Name: Permeabilización de células adheridas Usando un gas inerte Jet (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Aprende a permeabilizar células adheridas usando un jet de gas inerte para transferir biomoléculas y material genético. Este método mecánico ofrece una alternativa eficiente para la biología celular.

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Los autores desean agradecer a las siguientes fuentes de financiación: Canadiense Institutos de Investigación en Salud (CIHR), las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación (NSERC).

1. Desarrollo del programa de LabVIEW <ol><li> Un controlador de flujo másico (MKS M100B misa-Flo Controlador) está unido a la línea de gas de helio para garantizar una velocidad de flujo de gas precisa. Esta unidad es controlada por una tensión de entrada, que oscila entre 0 y 5 V. Un bucle de control en el programa LabView determina el voltaje requerido en cualquier momento dado. Interfaz entre el ordenador y el controlador de flujo de masa se lleva a cabo por un dispositivo de adquisición de datos (NI USB-6009), y una fuente de alimentación de 12 V suministra potencia al controlador de flujo másico. </li><li> Dos diapositivas lineal de posicionamiento se utilizan para controlar el movimiento de la placa de 6 pocillos, una para cada dirección. Cada conjunto se compone de una serie MA15-Velmex Asamblea Unislide junto con un motor paso a paso, y ambos conjuntos están controlados por un único Velmex VXM Stepping Motor Controller. El controlador permite para hacer footing manual de cada motor o acepta una cadena de comandos en serie externos, la combinación de los cuales permitir el movimiento específico patterns. Varios patrones se pueden programar en el programa LabView, que requiere que el usuario proporcione sólo la velocidad de la antorcha deseado, así como las dimensiones de ruta. </li></ol> 2. Preparación de Equipo <ol><li> Abra tanto el cilindro de helio y el regulador. </li><li> Encienda el controlador del motor. </li><li> Abra el programa LabView y verificar todas las condiciones. </li><li> Asegúrese de que la plataforma esté centrada. Para comprobarlo, busque en cada etapa del motor y verificar que cada carro no está cerca de cualquier extremo escenario. Ya sea que el centro del programa de los carros o ajuste manualmente mediante los controles de correr en la parte frontal del controlador de motor. </li><li> Si esta es la primera carrera del día, se recomienda ejecutar el programa una vez y sin células, para asegurar la instalación funciona correctamente. </li></ol> 3. Preparación de la Altura Gas Jet boquilla capilar <ol><li> Quite la capilaridad del soporte y cero el dial de altura. </li><li> Coloque la placa de 6 pocillos on la plataforma. </li><li> Vuelva a colocar y bajar el capilar chorro de gas a la parte inferior del pozo hasta que llega a la hoja de la cubierta. Fije el capilar en el soporte. </li><li> Utilización del dial de altura, levante el capilar 3 mm. Marque esta altura en la base del capilar. </li><li> Levante el capilar a una altura segura y luego retire la placa de 6 pocillos. </li></ol> 4. Celular Protocolo Permeabilización <ol><li> Cultura línea celular adherente a la confluencia de la cubierta de cristal se desliza en una placa de 6 pocillos usando técnicas estándar de cultivo. Para las células HeLa, semillas placas de 6 pocillos con 2 x 10 5 células por pocillo y se incuban durante 48 horas antes del tratamiento. </li><li> Preparar volumen apropiado de solución que contiene el vector deseado. Para hrGFPII-1, una concentración de 50 ng / l en 1x PBS proporciona una señal fluorescente fuerte en células HeLa 24 horas después de la transfección. Para los estudios de dextrano, se recomienda 80 mg / ml de 10 kDa de dextrano fluorescente verde. De ahora en adelante, esta solución será referido a un&quot;La solución vector&quot; s. </li><li> Retire el medio de cultivo de células de bien y enjuáguese la boca tres veces con PBS 1x. </li><li> Pipetear 1.370 l de solución de vector preparado en el paso 4.2 en el pozo. Esto debería dar lugar a una profundidad de líquido de aproximadamente 1,3 mm. </li><li> Coloque el pocillo que contiene la solución del vector en el centro de la plataforma. Baje la boquilla de chorro de gas al nivel previamente marcado que indica una altura de boquilla de 3 mm por encima de la diapositiva. </li><li> Establecer velocidad de flujo de helio en el programa LabView y seleccionar el patrón de movimiento deseado para ser utilizado. Seleccione &quot;Ejecutar&quot; cuando esté listo para comenzar el protocolo de permeabilización. Habrá un período de retraso inicial en que el controlador de flujo de masa se está preparando para dar el caudal necesario. Una vez que se ha alcanzado la velocidad de flujo apropiada, el programa LabView activará los motores paso a paso para mover el bien en el patrón de permeabilización deseada. Una vez que la plataforma se ha detenido, espere aproximadamente 30 segundos y retirar la solución del vector.Nota: permeabilización óptimo se produce cerca de una presión dinámica de 100 hasta 200 Pa a la salida de la boquilla, en función del diámetro capilar. </li><li> Lavar tres veces con PBS 1x. </li><li> Llenar bien con medios de cultivo fresco. </li><li> Repita los pasos 4.3 a 4.6 para el número deseado de experimentos. Nota: Asegúrese de incluir muestras de control que consisten en pozos están llenos de la solución vector sin el chorro de gas que se ejecute sobre ellos. Agregar la solución en los pocillos de control durante aproximadamente 1 min continúe en los pasos 4.5 y 4.6. </li><li> Si la ejecución de un experimento de transfección hrGFP, devuelva la placa de 6 pocillos a la incubadora durante 24 horas para permitir que el material transfectadas para ser transcrito por las células. Si al ejecutar un experimento de permeabilización dextrano, volver placa de 6 pocillos a la incubadora durante 15 min. </li></ol> 5. Imágenes de células <ol><li> Si lo desea, inmediatamente antes de la imagen, counterstain con mancha en vivo / muerto apropiado para evaluar la muerte celular. </li><li> Celdas de imagen con appropmicroscopio riate para investigar la eficacia de transfección / permeabilización. </li></ol>

