Name: La microinyección estereotáxica de vectores virales que expresan Cre recombinasa para estudiar el papel de los genes diana de cocaína acondicionado Place Preferencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Aprende microinyección estereotáxica de vectores virales con Cre recombinasa en ratones para estudiar genes en la preferencia de lugar condicionada. Este método permite analizar fases de adquisición, extinción y reinstauración del comportamiento.

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Los autores desean agradecer a Anni Lee y Maureen Byrne por su ayuda en el establecimiento del protocolo de preferencia un lugar acondicionado extendida.

Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con el Weill Cornell Medical College Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión reglas. 1. Preparación y configuración de la administración estereotáxica de vectores virales <ol><li> Si un instrumento, hisopo estéril, o la mano usando guantes estériles están contaminados por el contacto con una superficie no estéril, deseche o volver a esterilizar el instrumento con un esterilizador de cuentas caliente, deseche el hisopo o cambiar a los nuevos guantes estériles. </li><li> Coloque una jaula del ratón con ropa de cama en un bloque de calor para calentar para la recuperación post-operatorio. </li><li> Configure afeitadora eléctrica para afeitarse la cabeza y el etanol y el yodo para esterilizar el cuero cabelludo. </li><li> Limpie los oídos bares y bodegas de la boca del stereotax con etanol al 70%. </li><li> Usando una jeringa de 5 l Hamilton, elaborará 5 l de vector viral (1 x 10 6 partículas virales / l) y creada en el soporte de jeringa stereotax. </li><li> Microondas almohadilla térmica o gire la almohadilla eléctrica sobre unº lugar en stereotax. Cubrir con una almohadilla absorbente limpio para reducir el riesgo de quemaduras. Monitor de temperatura del cuerpo del ratón (entre 97 a 99,5 ° F) con frecuencia durante todo el procedimiento. </li><li> Inyectar ratón (con un peso entre 22-35 g) con una mezcla de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (20 mg / kg). Una vez que el ratón está anestesiado, pizca punta de la cola para comprobar los reflejos del ratón y tenga en cuenta cualquier movimiento o respuesta para asegurar que el ratón está adecuadamente anestesiado. </li><li> Afeitarse la cabeza entre las orejas y los ojos. </li><li> Limpie la cabeza rapada con etanol y yodo aplicadores de algodón estériles alterna. </li><li> Traslado mouse pad de calefacción en stereotax. </li></ol> 2. La microinyección estereotáxica de vectores virales <ol><li> Use guantes estériles durante toda la cirugía. Si los guantes se contaminan en cualquier momento al tocar superficies no estériles, cambiar los guantes. </li><li> Zero barra dentada y las escalas de barras para los oídos. </li><li> Establecer los dientes en la barra de diente. </li><li> Atornille hocico. Si se mueve o bigote movimientoción se observó en cualquier momento, administrar una dosis de refuerzo IP (~ 0,05 cc) de una mezcla de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (20 mg / kg). </li><li> Atornille las barras de oído. </li><li> Lubricar los ojos con PuraLube. </li><li> Cortar el cuero cabelludo abierto a apenas detrás de las orejas con un bisturí. </li><li> Pinzas para sujetar papeles a cabo en las esquinas del cuero cabelludo a pelar la piel lejos de cráneo. Bregma y lambda debe ser fácilmente visible. </li><li> Asegúrese de sutura a bregma lambda se alinea directamente. Si la sutura es el posicionamiento reajuste torcida de la cabeza. </li><li> Asegúrese de que todos los ajustes del stereotax se ponen a cero. </li><li> Coloque la punta de aguja en su lugar a bregma. </li><li> Mida las coordenadas tanto para bregma y lambda. Esto incluye coordenadas dorsal / ventral, medial / lateral y anterior / posterior. </li><li> Ajuste de la cabeza hasta que las coordenadas ventrales para bregma y lambda son dentro de 0,02 mm el uno del otro. </li><li> Una vez alineados, desde el bregma ir medialmente a las coordenadas medial / lateral (M / L). Cerciorarselos lados izquierdo y derecho están alineados dentro de 0,02 mm el uno del otro. </li><li> Re-centro de la punta de la aguja en bregma y a partir de ahí se mueve en la dirección anterior / posterior (A / P) para la coordenada anterior / posterior deseada. </li><li> Si es necesario la aguja, el ángulo en una dirección y asegúrese de que el stereotax está bloqueado. Ir a la izquierda M / L de coordenadas (+ / - 1,52) </li><li> Medir la posición ventral de la parte superior del cráneo para usar como una referencia después se perfora el pozo de sondeo. </li><li> Perforar un pozo con una broca de estériles en la coordenada deseada. Compruebe que la aguja puede entrar sin interrupción a través del cráneo. </li><li> Baje la aguja hasta la cota deseada ventral. </li><li> Una vez