendo significativamente el ritmo de la investigación. En segundo lugar, la manipulación de las muestras durante chapado UFC es un proceso laborioso, ya que varias diluciones deben ser chapados para asegurar un número contable de colonias. En tercer lugar, el número de UFC es típicamente menor que el número de organismos viables sembradas debido a que la eficiencia de plaqueo es muy por debajo de 100%. Por ejemplo, la eficiencia de la galjanoplastia para el hongo dimórfico Histoplasma capsulatum patógeno puede ser tan alta como 90%, pero son habitualmente tan bajo como30% y son aún más baja (10%) para el relacionado con hongos dimorfo Paracoccidioides brasiliensis 1, 2. Eficiencia de plaqueo para Candida albicans también está sujeta a la variabilidad 3. Por último, el análisis de CFU representa sólo las células en vivo y dividiendo activamente capaces de establecer el crecimiento en medios sólidos, mientras que en muchas situaciones, sería útil para determinar la presencia y concentración de las células muertas inactivos y / o metabólicamente. Anteriormente, los métodos de citometría de flujo para la cuantificación de varias especies de hongos patógenos ha sido descrito 4-6. Sin embargo, debido a problemas de contención de bioseguridad relacionados con el uso de bioseguridad de nivel 2 (BSL2) o patógenos BSL3 nivel de citómetros de flujo compartidas, la adopción de esta técnica ha sido limitada. Al igual que la citometría de flujo, citometría de imagen es un método sensible y rápido de cuantificación celular. Sin embargo, la citometría de imagen se puede realizar a una fracción del costo con resultados comparables 7 -11. Aquí, se describen los métodos para realizar citometría de imagen de hongos patógenos en asociación con las células huésped. Demostramos nuestros métodos utilizando dos hongos patógenos humanos: Histoplasma capsulatum y Candida albicans H.. capsulatum es un hongo patógeno dimórfico que causa la enfermedad de las vías respiratorias, en los seres humanos, que crece como levadura en ciernes y se replica dentro de los macrófagos alveolares Candida albicans es una especie comensal humanos, que en ocasiones causa la candidiasis.. Se demuestra que la citometría de imagen permite una rápida cuantificación de estas levaduras, junto con la capacidad de visualización.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><REACTIVOS >FUERTES</fuertes></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td> Soluciones <td>de Life Technologies</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>AO/PI Nexcelom</td><td>Bioscience</td><td>CSK-0102</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de recuento desechable</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CHT4-SD100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Cellometer Vision</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Vision Software</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

el uso de citometría de imagen para la cuantificación de hongos patógenos en asociación con las células huésped

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Los estudios sobre los mecanismos de la patogénesis celulares de levaduras patógenas tales como Candida albicans, Histoplasma capsulatum y Cryptococcus neoformans emplean comúnmente infección de huéspedes mamíferos o células huésped (es decir, los macrófagos), seguido por la cuantificación de levadura utilizando formadoras de colonias unidad de análisis o la citometría de flujo. Mientras unidad formadora de colonias enumeración ha sido el método más comúnmente utilizado en el campo, esta técnica tiene desventajas y limitaciones, incluyendo el crecimiento lento de algunas especies de hongos en medios sólidos y eficiencias bajas y / o variable de chapado, lo cual es de particular preocupación cuando se comparan el crecimiento de las cepas de tipo salvaje y mutante. La citometría de flujo puede proporcionar una rápida información cuantitativa con respecto a viabilidad de la levadura, sin embargo, la adopción de la detección de citometría de flujo para las levaduras patógenas se ha visto limitado por un número de razones prácticas, incluyendo su alto costo y las consideraciones de seguridad de la biotecnología. Este sentido, demuestran una imagen basada enmetodología de citometría de uso de la Visión Cellometer (Nexcelom Bioscience, LLC) para la cuantificación de levaduras patógenas viables en co-cultivo con macrófagos. Nuestros estudios se centran en la detección de dos hongos patógenos humanos: Histoplasma capsulatum y Candida albicans H.. capsulatum coloniza los macrófagos alveolares mediante la replicación dentro del fagosoma macrófagos, y aquí, nos cuantitativamente evaluar el crecimiento de H. levaduras capsulatum en RAW 264,7 macrófagos con naranja de acridina / tinción con yoduro de propidio en combinación con citometría de imagen. Nuestro método recapitula fielmente las tendencias de crecimiento, medido por unidad formadora de colonia tradicional enumeración, pero con un aumento significativo de sensibilidad. Además, se evalúa directamente la infección de los macrófagos en vivo con una cepa que expresa GFP de C. albicans. Nuestra metodología ofrece un medio rápido, preciso, y económico para la detección y cuantificación de hongos patógenos humanos importantes en asociación ingeniocélulas huésped h.