<ol><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+humans--immunotherapy+of+patients+with+advanced+melanoma%2C+using+tumor-infiltrating+lymphocytes+modified+by+retroviral+gene+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into humans--immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction.</a> The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).</li>
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<li>Koch, S., Pohl, P., Cobet, U., Rainov, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+enhancement+of+liposome-mediated+cell+transfection+is+caused+by+cavitation+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects.</a> Ultrasound in Medicine & Biology. 26, 897-903 (2000).</li>
<li>Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cavitation+nuclei+significantly+enhance+acoustically+induced+cell+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection.</a> Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).</li>
<li>Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+gene+transfer+to+mammalian+somatic+cells+by+particle+bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).</li>
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<li>Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+inert+gas+jets+to+measure+the+forces+required+for+mechanical+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection.</a> Biomedical Engineering Online. 11, (2012).</li>
<li>Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+Pressure+Plasma+Jet+Deposition+of+Patterned+Polymer+Films+for+Cell+Culture+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Ieee+T.+Plasma+Sci%22%5BJournal%5D)">Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications.</a> Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+shear+devices+for+quantitative+analysis+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion.</a> Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).</li>
<li>Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsating+tandem+microbubble+for+localized+and+directional+single-cell+membrane+poration%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration.</a> Physical Review Letters. 105, 078101(2010).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Permeabilización chorro de gas inerte es una técnica útil para la transfección de células adherentes. Se proporciona la capacidad de transferir biomoléculas en células con el uso de fuerzas mecánicas, lo que elimina la necesidad de productos químicos potencialmente dañinos o vectores virales. La técnica podría potencialmente dar a los investigadores y los clínicos de una manera eficiente y relativamente sencillo para transfectar células con precisión. La selectividad de la permeabilización también es único permitiendo a...