alcanzada la cota, dip 0.015 mm por debajo de ~ 10 segundos para crear un pequeño espacio para el vector viral. </li><li> Inyectar el volumen deseado de vector viral a una velocidad de ~ 0,1 l / min. Espere 3 minutos para el vector viral para difundir completamente. Levante la punta de la aguja de 0,015 mm y esperar otros 2 min. </li><li>Sumergir la aguja (si haciendo inyecciones en ángulo) en la dirección opuesta. Una vez más, registrar la posición ventral como una referencia para la parte superior del cráneo. </li><li> Repita los mismos pasos que en el primer lado para inyectar vector viral en el lado opuesto (en caso de hacer inyecciones bilaterales). </li><li> Aplicar cera de hueso a ambos agujeros para sellarlos con el final de madera de un extremo del aplicador de algodón estéril. </li><li> Suturar el cuero cabelludo. </li><li> Aplicar el bloqueo del nervio a la zona de la herida. </li><li> Retire ratón desde stereotax y colocar en la jaula calentado en el bloque de calor para recuperar durante 45 min. </li><li> Vigilar los signos de dolor que incluyen: disminución de la actividad en general, inquietud, disminución de alimentos y el consumo de agua o el aumento de la vocalización. La buprenorfina (0,05-0,2 mg / kg) se puede administrar dos veces al día durante una semana si es necesario para el dolor. Alternativas aceptables incluyen: meperidina (20-60 mg / kg), pentazocina (10 mg / kg), nalbufina (4-8 mg / kg). </li></ol> 3. Preferencia de lugar condicionado: acquisition, extinción y reintegro <ol><li> Coloque los ratones en la sala central de un aparato de preferencia lugar de tres cámaras (Med Associates Inc., St. Albans, VT, EE.UU.) durante un periodo de habituación 60 segundos con puertas de guillotina cerrados. </li><li> Después de habituación, puertas de guillotina abierta y permitir que los ratones sin la exploración de las 3 cámaras para 1200 seg, con el tiempo transcurrido en cada cámara está grabando con el software MedPC IV (Med Associates, Inc.). </li><li> Asignar ratones para cámaras de acondicionamiento en base a su desempeño durante el pre-test. El uso de un diseño, administración arbitraria par medicamento durante los siguientes 3 días con el compartimiento que era menos preferido durante el pre-test basal. </li><li> Durante los próximos 3 días acondicionado, se inyectan ratones con la cocaína (10 mg / kg, ip) durante la sesión de la mañana y confinarlos en su cámara asignada para 1200 segundos inmediatamente después de la inyección. Ratones Volver a sus jaulas después de la sesión. Después de 4 horas, se inyectan ratones con solución salina (0,01 ml / gpeso corporal) y las confinan a la cámara opuesta para la sesión de la tarde 1200 seg. </li><li> Para la prueba de adquisición, lugar ratones en la cámara central con puertas de guillotina cerrados por un periodo de habituación 60 seg. Puertas de guillotina abierta y permitir la libre exploración de 1.200 seg, con el tiempo pasado en todas las cámaras grabadas por software MedPC IV (Med Associates, Inc.). Calcular preferencia restando la cantidad de tiempo gastado en la cámara de solución salina-emparejado de la cantidad de tiempo gastado en la cámara de cocaína-dos a dos. </li><li> Para apagar la preferencia de lugar, exponer ratones a dos sesiones de 20 min de la exploración libre de diarios en el mismo aparato, separados por al menos 2 horas, a partir de las 24 horas después de la prueba para la adquisición. El tiempo pasado en todas las cámaras de nuevo debe ser registrada y la magnitud de la CPP inicial debe ser comparado con el de cada sesión de extinción. </li><li> Determinar si los ratones han apagado la preferencia inducida por medicamentos, evaluando si la preferencia por un parparticular a través de la cámara de dos días consecutivos de extinción es significativamente menor en comparación con la puntuación de preferencia de adquisición. </li><li> Restablecer los ratones con una dosis de cebado de la cocaína (5 ó 10 mg / kg, ip) y volver a exponer al aparato que permite la exploración libre y registrar el tiempo empleado en cada compartimiento. </li><li> Administrar solución de la eutanasia Euthasol (150 mg / kg). Transcardially perfundir ratones con 4% de paraformaldehído (PFA) y le realizará un examen histológico para validar la colocación correcta microinyección. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Regional-y la ablación génica temporal específica mediante microinyección estereotáxica de vectores virales combinadas con CPP, que incluye las fases de extinción y reintegro posibilite la investigación de las contribuciones específicas de genes en tres fases distintas de comportamiento adictivo similar. Mientras knockout condicional que se logra utilizando el sistema Cre-loxP tradicional prevé espacio-temporalmente la ablación génica restringidos, estereotáxicamente microinyección Cre-recombinasa en áreas discretas del...

