El uso de citometría de imagen para la cuantificación de hongos patógenos en asociación con las células huésped

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar levaduras patógenas en asociación con células huésped sin placas de unidades formadoras de colonias. En primer lugar, infecte las células de macrófagos con capsulación de H o células de levadura de C albicans, tiña las células de macrófagos infectadas con naranja de aína y yoduro de propidio para resaltar las células de levadura viables. Luego, usando un citómetro de imágenes, capture una serie de imágenes y analice los parámetros de tamaño y forma para enumerar con precisión las células de levadura.

Los resultados de la citometría de imágenes se pueden utilizar eficazmente para cuantificar levaduras patógenas en asociación con células huésped. La idea de este método fue cuando investigaba en el campo de la patogénesis fúngica, en la que tuve que contar repetidamente las unidades formadoras de colonias para la cuantificación de la cápsula de Histoplasma del hongo patógeno. La principal ventaja de la citometría por imagen sobre el método estándar de enumeración de UFC es su mayor velocidad, ya que elimina los pasos laboriosos y lentos de la siembra, la incubación y el recuento de múltiples diluciones en serie de UFC al comparar el crecimiento de cepas de tipo salvaje y mutantes dentro de las células huésped.

Este método elimina el sesgo potencial introducido por las diferentes habilidades para iniciar el crecimiento de la calidad en medios sólidos. En general, las personas nuevas en este método pueden ser desafiadas por la citometría de imagen. Instrumentación y software.

Comience el procedimiento cultivando los macrófagos a la densidad deseada. En placas de 24 pocillos, agregue las células fúngicas en fase de crecimiento logarítmico, luego incube durante 90 minutos para permitir la fagocitosis. A continuación, lave los macrófagos tres veces con PBS para eliminar los hongos extracelulares que se incuban durante los puntos de tiempo definidos experimentalmente antes del análisis de la muestra con una baja multiplicidad de infección, las células de macrófagos infectadas permanecen viables durante varios días y las muestras se pueden analizar aproximadamente cada 12 a 24 horas.

Después de tres lavados con PBS, agregue 0,5 mililitros de agua estéril a las células de macrófagos infectadas. Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente para liberar los hongos de las células de los macrófagos. A continuación, coseche el lisado en un tubo estéril y manténgalo en hielo.

Transfiera 20 microlitros del lisado a un tubo separado. Agregue 20 microlitros de solución de yoduro de propidio de naranja aine para el análisis citométrico inmediato de la imagen. Realice una dilución diez veces mayor de los lisados en los medios.

A continuación, coloque 100 microlitros de cada dilución por duplicado. En placas de HMM aros. Incubar las placas en una cámara humidificada a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante siete u ocho días.

Cuente manualmente las colonias en las placas, mostrando un mínimo de 100 y un máximo de 1000 colonias distintas. Para recolectar los macrófagos vivos, lave las células tres veces con PBS. A continuación, añadir 0,5 mililitros de PBS e incubar durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.

Retire los macrófagos de los pocillos de cultivo de tejidos mediante un pipeteo suave. Transfiera el líquido a un tubo estéril y guárdelo en hielo. Para configurar el instrumento acelerómetro, inserte los módulos ópticos de fluorescencia en el sistema y asegúrese de que estén bloqueados en su lugar.

Encienda el citómetro de imagen en el menú desplegable de ensayos del software. Seleccione el tipo de ensayo preestablecido y el tipo de célula para la viabilidad. El ensayo está optimizado para la detección de naranja de aína y yoduro de propidio para la detección de la infección por Candida albicans.

El ensayo está optimizado para la detección de GFP. Ahora abra la pestaña de opciones y haga clic en tomar imagen de fondo Una vez completada la operación, haga clic en vista previa de la imagen de campo claro para la medición de viabilidad A OPI. Mezcle 20 microlitros de muestra con 20 microlitros de A OPI y pipetee en la cámara de contabilidad para la tasa de infección por Candida albicans.

Mezcle bien la muestra y plétela directamente en la cámara de recuento. Una vez que las células se hayan asentado en la cámara, inserte la cámara de recuento en el citómetro de imagen para la adquisición de imágenes. Enfoca la muestra y, a continuación, haz clic en recuento.

Cuando se complete la operación de adquisición de imágenes, retire la cámara de conteo desechable y deséchela correctamente. Para la medición de OPI A, los resultados de concentración y viabilidad se muestran en la página de resultados del recuento para determinar la tasa de infección por Candida albicans. Después de obtener los resultados del conteo, haga clic en exportar.

A continuación, envíe los datos a FCS express four para el análisis de la población celular de GFP. En FCS express, importe el archivo de datos y trace los resultados en un histograma de fluorescencia. A continuación, aplique una puerta de población celular al histograma para determinar los porcentajes de población de células infectadas con Candida albicans.

Este experimento monitorea el crecimiento de células de macrófagos infectadas por levadura hcaps Lotum en puntos de tiempo definidos. Las muestras se tiñen y se analizan mediante citometría basada en imágenes. Las células de levadura liberadas de los macrófagos mezclados se identifican mediante el software de visión Soter.

Aquí, el número absoluto de levaduras vivas detectadas es mayor que el de levaduras capaces de formar colonias en medio sólido. Estos datos ponen de manifiesto la presencia de un número significativo de células viables, pero no cultivables. Estos macrófagos derivados de la médula ósea se infectaron con células de levadura C albican que expresan proteína verde fluorescente bajo el control del promotor A DH one.

Las multiplicidades de infección que oscilaron entre 0,1 y 10 dieron lugar a aumentos incrementales en la intensidad de GFP dentro de los macrófagos infectados, así como en el porcentaje total de macrófagos infectados una vez dominados. Esta técnica se puede realizar en solo minutos por muestra si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar establecer los parámetros de modo que solo se cuenten las células fúngicas, no las células huésped.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar la citometría de imágenes para cuantificar levaduras patógenas en asociación con células huésped. No olvide que trabajar con hongos patógenos puede ser extremadamente peligroso, así que use equipo de protección personal y siga los procedimientos adecuados de eliminación de desechos de riesgo biológico.