Con la evolución de la biomedicina y la comprensión de la mecánica de células, la entrega de las biomoléculas en células se ha convertido en vital para muchos campos de investigación y las terapias médicas. Diferentes técnicas han sido desarrollados para introducir moléculas extrañas a través de la membrana plasmática y en el citosol de la célula. Estos se pueden clasificar en general ya sea como: técnicas viral, químicos o mecánicos. Técnicas virales pueden transfectar material genético, tales como ARN y ADN utilizando vectores virales 1. Técnicas virales tienden a tener altos rendimientos en ciertas líneas celulares, sin embargo tienen la posibilidad de reacciones inmunes e inflamatorias 2. Métodos de transfección química comunes incluyen precipitación con fosfato de calcio 3, exotoxinas bacterianas 4 y 5 lipofección. Estas técnicas han demostrado ser eficaces, sin embargo, ciertos problemas surgen tales como toxicidad celular y no especificidad. Además, las técnicas tales como Phosphat de calcioe precipitación se han encontrado para tener eficiencias de transfección de hasta 70%, pero sólo en ciertas líneas celulares, rara vez en las células primarias 6. Esto es de nota como el aumento de los esfuerzos de investigación se están poniendo en células primarias, especialmente en el caso de diseñar diversos tratamientos para el uso clínico y el estudio de funcionamiento de ADN. La interrupción temporal de la membrana celular a través de estímulos mecánica es una alternativa para la introducción de moléculas extrañas en las células. Las técnicas incluyen: la microinyección de moléculas 7, electroporación usando un campo eléctrico para romper la membrana 8,9, sonoporación utilizando ondas de ultrasonido para romper la membrana celular 10-12, bombardeo de partículas como se demuestra por la &quot;pistola de genes&quot;, que dispara partículas unidas con genes en la célula 13, y, más recientemente, la aplicación de la tensión de cizallamiento de fluido que se ha demostrado para permeabilizar temporalmente las células de mamífero 14,15. Aunque mecánicométodos cols evitar algunos de los problemas antes mencionados, por lo general son acompañados por una menor eficiencia y configuraciones muy complejas y especializadas. Una antorcha de descarga luminiscente a presión atmosférica (APGD-t) fue desarrollado en McGill con el objetivo inicial de la funcionalización de superficies y separar las células adherentes in vitro 16. Casualmente, se descubrió que una mancha en vivo / muerto se está utilizando de alguna manera se está tomada en por las células sin que se añade un agente de permeabilización. Además, este parecía haber ocurrido sólo en áreas restringidas de los pozos que sucedieron para que coincida con la ruta de la antorcha. Investigación de las capacidades de permeabilización de la APGD-t continuó y en los estudios de control, se encontró que el chorro de gas inerte portador del plasma sin excitación también fue capaz de permeabilizar las células. Esto contradecía la hipótesis inicial de que las especies reactivas creadas por el chorro de plasma alterado de forma temporal la función de la membrana, y sugirió que simplemente los mecánicosfuerzas de cal fueron suficientes para causar la permeabilización celular. A partir de aquí, se continuaron los estudios en nuestro laboratorio para tratar de cuantificar y caracterizar la eficiencia de la permeabilización de un chorro de gas inerte, así como cuidar a sus capacidades de transfección 16. A través de estos estudios, se ha encontrado que los microporos se puede hacer en forma de hecho en la membrana plasmática, y estos poros tienden a cerrar de nuevo dentro de aproximadamente 5 seg 15. Hemos demostrado la utilidad de la técnica in vitro e in vivo en la membrana corioalantoidea de un embrión de pollo.