La cocaína es un psicoestimulante altamente de refuerzo. Después de la exposición repetida, varias adaptaciones moleculares y celulares que ocurren en la recompensa correspondiente circuitos del cerebro que se cree que resulta en compulsiva búsqueda de drogas, lo que provocó altas tasas de recaída que representan un grave problema clínico 1. La cocaína ejerce estos efectos en el comportamiento de larga duración mediante la regulación de la expresión génica. Para estudiar las adaptaciones que surgen del uso crónico de la cocaína, modelos de roedores preclínicos se han utilizado ampliamente. Uno de estos modelos es el lugar de preferencia paradigma condicionado (CPP). Este modelo implica el desarrollo de una asociación entre un medio ambiente aprendido previamente neutro y las propiedades de recompensa de la cocaína. Después de varias parejas de cocaína con una cámara en particular, los animales se les permite explorar libremente los entornos de cocaína apareadas y no apareadas cocaína y si prefieren el compartimiento de las drogas de pares, que se dice que han adquirido una plac inducida por cocaínapreferencia de correo. Por otra parte, después de un período de entrenamiento de extinción, este paradigma se puede utilizar para estudiar el restablecimiento contexto específico de la cocaína de la conducta de búsqueda. En comparación con otros modelos de comportamiento de comportamiento adictivo-como, tales como la sensibilización psicomotora, que se utiliza para estudiar a largo plazo inducida por la cocaína y la plasticidad de comportamiento molecular de 2,3 y la auto-administración (SA), que se cree que con más precisión imitan adictivo un comportamiento similar se encuentra en los seres humanos, el paradigma CPP es un procedimiento simple para estudiar la cocaína aprendizaje contextual 4. Protocolos de CPP pueden ser convenientemente ampliarse para incluir la extinción y fases de reintegro, al igual que SA, que permiten la investigación de los mecanismos que subyacen ansia por la droga y la recaída 5-7 y que se cree que recapitular los aspectos de lo que ocurre en el hombre la búsqueda de drogas y el narcotráfico - y cue-inducida recaída 8-10. Un mecanismo que subyace a lainducido por cocaína plasticidad de comportamiento que es característico de cada una de las distintas fases de la CPP, incluyendo la adquisición, la extinción, y el restablecimiento, es la activación de firmas únicas de la expresión de genes dentro de las diferentes regiones del cerebro. Para probar directamente que los genes dentro de las regiones cerebrales relevantes para mediar recompensa inducido por cocaína cambios de comportamiento, es útil ser capaz de manipular de forma selectiva de una manera regionalmente específica. Una forma de lograr esto es a microinject recombinantes vectores virales adenoasociados (rAAV) que expresan la recombinasa Cre utilizando la cirugía estereotáxica, en distintas áreas del cerebro de ratones que tienen genes diana flanqueado por sitios LoxP (ratones floxed). Este método permite un control temporal y regional muy preciso sobre el momento y donde los genes se realiza la ablación, tanto en neuronas que dividen y que no se dividen, sin inducir respuestas inmunes 11-13. Este nivel de control representa una importante ventaja sobre la tecnología tradicional Cre-loxP de criar ratones floxed with ratones que expresan la recombinasa Cre bajo el control de un promotor de gen endógeno, en el que el tiempo y distribución de supresión de genes pueden ser reguladas con más fuerza. Además, viral génica mediada por vectores evita posibles efectos compensatorios de desarrollo que pueden producirse utilizando estrategias knockout tradicionales. En adición a la cocaína CPP, que se describe aquí, la microinyección de rAAV-Cre en el cerebro de los ratones floxed para evaluar el papel de los genes específicos se puede aplicar ubicua a paradigmas de comportamiento que implican fases separadas, incluyendo la auto-administración y la sensibilización psicomotora. Por ejemplo, nuestro laboratorio ha utilizado la tecnología de rAAV-Cre para estudiar el papel de Ca v 1.2 2 canales tipo L de Ca + en cocaína sensibilización psicomotora 14. Específicamente, rAAV-Cre se microinyectó en el núcleo accumbens (NAc) de ratones con el gen que codifica Ca v 1.2 floxed, para demostrar que el Ca v </sub&gt; 1,2 actuando en esta región interviene en la fase de expresión de la sensibilización psicomotora 14,15. Sin embargo, la estrategia de rAAV-Cre no se puede utilizar si no existen ratones con un gen floxed de interés, como fue nuestra experiencia cuando la evaluación de la función de Ca v 1.3 2 canales de tipo L Ca + en la sensibilización psicomotora. Por lo tanto, una limitación de la utilización de rAAV-Cre se presenta si los ratones condicionales no existen para un gen particular de interés. Sin embargo, rAAVs que expresan siRNA se puede utilizar para los genes diana desmontables, como lo hemos hecho para examinar el papel de Ca v 1.3 canales 14,15. Microinyección de rAAV-Cre en regiones discretas del cerebro de ratones floxed y luego ponerlos a prueba en el paradigma de la CPP permite la investigación de los genes específicos que median en las diversas fases de comportamiento adictivo-como y donde están actuando. El uso de este paradigma ha ayudado en nuestra comprensión de cómo la administración repetida de cocaína, en esencia, secuestra el brains circuito de recompensa causando cambios inadaptadas en las vías de transducción de señales moleculares y la expresión génica que conducen al estado de adicción 1,16,17.

