Name: Aislamiento de Miofibroblastos primarias de ratón y el tejido del colon humano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Aprende a aislar miofibroblastos primarios de colon de ratón y humano mediante digestión enzimática y cultivo celular. Este método permite estudiar la biología de células estromales en investigación gastrointestinal.

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Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud Grant 5KO8DK085136-02 a JY.

1. Obtener el tejido del colon Ratón Un protocolo para llevar a cabo experimentos con animales, que detalla los fundamentos y objetivos de la investigación, fue presentado y aprobado por nuestra oficina institucional de Investigación Animal de Supervisión. <ol><li> La eutanasia del ratón con isoflurano inhalado seguido por dislocación cervical. </li><li> Haga una incisión en la línea media ventral, retraer el intestino delgado de distancia e identificar el colon. Repliegue la vejiga y el útero (si existe) lateralmente e identificar el hueso púbico y cortar con tijeras finas para exponer el recto. </li><li> Diseccionar el mesenterio dorsal del recto fuera del colon y movilizar el colon desde el ano hasta el ciego, y seccionar para desenchufar el colon desde el intestino delgado. </li><li> Coloque la muestra en solución salina tamponada con fosfato enfriada con hielo (PBS). </li><li> Llene una jeringa de 10 ml con PBS enfriado con hielo y lavar el colon luz varias veces para borrar su contenido, a continuación, cortar la opa de colonn en sentido longitudinal con tijeras. </li><li> Coloque el colon en un tubo cónico de 50 ml que contiene 20 ml de PBS enfriado en hielo. El colon no tiene que ser colocado en cualquier orientación particular. Lave el colon mediante la sustitución de la PBS hasta que el líquido es transparente, sin partículas. </li></ol> Humano Un protocolo para obtener tejido humano de pacientes quirúrgicos, detallando la importancia de la obtención de este tejido, así como una evaluación de los riesgos y beneficios potenciales, fue presentado y aprobado por nuestra oficina institucional del Programa de Protección de la Investigación Humana. <ol><li> Colaboración de investigación con un cirujano colorrectal es necesario ser capaz de obtener tejidos humanos para su investigación. Un protocolo para obtener tejido del colon humano debe ser presentado y aprobado por la junta de revisión institucional. </li><li> Escrito el consentimiento informado se obtuvo a partir de la paciente antes del procedimiento quirúrgico. </li><li> El cirujano realizará una resección de colon en el standmoda ard. Una vez que el colon se ha retirado del paciente, el espécimen es llevado inmediatamente a la patología. Un 0,5 en la sección de espesor total de la pared del colon que no sea necesario para la evaluación patológica se proporciona y se coloca inmediatamente en helado de PBS. Este espécimen no debe incluir el mesenterio del colon y apéndices epiploicos debe retirar también, ya que la presencia de grasa va a afectar el proceso de la digestión. </li></ol> 2. Dénudé células epiteliales <ol><li> Incubar toda la colon de ratón en 25 ml de EDTA 5 mM en HBSS (temperatura ambiente) en un tubo cónico de 50 ml. Colocar el tubo cónico en un C agitando baño de aire 37 ° (250 rpm) durante 15 min. Después de 15 minutos, se vierte con cuidado el líquido y vuelva a llenar el tubo con 25 ml de EDTA 5 mM, repita para un total de 5 lavados. Para colon humano, después de obtener una tira de ½ pulgada de la pared del colon del patólogo cortar el colon con tijeras en cuatro trozos de igual tamaño. Coloque dos de las piezas en un tubo cónico de 50 ml, y secolocar las dos piezas restantes de tejido de colon en un tubo cónico de 50 ml separado. A continuación, se incuba con 25 ml de EDTA 5 mM en HBSS y realizar lavados, como se describe anteriormente. </li><li> Enjuague el colon dos veces en 20 ml de PBS enfriado en hielo. </li><li> Coloque el tejido de colon de ratón en un nuevo tubo cónico de 50 ml que contiene 20 ml de medio RPMI-5, 10 U de dispasa, y 2000 U de colagenasa D (temperatura ambiente). Para el tejido del colon humano, utilice el doble de la cantidad de dispasa y colagenasa (20 U dispasa, 4.000 U de colagenasa D). </li><li> Coloque el tubo en un baño de aire 37 ° C agitando orientada verticalmente (Si se coloca horizontalmente, hay demasiada aireación y daño celular). Agitar a 250 rpm durante un máximo de 60 min. Después de la exposición a la dispasa y colagenasa D, el tejido del colon se iniciará de digerir y el tejido del colon se comenzará a verse fibrosa. Esto por lo general toma alrededor de 30 minutos. Cuando el colon tiene esta apariencia, extirpar el colon de las enzimas. </li><li> Agitar cada tubo hacia arriba y abajo 2-4 veces para romper el tejido. PEllet el tejido a 200 xg en una centrífuga de mesa (4 ° C) durante 5 min. Vierta cuidadosamente el sobrenadante y deséchelo. </li></ol> 3. Aislamiento miofibroblastos y Cultura <ol><li> Resuspender cada sedimento mediante la adición de 10 ml de tampón de lisis ACK (47 ° C). Centrifugar de nuevo a 200 xg durante 5 minutos (4 º C), verter y desechar el sobrenadante. </li><li> Resuspender cada sedimento mediante la adición de 10 ml de RPMI-5 con una pipeta. </li><li> Pase medio de la suspensión de células (5 ml) a través de un colador de malla 70 micras utilizando una pipeta de 10 ml en una placa de TC tratados con 100 mm. A continuación, añadir otros 15 ml de RPMI-5. Repita el procedimiento con los 5 ml restantes de la suspensión celular en una placa de 100 mm TC-tratada diferente. Por lo tanto, uno de colon de ratón producirá dos platos TC tratados 100 mm. Una tira de ½ pulgada de tejido de colon humano producirá un total de cuatro platos TC-tratada de 100 mm. </li><li> Coloque las placas de cultivo de tejidos en una incubadora de CO2 un 10% a 37 ° C. Las condiciones de cultivo son los mismos fo el ratón y células humanas primarias. </li><li> Después de 3 horas, lavar suavemente las células no adherentes con dos cambios de HBSS. La flotación de escombros se debe lavar suavemente. Las células adherentes se componen de células epiteliales, macrófagos y miofibroblastos. Una semana después de la siembra, sólo miofibroblastos brecha, macrófagos y células epiteliales entran en senescencia después de la primera paso. Añadir fresco RPMI-5 y crecer las células en cultivo celular. </li><li> Las células se pasaron por tratamiento con tripsina durante 5 min y se dividen 2:01. </li></ol> Abreviaturas HBSS: solución salina equilibrada de Hank; RPMI-5: Medios de Roswell Park Memorial Institute; ACK: amonio-cloruro y potasio; FCS: suero fetal de ternero; TC-tratada: el cultivo de tejidos tratados Soluciones Tampón de lisis ACK - (4,15 g NH 4 Cl, 0,5 g de KHCO3, 18,6 mg de Na 2 EDTA, 400 ml de H2O, ajustar el pH a 7.2 a 7.4 con HCl 1 N). Esterilizable Filtroelectrónico a través de un filtro de 0,2 micras y se almacenan a 4 ° C. RPMI-5 - (para hacer 500 ml: 454,5 ml RPMI, 25 ml de FCS, 5 ml de 200 mM L-glutamina, 5 ml 1 M HEPES, pH 7,4, 5 ml piruvato de sodio 100 mM, 5 ml 100x Pen-Strep, 500 ml 50 mM B-ME en PBS).