<table><tbody><tr><td>Vitality hrGFPII-1</td><td>Agilent Technologies Canada</td><td>240143-57</td><td>Proteína fluorescente verde para experimentos de transfección en células HeLa</td></tr><tr><td>Dextrano, AlexaFluor 488; 10.000 MW, Aniónico, Fixable</td><td>Life Technologies Inc.</td><td>D22910</td><td>dextrano para experimentos de permeabilización VIVO/</td></tr><tr><td>MUERTO Kit de viabilidad/citotoxicidad Life</td><td>Technologies Inc.</td><td>L3224</td><td>para la contratinción de células de mamíferos</td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>para el montaje de portaobjetos al obtener imágenes</td></tr> de <tr><td>helio de ultra alta pureza</td><td>Praxair Canada Inc.</td><td>HE 5.0UH-T</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hyclone DMEM/ Medios con alto contenido de glucosa - 500 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30022.01</td><td>para células HeLa</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td>Para medios DMEM</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina, líquido</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Para medios DMEM</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x</td><td></td><td></td><td>Producido en laboratorio</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><fuerte>Tabla 1</fuerte>. Lista de reactivos requeridos</td></tr><tr><td>Microplacas tratadas con TC transparentes de 6 pocillos</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>#1 22 x 22 Cubreobjetos</td><td>Fisher</td><td>12-542B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>Información de tamaño WPI</td></tr><tr><td>ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Pedido #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Controlador Mass-Flo</td><td>MKS</td><td>M100B01314CS1BV</td><td>Controlador de flujo másico, serie M100B, requiere una fuente de alimentación externa de 12 V</td></tr><tr><td>USB-6009 DAQ Device</td><td>National Instruments</td><td>779026-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ensamblaje UniSlide con motor paso a paso y controlador</td><td>Velmex</td><td></td><td>Dos conjuntos UniSlide de la serie MA15, equipados con motores paso a paso Vexta de 1.8 grados proporcionados por Velmex, y controlados por un controlador de motor paso a paso VXM</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><fuerte>Tabla 2.</fuerte> Lista de equipos necesarios</td></tr></tbody></table>

permeabilización de células adheridas usando un gas inerte jet

Permeabilization of Adhered Cells Using an Inert Gas Jet

Existen diversas técnicas de transfección de células y éstas se pueden dividir tres grandes categorías: viral, químicas y mecánicas. Este protocolo describe un método mecánico para permeabilizar temporalmente las células adherentes utilizando un chorro de gas inerte que puede facilitar la transferencia de macromoléculas normalmente no permeables a las células. Creemos que esta técnica funciona impartiendo fuerzas de cizallamiento en la membrana plasmática de las células adherentes, resultando en la formación temporal de microporos. Una vez que se crean estos poros, las células son entonces permeable al material genético y otras biomoléculas. Las fuerzas mecánicas que intervienen no corren el riesgo de dañar permanentemente las células o se separe de su sustrato. No es, por lo tanto, una estrecha gama de dinámica de gases inertes donde la técnica es eficaz. Un chorro de gas inerte se ha demostrado su eficacia en la permeabilización de diversas líneas de células adherentes, incluidos HeLa, HEK293 y células endoteliales de aorta abdominal humanos. Este protocolo es apropiado para el permeabilization de células adherentes, tanto in vitro y, como hemos demostrado, in vivo, demostrando que puede ser utilizado para la investigación y, potencialmente, en futuras aplicaciones clínicas. También tiene la ventaja de permeabilización de las células de una manera espacialmente restrictiva, lo que podría llegar a ser una valiosa herramienta de investigación.

La permeabilización de las células HeLa con 10 kDa de dextrano fluorescente verde usando un chorro de gas helio con un capilar de diámetro interior 0,86 mm se muestra en la Figura 1. Las células fueron counterstained inmediatamente después de la permeabilización con 2 l / ml EthD-1 solución (LIVE / DEAD viabilidad / citotoxicidad Kit) para visualizar la muerte celular. Inmediatamente después de la contratinción, cubreobjetos fueron montados y la imagen. Esta figura muestra los resultados de ejecutar el ...