Se utilizó el Cellometer Vision imagen citómetro para controlar el crecimiento de H. capsulatum en células de macrófagos. Las células RAW 264.7 fueron infectados con H. células de levadura capsulatum y en varios puntos de tiempo, las muestras fueron sometidas a tinción AO / PI seguida de análisis de citometría basada en imágenes. En paralelo, las muestras se analizaron por enumeración tradicional UFC. En cada punto de tiempo, las muestras se incubaron en agua para lisar los macrófagos, y las c...

Aquí, demostramos cómo citometría de imagen se puede utilizar para la cuantificación de hongos patógenos en asociación con células huésped en cultivo. Esta técnica se puede utilizar como una alternativa a la CFU enumeración.

El uso de citometría de imagen para la cuantificación de hongos patógenos en asociación con las células huésped

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar levaduras patógenas asociadas con células huésped sin realizar el recuento de unidades formadoras de colonias. Primero, infecte las células de macrófagos con levaduras de H capsulatum o C. albicans y tiña las células de macrófagos infectadas con naranja de acridina y yoduro de propidio para resaltar las levaduras viables. Luego, mediante un citómetro de imágenes, capture una serie de imágenes y analice los parámetros de tamaño y forma para enumerar con precisión las células de levadura.Los resultados de la citometría de imágenes pueden utilizarse eficazmente para cuantificar levaduras patógenas en asociación con células huésped. Tuve la idea inicial de este método mientras realizaba investigaciones en el campo de la patogénesis fúngica, en las que tuve que sembrar y contar repetidamente unidades formadoras de colonias para cuantificar el hongo patógeno Histoplasma capsulatum. La principal ventaja de la citometría de imágenes frente al método estándar de enumeración de UFC radica en su mayor velocidad, ya que elimina los pasos intensivos en mano de obra y tiempo que implican sembrar, incubar y contar múltiples diluciones seria

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra un método para cuantificar la fagocitosis de esporas de hongos patógenos marcados con FITC por leucocitos humanos. Las esporas fagocitadas se distinguen de las esporas adherentes a las células mediante la contratinción, seguida de un análisis de citometría de flujo.

Medición cuantitativa por citometría de flujo de la fagocitosis de esporas fúngicas por fagocitos humanos

Aquí, se describe un ensayo fenotípico aplicable a las pantallas de alto rendimiento / alto contenido de ARN sintético de interferencia pequeña (siRNA), compuesto químico, y bibliotecas de mutantes de Mycobacterium tuberculosis. Este método se basa en la detección de tuberculosis de la micobacteria fluorescentemente etiquetada dentro de la célula huésped etiquetada fluorescentemente usando microscopia confocal automatizada.

Un Ensayo Fenotípico Microscópico Para La Cuantificación De Micobacterias Intracelulares Adaptadas Para La Detección De Alto Rendimiento / Alto Contenido

Aquí, se describe un protocolo para evaluar la actividad antifúngica de las células inmunes humanas primarias en tiempo real utilizando fluorescente conidias de Aspergillus reportero en conjunción con microscopía de vídeo en vivo de células y citometría de flujo. Los datos generados proporcionan la penetración en hospedantes de célula interacciones de Aspergillus tales como actividad fungicida, la fagocitosis, la migración celular y la inhibición de crecimiento de hongos.