<ol><li>Armaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cell+targeting+by+TNF+as+a+common+pathogenic+principle+in+chronic+inflammatory+joint+and+intestinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases.</a> J. Exp. Med. 205, 331-337 (2008).</li>
<li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+cells+important+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Paracrine cells important in health and disease.</a> Am. J. Physiol. 277, C1-C9 (1999).</li>
<li>Yoo, J., Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+D1+mediates+synergistic+MMP-3+expression+induced+by+TNF-alpha+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Protein kinase D1 mediates synergistic MMP-3 expression induced by TNF-alpha and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 30-35 (2011).</li>
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<li>De Wever, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming+and+potentiation+of+DNA+damage+response+by+fibronectin+in+human+colon+cancer+cells+and+tumor-derived+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Priming and potentiation of DNA damage response by fibronectin in human colon cancer cells and tumor-derived myofibroblasts.</a> Int. J. Oncol. 39, 393-400 (2011).</li>
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<li>Hoang, B., Trinh, A., Birnbaumer, L., Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+MAPK-+and+PGE2-dependent+IL-11+production+in+Gialpha2-%2F-+colonic+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Decreased MAPK- and PGE2-dependent IL-11 production in Gialpha2-/- colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292, G1511-G1519 (2007).</li>
<li>Li, Z. B., Kollias, H. D., Wagner, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myostatin+directly+regulates+skeletal+muscle+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Myostatin directly regulates skeletal muscle fibrosis.</a> J. Biol. Chem. 283, 19371-19378 (2008).</li>
<li>Saada, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subepithelial+myofibroblasts+are+novel+nonprofessional+APCs+in+the+human+colonic+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa.</a> J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).</li>
<li>Lahar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+subepithelial+myofibroblasts+support+in+vitro+and+in+vivo+growth+of+human+small+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intestinal subepithelial myofibroblasts support in vitro and in vivo growth of human small intestinal epithelium.</a> PLoS One. 6, e26898(2011).</li>
</ol>