Este protocolo describe un método para la permeabilización temporal de células adherentes utilizando un chorro de gas inerte. Esta técnica facilita la transferencia de material genético y biomoléculas en células de mamífero adherentes por la utilización de fuerzas mecánicas para romper la membrana de plasma.

Permeabilización de células adheridas Usando un gas inerte Jet

Various cell transfection techniques exist and these can be broken down to three broad categories: viral, chemical and mechanical. This protocol describes ...

El objetivo general de este procedimiento es permeabilizar células adherentes. Esto se logra primero cultivando las células experimentales sobre laminillas en placas de seis pocillos. El segundo paso consiste en enjuagar las células con 1X PBS y cubrirlas con la solución que contiene la biomolécula que se transferirá a la célula.A continuación, se pasa una corriente de gas inerte. La muestra atraviesa las células. El paso final consiste en fijar y teñir las células si se desea.En última instancia, la microscopía de inmunofluorescencia se utiliza para mostrar la eficiencia de permeación y la viabilidad celular. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la proliferación o las biobalísticas, es que esta técnica es fácil de implementar y permite la permeación espacialmente restringida de células adherentes. En un cultivo, por lo general, las personas nuevas en esta técnica pueden tener dificultades porque podría llevar tiempo perfeccionar ciertos parámetros, como la velocidad del flujo de gas o el diámetro del capilar, para lograr una permeación eficiente en sus aplicaciones particulares.El controlador de flujo másico utilizado en este procedimiento requiere una fuente de alimentación externa de 12 vol y se conecta a una línea de gas helio para garantizar un caudal de gas preciso. La interconexión entre el controlador de flujo másico y el ordenador se realiza mediante un dispositivo de adquisición de datos. Esta unidad se controla mediante un voltaje de entrada que varía entre cero y cinco voltios. Un bucle de control en el programa de LabVIEW determina el voltaje necesario en cada momento.Dos diapositivas lineales de posicionamiento se utilizan para controlar el movimiento de la placa de seis pocillos, una para cada dirección. Cada conjunto consiste en un ensamblaje de diapositiva lineal MA 15 series Velm X uni acoplado con un motor paso a paso, y ambos ensamblajes son controlados por un único controlador de motor paso a paso VELM XVXM. El controlador permite el desplazamiento manual de cada motor o acepta una serie de comandos seriales externos.La combinación de los cuales permite patrones de movimiento específicos. Varios patrones pueden programarse en el programa de vista de laboratorio, requiriendo que el usuario proporcione únicamente la velocidad deseada de la antorcha, así como las dimensiones del recorrido. Comience la preparación del equipo abriendo tanto el cilindro de helio como el regulador, y encienda el controlador del motor.Abra el programa de vista del laboratorio y verifique todas las condiciones. A continuación, asegúrese de que la plataforma esté centrada para comprobarlo. Observe cada etapa del motor y verifique que cada carro no esté cerca de ninguno de los extremos de la etapa, y luego haga que el programa centre los carros.Si esta es la primera sesión del día, se recomienda ejecutar el programa una vez sin células para asegurarse de que la configuración funcione correctamente. Para preparar la altura de la boquilla capilar del gas Jett, retire el capilar del soporte y ajuste a cero el dial de altura. Coloque la placa de seis pocillos sobre la plataforma.Sustituya la capilar del chorro de gas y bájela hasta el fondo del pocillo hasta que toque el cubreobjetos. Sujete la capilar en el soporte utilizando el dial de altura. Eleve la capilar tres milímetros y marque esta altura en la base de la capilar.Por último, eleve el capilar a una altura segura y luego retire la placa de seis pocillos. La línea celular adherente para este protocolo debe cultivarse hasta confluencia sobre cubreobjetos de vidrio en una placa de seis pocillos utilizando técnicas de cultivo estándar para células helo. Siembre seis placas de seis pocillos con dos veces 10 a la quinta células por