<table><tbody><tr><td>Cámaras de actividad de preferencia de lugar acondicionado</td><td>Med Associates, Inc., St. Albans, VT, EE. UU.</td><td>MED-CPP-MS</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de alineación estereotáxica para ratón</td><td>David Kopf Instruments, Tujunga, CA, EE. UU</td><td>. jeringas Hamilton modelo 900</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hamilton Company, Reno, Nevada, EE. UU.</td><td>7634-01</td><td></td></tr><tr><td>rAAV2-Cre-GFP</td><td>Vector BioLabs, Filadelfia, PA, EE. UU</td><td>. 7016</td><td></td></tr><tr><td>Vector rAAV2-GFP</td><td>BioLabs, Filadelfia, PA, EE. UU</td><td>. 7004</td><td></td></tr></tbody></table>

la microinyección estereotáxica de vectores virales que expresan cre recombinasa para estudiar el papel de los genes diana de cocaína acondicionado place preferencia

Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

Microinyección recombinante vectores virales adenoasociados (rAAV) que expresan la recombinasa Cre en distintas regiones del cerebro del ratón se convierte selectivamente genes knockout de interés permite un mejor control temporal y regionalmente específica de supresión de genes, en comparación con los métodos existentes. Mientras que la supresión condicional también se puede lograr por los ratones de apareamiento que expresan la recombinasa Cre bajo el control de promotores de genes específicos con ratones que portan un gen floxed, microinyección estereotáxica permite la selección de las zonas discretas del cerebro en puntos de tiempo experimentador-determinadas de interés. En el contexto de la cocaína lugar acondicionado preferencia, y otros paradigmas de comportamiento cocaína tales como la auto-administración o sensibilización psicomotora que puede implicar la retirada, extinción y / o fases de reinstalación, esta técnica es particularmente útil en la exploración de la contribución única de los genes diana a estos distintos fases de los modelos de comportamiento de plasticidad inducida por la cocaína. Específicamente,esta técnica permite la ablación selectiva de los genes diana durante las fases discretas de un comportamiento a prueba su contribución al comportamiento a través del tiempo. En última instancia, este conocimiento permite terapias más específicas que están en mejores condiciones para hacer frente a los factores de riesgo más potentes que se presentan durante cada fase de la conducta adictiva.