Los autores tienen nada que revelar.

La técnica general es similar cuando se utiliza el ratón o de colon humano. Esta técnica también se puede utilizar para aislar miofibroblastos en el intestino delgado. Los detalles específicos para el aislamiento de miofibroblastos de 1. ratón y 2. colon humano se discuten a continuación. 1. Ratón Colon Irrigación del colon de ratón se facilita uniendo un 4 en, 16 G Popper aguja de extremo romo a un extremo del colon. Esto también ayuda al cortar el colon longitudin...

La regulación de la función del tracto gastrointestinal (GI), implica complejas interacciones dinámicas entre la capa de la mucosa y su mesénquima subyacente. Estas interacciones normalmente sirven para mantener la homeostasis, pero también puede conducir al desarrollo de enfermedades en condiciones patológicas 1. Los miofibroblastos son una subpoblación de células del estroma situado subyacente a la capa epitelial que se comunican de una manera paracrina y la zona subpoblaciones de células para regular una serie de procesos del tracto GI críticos que incluyen la regeneración de la mucosa, la reparación, y la fibrosis 2. La línea celular 18Co es un ejemplo de una línea celular humana de colon miofibroblastos que ha sido ampliamente utilizado para estudiar la función de miofibroblastos ya que comparte muchas de las características de primaria en miofibroblastos in situ. Estos incluyen la expresión de la proteína de un liso-actina de músculo (α-SMA) y vimentina, así como la expresión de un númerode receptores de la superficie celular tales como el receptor del factor de crecimiento epidérmico, o receptores para el ácido 3,4 lisofosfatídico. Debido a estas características ultraestructurales comunes, así como similitudes en la función biológica 5, la línea celular de 18Co se ha utilizado ampliamente para estudiar la función de miofibroblastos en el contexto de muchos estados de enfermedad tales como la enfermedad inflamatoria intestinal o 3,6 cáncer colorrectal. Sin embargo, hay limitaciones inherentes y preocupaciones al utilizar una línea celular. Estos incluyen la inestabilidad genotípica con el tiempo que diferencia líneas celulares a partir de células primarias, alterando el fenotipo y la función biológica de la célula, incluyendo las tasas de crecimiento y las interacciones con otras poblaciones celulares. Las líneas celulares también carecen de los componentes normales de la microambiente GI (epitelial, estromal, y componentes vasculares), que es una limitación importante para su uso. Por lo tanto, las conclusiones extraídas de la investigación experimental línea celular requiere una validación adicional de rsk de una mala interpretación. Miofibroblastos primarias pueden ser obtenidas a partir de tejido de colon humano y el ratón para confirmar los hallazgos experimentales identificados en una línea celular 7. El método fue descrito originalmente por Mahida, et al. 8, y el protocolo es una de las muchas técnicas bien descritos que se pueden utilizar para aislar miofibroblastos primarios de ratón y de colon humano 9. Para cualquier modelo de ratón de la enfermedad colónica, esta técnica se puede utilizar para aislar miofibroblastos primarias para estudiar cómo interactúan con las células vecinas o contribuir a tanto normal o patológica GI procesa 10,11. Esta técnica se puede utilizar para estudiar cómo miofibroblastos contribuyen a la curación de la mucosa, la fibrosis, y el desarrollo de los adenomas y carcinomas colorrectales. Miofibroblastos primarios también se pueden obtener a partir de tejido de colon humano que ha sido resecado en el momento de la operación de (enfermedad inflamatoria del intestino, estenosis, diverticulitis) benigno o maligno Condiciones. Células primarias aisladas de tejido de colon humano y de ratón se pueden cultivar en cultivo celular y se utilizan en un número limitado de pasajes.