pocillo e incube durante 48 horas antes del tratamiento.En el día del tratamiento, prepare un volumen adecuado de solución que contenga el vector deseado. Para estudios con dextrina, se recomienda 80 microgramos por mililitro de dextrina verde fluorescente de 10 kilodalton, en cuarto lugar. Esta solución se denominará solución de vector.Retire el medio de cultivo celular de un pocillo y enjuague tres veces con un pipeta de XPBS 1.370 microlitros de solución vectorial en el pocillo. Esto debería resultar en una profundidad de líquido de aproximadamente 1,3 milímetros. Coloque el pocillo que contiene la solución vectorial en el centro de la plataforma.Baje la boquilla del chorro de gas al nivel previamente marcado, que indica una altura de tres milímetros por encima del portaobjetos. Establezca el caudal de helio en el programa de vista de laboratorio y seleccione el patrón de movimiento deseado que se utilizará. Seleccione ejecutar.Cuando esté listo para comenzar el protocolo de permeación, habrá un período inicial de latencia durante el cual el controlador de flujo másico se prepara para proporcionar el caudal necesario. Para el éxito de este protocolo, es importante optimizar las condiciones de flujo para minimizar la profundidad celular y la desprendimiento celular. Una vez alcanzado el caudal adecuado, el programa LabVIEW activará los motores paso a paso para mover el pocillo según el patrón de permeación deseado. Una vez que la plataforma se haya detenido, retire la placa de seis pocillos de la plataforma.Espere aproximadamente 30 segundos y luego retire la solución vectorial. Lave el pocillo tres veces con PBS. Tras el tercer lavado, llene el pocillo con medio de cultivo fresco.Repita el protocolo de permeación para el número deseado de experimentos. Asegúrese de incluir muestras de control que consistan en pozos llenados con la solución vectorial sin que el chorro de gas pase sobre ellos. Deje la solución en los pozos de control aproximadamente un minuto antes de retirar la solución.Lave las células con PBS y llene el pocillo con medio de cultivo fresco. Devuelva la placa de seis pocillos al incubador; en el caso de la incubación con permeación de dextrina, incube durante 15 minutos. Posteriormente, obtenga imágenes de las células con el microscopio adecuado para investigar la eficacia permeable.Se muestran aquí los resultados de la permeabilidad de células HELO con dextrina verde fluorescente de 10 kilodalton utilizando un chorro de gas helio con un diámetro interno de 0,86 milímetros. Los paneles capilares A, B y C muestran los resultados de ejecutar el chorro de gas helio a tres presiones de salida diferentes, y el panel D es un control al que se agregó dextrina, pero sin exposición al chorro de gas helio; las células se tincionaron como control inmediatamente después de la permeabilización para visualizar la muerte celular. En estas imágenes, la dextrina fluoresce en color verde y las células muertas fluorescen en rojo.Se observó en los paneles A y B que el ancho y la eficiencia de la trayectoria de permeación aumentaron con una presión dinámica más alta, con solo un ligero incremento en la muerte celular. Sin embargo, una vez que se alcanzó una presión dinámica alta, como se observó en el panel C, las células HeLa fueron arrancadas de las laminillas y ocurrió muy poca permeación periférica, según estudios mediante microscopía electrónica de barrido. Se observaron microporos en la membrana celular.En este ejemplo, se realizó la permeación de células HeLa utilizando un chorro de gas helio con una capilaridad de 0,86 milímetros de diámetro interno y una presión de salida de 300 pascales. Se adquirieron imágenes de microscopía electrónica de barrido con un aumento de 50 000 ×. El panel A muestra una muestra control que exhibe una superficie celular lisa, mientras que el panel B muestra la superficie de una célula permeabilizada que exhibe un poro con un diámetro de 84 nanómetros. Una vez dominada, esta técnica debería tardar entre 15 y 30 minutos si se realiza correctamente. Tras el procedimiento, se pueden realizar tinciones para evaluar factores adicionales, como la viabilidad celular.

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JoVE Journal

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