CPP Después de realizar CPP en ratones microinyectados, se debe verificar que la cohorte de control de inyección de (rAAV-GFP) ratones han adquirido normalmente preferencia por la cámara de drogas emparejado (Figura 1A, 1B). Los ratones se considera que han adquirido preferencia por una cámara en particular cuando preferencia cocaína (tiempo de permanencia en la cámara de la cocaína de pares de menos tiempo de permanencia en la cámara de solución salina-emparejado) es significa...

En este artículo se describe cómo microinject vectores virales en el cerebro del ratón y luego probar en un paradigma de preferencia un lugar acondicionado que incluye una fase de adquisición, extinción y reintegro.

La microinyección estereotáxica de vectores virales que expresan Cre recombinasa para estudiar el papel de los genes diana de cocaína acondicionado Place Preferencia

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

El objetivo general de este procedimiento es ablacionar selectivamente genes diana durante fases discretas del paradigma de preferencia por el lugar condicionado para evaluar su contribución a este comportamiento a lo largo del tiempo. Esto se logra primero mediante la microinyección estereotáxica del vector viral asociado al eno recombinante que expresa la recombinasa Cree. A continuación, se permite que los ratones se recuperen en su jaula de alojamiento durante 10 a 14 días para lograr una reactivación máxima de C.El tercer paso del procedimiento consiste en evaluar a los ratones en la preferencia condicionada por el lugar, incluyendo las fases de adquisición, extinción y recuperación espontánea. El paso final del procedimiento es realizar un examen histológico de los ratones microinyectados para validar la colocación correcta de la microinyección. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren cambios en el comportamiento de adquisición, extinción y/o recuperación espontánea en respuesta a la interrupción génica mediante la prueba conductual de preferencia condicionada por el lugar.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el sistema de apareamiento CRE lock P es que permite un control más específico en el tiempo y una mayor especificidad anatómica del silenciamiento génico de forma discreta, lo que posibilita investigar la pérdida del gen en cada fase del comportamiento. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento del comportamiento adictivo, ya que implican una mejor comprensión de la base genética que podría subyacer a cómo la exposición a estímulos contextuales puede desencadenar recuerdos relacionados con la cocaína, los cuales podrían provocar antojos y recaídas en los adictos. Para comenzar, coloque una jaula con cama sobre una plataforma calefactora para calentarla y así prepararla para la recuperación postoperatoria.Prepare una afeitadora eléctrica para afeitar la cabeza, así como etanol y yodo para esterilizar el cuero cabelludo. Use etanol al 70 % para limpiar las barras oticas y el soporte bucal del estereotáxico utilizando una jeringa Hamilton de cinco microlitros. Aspire cinco microlitros de vector viral y colóquela en un porta-jeringas sobre el estereotáxico.Coloque una almohadilla calentada en el microondas o una almohadilla eléctrica sobre el estéreoatacador después de inyectar al ratón una inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina y xilacina. Según el protocolo descrito, realice una compresión en la cola para verificar el nivel de sedación. A continuación, afeite la cabeza entre las orejas y los ojos y utilice aplicadores estériles de algodón para limpiar la zona con lavados alternados de etanol y yodo.Luego transfiera el ratón a la almohadilla calentada sobre el estereotáxico. Coloque las escalas de la barra dental y las barras auriculares y sitúe los dientes del ratón en la barra dental; atornille la bozal y las barras auriculares. Si se observa algún movimiento o temblor de los bigotes.Administre una dosis de refuerzo de la mezcla de ketamina y xilacina. A continuación, lubrique los ojos para evitar que se sequen. Después, con un corte realizado con bisturí, abra el cuero cabelludo hasta detrás de las orejas.Coloque clips de cocodrilo en las esquinas del cuero cabelludo para separar la piel del cráneo. Asegúrese de que Bgma y Lambda sean fácilmente visibles. Verifique que la sutura desde bgma hasta Lambda esté alineada y reposicione la cabeza si es necesario.Después de confirmar que los ajustes de ataque estéreo están en cero, coloque la punta de la aguja en su lugar en el bma. Mida las coordenadas dorsal-ventral, medial-lateral y anterior-posterior tanto para el bma como para lambda. Luego, ajuste la cabeza hasta que las coordenadas ventrales del bma y de lambda estén dentro de 0,02 milímetros entre sí.Vuelva a centrar la punta de la aguja sobre bgma, y desde ese punto muévala en dirección anterior-posterior hasta la coordenada deseada. A continuación, perfore un orificio en la coordenada deseada. Verifique que la aguja pueda penetrar sin interrupciones por el