<table><tbody><tr><td>Nombre del reactivo</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios (opcional)</td></tr><tr><td>Dispasa I</td><td>Invitrogen/GIBCO</td><td>#17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa D</td><td>Roche</td><td>#1 088 858</td><td></td></tr><tr><td>4 in, 16 G Aguja roma Popper</td><td>Fisher</td><td>#14-825-16K</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de miofibroblastos primarias de ratón y el tejido del colon humano

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

El miofibroblastos es una célula estromal del tracto gastrointestinal (GI) que ha ido ganando considerable atención por su papel crítico en muchas funciones gastrointestinales. Mientras que varias líneas celulares myofibroblast están disponibles comercialmente para estudiar estas células in vitro, los resultados de investigación desde una línea de células expuestas a condiciones experimentales de cultivo de células tienen limitaciones inherentes debido a la naturaleza excesivamente reduccionista de la obra. El uso de miofibroblastos primaria ofrece una gran ventaja en términos de confirmación de los hallazgos experimentales identificados en una línea celular. Aislamiento de miofibroblastos primarios a partir de un modelo animal permite el estudio de los miofibroblastos en condiciones que imitan más estrechamente se estudió el estado de enfermedad. Aislamiento de miofibroblastos primarios de tejido del colon humano ofrece sin duda los datos experimentales más relevantes, ya que las células vienen directamente de los pacientes con la enfermedad de base. Se describe una técnica bien establecida que puede ser utilized aislar miofibroblastos primarias de ratón y el tejido del colon humano. Estas células aisladas se han caracterizado a ser actina alfa del músculo liso y vimentina-positivo, y negativo-desmina, consistente con los miofibroblastos subepiteliales intestinales. Células miofibroblastos primarias se pueden cultivar en cultivo celular y se utilizan para fines experimentales más de un número limitado de pasajes.

Una vez aislado, miofibroblastos humanas primarias se pueden cultivar en cultivo celular y se utilizan en un número limitado de pasajes (hasta el paso 4). Estas células se caracterizan por ser un suave-actina y vimentina positivo muscular, y desmina-negativo (Figura 1A), en consonancia con los miofibroblastos subepiteliales intestinales 5,7. También tienen una morfología estrellada característica (Figura 1B). Miofibroblastos primarias se pueden utilizar para confirmar los hal...

El miofibroblastos es una célula estromal influyente del tracto gastrointestinal que regula importantes procesos fisiológicos en los estados tanto normales y de enfermedad. Se describe una técnica que permite el aislamiento de miofibroblastos primarios de ratón y tejido de colon humano, que puede ser utilizado para la experimentación in vitro.

Aislamiento de Miofibroblastos primarias de ratón y el tejido del colon humano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar miofibroblastos primarios a partir de tejido de colon de ratón o humano. Esto se logra primero obteniendo el colon del ratón donante y enjuagándolo con PBS frío con hielo. A continuación, las células epiteliales se eliminan mediante una serie de lavados y tratamientos enzimáticos.Luego, la suspensión de células epiteliales se siembra en placas de cultivo celular y se deja incubar. Finalmente, se lavan las células no adherentes para aislar los miofibroblastos. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren el aislamiento de células de miofibroblastos primarios mediante tinción inmunohistoquímica. El procedimiento lo demostrará, compartiendo, ¡sí!, una técnica de mi laboratorio.Todos los experimentos fueron aprobados por la Oficina de Supervisión de Investigación con Animales de la Universidad de California utilizando un ratón que fue sometido a eutanasia con isoflurano inhalado, seguido de dislocación cervical. Comience realizando una incisión media ventral. Retraiga el intestino hacia un lado y localice el colon, retraiga la vejiga lateralmente e identifique el hueso púbico utilizando tijeras finas.Corte el hueso p

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Biología

Los principales tipos de células adherentes derivadas del músculo humano son las células miogénicas y los fibroblastos. Aquí, las poblaciones celulares se enriquecen mediante la clasificación de células activadas magnéticamente basadas en el antígeno CD56. El posterior inmunomarcaje con anticuerpos específicos y el uso de técnicas de análisis de imagen permiten cuantificar las características citoplasmáticas y nucleares de las células individuales.

Aislamiento y Caracterización cuantitativa inmunocitoquímica de células miogénicas Primarias y fibroblastos de músculo esquelético humano

Presentamos un protocolo para generar cultivos primarios de células estromales murinas y humanas con un fenotipo de miofibroblastos. Las células cultivadas tienen morfología fusiforme, expresan α-SMA y vimentina, y carecen de marcadores de superficie celular epiteliales, hematopoyéticos y endoteliales. Las células estromales caracterizadas se pueden utilizar en estudios funcionales de las interacciones epitelio-estromales.