Imágenes en vivo de la actividad antifúngica por los neutrófilos humanos primarios y los monocitos en respuesta a las<em&gt; A. fumigatus</em

Aquí se describe un protocolo para determinar la carga micótica pulmonar en ratones con aspergilosis invasiva por cuantificación de la coloración en cortes histológicos de plata de methanamine modificado de Gomori. Uso de este método dio lugar a resultados comparables con menos animales en comparación con evaluación de la carga de hongos por PCR cuantitativa de ADN fúngico de pulmón.

Cuantificación histológica para determinar la carga micótica pulmonar en aspergilosis Experimental

Describimos un protocolo que utiliza la hibridación in situ por fluorescencia (FISH) para visualizar múltiples ARN herpesvirales dentro de células humanas infectadas lyéticamente, ya sea en suspensión o adherente. Este protocolo incluye la cuantificación de la fluorescencia produciendo una relación nucleocitotoplasmática y se puede extender para la visualización simultánea de proteínas huésped y virales con inmunofluorescencia (IF).

Fluorescencia cuantitativa en hibridación situ (FISH) e inmunofluorescencia (IF) de productos genéticos específicos en células infectadas por KSHV

El propósito de este protocolo es visualizar la forma de la célula candida albicans y la localización en el tracto gastrointestinal de los mamíferos.

Visualización de Candida albicans en el tracto gastrointestinal murino utilizando hibridación fluorescente in situ

Este protocolo proporciona un método rápido y fiable para medir cuantitativamente la fagocitosis de Aspergillus fumigatus conidia por los fagocitos primarios humanos utilizando citometría de flujo y para discriminar la fagocitosis de la conidia de la mera adhesión a los leucocitos.

Medición de la fagocitosis de Aspergillus fumigatus Conidia por leucocitos humanos utilizando citometría de flujo

Los colorantes fluorescentes vitales son herramientas esenciales para el análisis de imágenes de células vivas en la biología moderna de células fúngicas. Este artículo detalla la aplicación de colorantes fluorescentes establecidos y menos conocidos para el seguimiento de la dinámica de la membrana plasmática, la endo-/exócicosis y la morfogénesis de la pared celular en hongos filamentosos.

Aplicación de colorantes fluorescentes selectivos de membrana y pared celular para imágenes de células vivas de hongos filamentosos

Aquí, presentamos un protocolo para perfilar la interacción entre el huésped y el patógeno durante la infección por proteómica basada en espectrometría de masas. Este protocolo utiliza la cuantificación libre de etiquetas para medir los cambios en la abundancia de proteínas tanto del huésped (por ejemplo, macrófagos) como del patógeno (por ejemplo, Cryptococcus neoformans)en un solo experimento.

Flujo de trabajo de proteómica cuantitativa sin etiquetas para interacciones host-patógenos impulsadas por el descubrimiento

Presentamos un método, que utiliza un enfoque de análisis de imágenes basado en áreas generalizables para identificar los recuentos de células. El análisis de diferentes poblaciones celulares explotó las diferencias significativas de altura y estructura celular entre los distintos tipos de células dentro de un algoritmo adaptativo.

Algoritmo de análisis de imágenes basado en áreas para la cuantificación de cocultivos de macrófagos y fibroblastos

Este manuscrito describe un método para examinar bibliotecas mutantes de Candida albicans de tamaño moderado para fenotipos de morfogénesis durante la infección activa en un huésped mamífero utilizando microscopía confocal no invasiva.

Uso de imágenes in vivo para detectar fenotipos de morfogénesis en cepas mutantes de Candida albicans durante la infección activa en un huésped mamífero

Aprende a cuantificar levaduras patógenas en células huésped mediante citometría de imagen como alternativa eficiente a la enumeración de unidades formadoras de colonias. Este método acelera el estudio de la patogénesis fúngica.

El uso de citometría de imagen para la cuantificación de hongos patógenos en asociación con las células huésped

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