cráneo, luego baje la aguja hasta la coordenada ventral deseada.Una vez alcanzada la coordenada, introduzca 0,015 milímetros por debajo de esta durante aproximadamente 10 segundos para crear un pequeño bolsillo para el vector viral a un ritmo de aproximadamente 0,1 microlitros por minuto; inyecte el volumen deseado de vector viral tras esperar tres minutos para permitir la difusión del vector viral, eleve la punta de la aguja 0,015 milímetros y espere dos minutos adicionales. Cuando las inyecciones hayan finalizado, aplique cera ósea para sellar ambos orificios y luego sutúre el cuero cabelludo. Finalmente, aplique un bloqueo nervioso en la zona lesionada.Retire el ratón del estereotáctico y colóquelo en una jaula caliente sobre un bloque calefactor para que se recupere durante 45 minutos a una hora. Deje que el ratón se recupere durante al menos 10 días para permitir una reactivación máxima. Proporcione al animal agua y alimento blando, y buprenorfina dos veces al día si es necesario para aliviar el dolor tras la recuperación; coloque los ratones en la cámara central de un aparato de preferencia por lugar de tres cámaras para un período de habituación de 62 segundos con las puertas guillotina cerradas.Después de la habituación, abra las puertas de guillotina y permita que los ratones exploren libremente las tres cámaras durante 1200 segundos. Utilice el software Med PC versión cuatro para registrar el tiempo que los animales pasan en cada cámara, siguiendo las pautas del protocolo escrito. Asigne a los ratones a las cámaras de condicionamiento según su desempeño durante la prueba previa.Durante los próximos tres días, inyecte 10 miligramos por kilogramo de cocaína durante una sesión matutina y coloque inmediatamente a los animales en su cámara asignada durante 1200 segundos. Devuelva a los ratones a sus jaulas de origen durante cuatro horas, luego inyéctelos con solución salina y confínelos inmediatamente a la cámara opuesta durante 1200 segundos. Para evaluar la adquisición, coloque a los ratones en la cámara central con las puertas guillotina cerradas durante un período de habituación de 62 segundos.Abrir las puertas de guillotina y permitir la exploración libre durante 1200 segundos o la grabación. El tiempo transcurrido en todas las cámaras se calcula para determinar la preferencia, restando el tiempo empleado en la cámara con solución salina del tiempo empleado en la cámara con cocaína. Tras realizar el CPP en ratones con microinyecciones, se considera que han adquirido preferencia por una cámara determinada.Cuando la preferencia por la cocaína, definida como el tiempo pasado en la cámara emparejada con cocaína menos el tiempo pasado en la cámara emparejada con solución salina, es significativamente mayor en comparación con la puntuación de preferencia basal. Si, como control de cohorte, los ratones inyectados no muestran preferencia por la cámara emparejada con cocaína o muestran aversión, la colocación se verifica inmediatamente mediante histología, y aquellos ratones con colocación incorrecta se eliminan del estudio. Si el control inyectado adquiere normalmente la preferencia, el paradigma se extiende iniciando la extinción.Se considera que los ratones han extinguido la preferencia inducida por la droga hacia una cámara específica. Cuando la preferencia por la cocaína en dos días consecutivos de extinción es significativamente menor en comparación con la puntuación de preferencia durante la adquisición, se puede realizar una reinstauración mediante un impulso farmacológico. Si la puntuación de preferencia tras la administración del impulso farmacológico no es estadísticamente diferente a la de la adquisición, entonces se dice que ese grupo ha reinstaurado la preferencia inducida por la droga hacia la cámara asociada a la droga mediante PCR cuantitativa.Esta figura demuestra que el gen de interés ha sido efectivamente eliminado en ratones microinyectados tras la microinyección de RAAV Cree GFP en el núcleo accumbens que posee el isoforma del canal de calcio tipo L, CAV 1.2 flocks de RAAV. Los fragmentos de tejido inyectados con Cree muestran una disminución significativa en la expresión génica en comparación con los ratones inyectados con A-A-V-G-F-P mostrados aquí. El análisis inmunohistoquímico del núcleo accumbens para GFP revela una colocación bilateral adecuada de RAAV Cree microinyectado tras este procedimiento.Otras técnicas como la PCR cuantitativa en tiempo real y el Western blotting pueden realizarse para responder preguntas sobre el efecto del silenciamiento de un gen en los niveles de expresión de otros genes de interés. Después de ver este video, deberías tener una mejor comprensión de cómo ablacionar selectivamente genes diana en el cerebro del ratón utilizando vectores virales inyectados por microinyección estereotáxica, con el fin de probar selectivamente el papel de estos genes en la adquisición, extinción y reinstauración del paradigma de preferencia condicionada por lugar.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