Aislamiento de Miofibroblastos de Mouse y Esófago Humano

Se describe un protocolo para extraer células humanas primarias de un tumor de colon quirúrgico y tejidos normales. A continuación, las células aisladas se cultivan en sustratos elásticos blandos (hidrogeles de poliacrilamida) funcionalizados por una proteína de la matriz extracelular e incrustados con microesferas fluorescentes. La citometría de tracción se realiza para evaluar las tensiones contráctiles celulares.

Aislamiento de células tumorales de colon humanos primarios de tejidos quirúrgicos y cultivándolas Directamente en Elastic sustratos blandos de tracción Citometría

Aquí describimos un método simple para el aislamiento de células de la superficie epitelial del colon murino espacialmente distintas de las células de la base de la cripta subyacente.

Método cryosectioning para microdisección de murino mucosa colónica

Aquí, se presenta un protocolo para aislar y establecer cultivos primarios de fibroblastos/miofibroblastos (MF) a partir de células gástricas, del intestino delgado y de colon congeladas productoras de tejido con un fenotipo MF. Estas células expresan CD90, α-SMA y vimentina. Los MF se pueden utilizar para una variedad de ensayos funcionales, incluida la actividad enzimática y la producción de citocinas.

Aislamiento de CD 90+ fibroblastos / miofibroblastos de congelados Humanos gastrointestinales Especímenes

El objetivo de este protocolo es aislar las células mononucleares que residen en la lámina propria del colon mediante la digestión enzimática del tejido utilizando la colagenasa. Este protocolo permite el aislamiento eficiente de las células mononucleares, lo que resulta en una suspensión de una sola célula que, a su vez, se puede utilizar para un inmunofenotipado robusto.

Aislamiento de células mononucleares lamina Propria de Colon Murino usando colagenasa E

Presentamos un protocolo para aislar los fibroblastos adultos primarios de una manera fácil, rápida y confiable, realizable por principiantes (por ejemplo, estudiantes). El procedimiento combina la digestión del tejido enzimático y la agitación mecánica con ondas ultrasónicas para obtener fibroblastos primarios. El protocolo se puede adaptar fácilmente a requisitos experimentales específicos (por ejemplo, tejido humano).

Aislamiento de fibroblastos para adultos primarios aumentados por ultrasonidos

Los mióblastos están proliferando en células precursoras que se diferencian para formar miotubos polinucleados y, finalmente, miofibers musculares esqueléticos. Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento eficiente y el cultivo de mioblastos primarios de los músculos esqueléticos adultos jóvenes. El método permite estudios moleculares, genéticos y metabólicos de las células musculares en el cultivo.

Aislamiento y diferenciación de los mioblastos primarios de los explantes musculares esqueléticos de ratón

La obtención de una población pura de fibroblastos es crucial para estudiar su papel en la reparación de heridas y fibrosis. Aquí se describe un método detallado para aislar fibroblastos y miofibroblastos de corazones de ratón no lesionados y lesionados seguidos de la caracterización de su pureza y funcionalidad por inmunofluorescencia, RTPCR, clasificación celular asistida por fluorescencia, y contracción del gel de colágeno.

Aislamiento y caracterización de fibroblastos cardíacos adultos y miofibroblastos

En este protocolo, describimos cómo generar monocapas epiteliales primarias murine de los dos puntos directamente de criptas intestinales. Proporcionamos enfoques experimentales para generar monocapas confluentes en filtros permeables, monocapas confluentes para la cicatrización de heridas de arañazos y estudios bioquímicos, y monocapas dispersas y confluentes para análisis de inmunofluorescencia.

Generación De Monocapas Epiteliales Murinas Primarias De Colon De Criptas Intestinales

Aquí, presentamos un protocolo para aislar el mesénquima intestinal murino, incluidos los telocitos. Estos se pueden utilizar para varias aplicaciones, como el cocultivo con ratones u organoides derivados de humanos, para apoyar el crecimiento y reflejar mejor la situación en el tejido original.

Aislamiento del mesénquima intestinal murino que resulta en un alto rendimiento de telocitos

Aprende a aislar miofibroblastos primarios de colon de ratón y humano mediante digestión enzimática y cultivo celular. Este método permite estudiar la biología de células estromales en investigación gastrointestinal.

Aislamiento de Miofibroblastos primarias de ratón y el tejido del colon humano

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