Fuente: Chen, S., et al., Cirugía estereotáxica para la manipulación genética en células estriatales de cerebros de ratones neonatales. J. Vis. Exp. (2018)Este video demuestra la inyección estereotáxica de un vector viral que codifica la recombinasa Cre y la proteína de fluorescencia verde o GFP en el cuerpo estriado de un cachorro de ratón modificado genéticamente para lograr la manipulación génica mediante la extirpación de un casete STOP flanqueado por loxP, activando la proteína de...

Microinyección estereotáctica de un vector viral para la manipulación génica en un cachorro de ratón estriado

Fuente: Pereira, M. et. al., Reprogramación directa in vivo de células gliales residentes en interneuronas mediante inyección intracerebral de vectores virales. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra la inyección estereotáxica de un virus adenoasociado en la corteza cerebral de un ratón transgénico para administrar genes reporteros fluorescentes y de reprogramación neuronal dependientes de Cre en células gliales.

Inyección estereotáxica de vectores virales para la reprogramación de células gliales en un modelo de ratón

Fuente: Fricano-Kugler, C. J., et al. Diseño, envasado y entrega de retro y lentivirus CRISPR de alto título mediante inyección estereotáxica. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra la inyección viral estereotáxica para una edición precisa de genes neuronales en el cerebro del ratón. El protocolo garantiza la administración precisa del virus a la circunvolución dentada, lo que permite el etiquetado fluorescente y la eliminación de genes mediada por CRISPR para estudiar los circuitos...

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Los vectores virales permiten la manipulación dirigida de genes. Se demuestra un método para la expresión génica condicional o ablación en la médula espinal de ratón, usando inyección estereotáxica de un vector viral en el asta dorsal, un sitio prominente de contacto sináptico entre las vías aferentes somatosensoriales y las neuronas del sistema nervioso central.

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Ex Vivo Optogenética Disección de circuitos del miedo en rodajas de cerebro

El sistema / Cas9 CRISPR ofrece el potencial para que la edición del genoma específico accesible y asequible para la comunidad científica. Este protocolo está destinado a demostrar cómo crear virus que Knockout un gen de interés utilizando el sistema / Cas9 CRISPR y, a continuación, inyectarlos estereotáxica en el cerebro del ratón adulto.

Proyectos, Embalaje y Entrega de alto título de CRISPR Retro y lentivirus vía estereotáxica Inyección

Se describe un protocolo de cirugía estereotáctica con un dispositivo casero hecho de cabeza fija de reactivos microinjecting en el cuerpo estriado del cerebro de ratón neonatal. Esta técnica permite la manipulación genética en las células neuronales de regiones específicas del cerebro de ratón neonatal.

Cirugía estereotáctica para manipulación genética en las células estriatales de cerebro de ratón Neonatal

Los métodos descritos aquí describen un procedimiento utilizado para revertir optogenéticamente la plasticidad inducida por la cocaína en un circuito conductualmente relevante en ratas. La estimulación óptica sostenida de baja frecuencia de las sinapsis tálamo-amígdala induce depresión a largo plazo (LTD). La LTD inducida optogenéticamente in vivo en ratas experimentadas con cocaína resultó en la posterior atenuación de la búsqueda de drogas motivada por señales.

Uso de la optogenética para revertir la neuroplasticidad e inhibir la búsqueda de cocaína en ratas

Aprende microinyección estereotáxica de vectores virales con Cre recombinasa en ratones para estudiar genes en la preferencia de lugar condicionada. Este método permite analizar fases de adquisición, extinción y reinstauración del comportamiento.

La microinyección estereotáxica de vectores virales que expresan Cre recombinasa para estudiar el papel de los genes diana de cocaína acondicionado Place Preferencia (Video) | JoVE Journal

La microinyección estereotáxica de vectores virales que expresan Cre recombinasa para estudiar el papel de los genes diana de cocaína acondicionado Place Preferencia

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